張麗娜， 張迪迪， 趙 雷， 顧宇軒， 孫霄麟

(北京工業(yè)大學 環(huán)境與生命學部 生命科學與化學學院，北京 100124)

乳腺癌是一種對全球婦女健康威脅最大的腫瘤，尤其在我國女性乳腺癌的發(fā)病率和死亡率呈顯著增長趨勢。目前認為乳腺癌的浸潤和轉移是導致乳腺癌患者死亡的主要原因，但關于乳腺癌轉移的分子機制仍然不太清楚。上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)被認為是腫瘤轉移的首要步驟[1]。近年來，細胞融合理論逐漸成為腫瘤轉移的研究熱點之一[2]。間充質干細胞和巨噬細胞是目前細胞融合研究經常選用的兩種細胞類型，也被作為探索腫瘤生物治療的靶向載體。多數(shù)研究已證實間充質干細胞可與腫瘤細胞融合，參與腫瘤的發(fā)生轉移[3-7]。一些研究也表明巨噬細胞能同腫瘤細胞發(fā)生融合，促進腫瘤的發(fā)生轉移[8-10]。因此，細胞融合被認為是腫瘤轉移的一種新機制[11-12]。但目前關于細胞融合與腫瘤轉移之間的關系及對其關鍵的分子調控機制仍不太清楚，這也阻礙了細胞融合在腫瘤臨床治療中的應用。

研究表明多條信號通路參與調控EMT過程[13]，其中與腫瘤細胞增殖轉移密切相關的PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路也參與EMT調控，這兩條信號通路的異常活化與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關[14]。我們前期已經成功建立了小鼠乳腺癌細胞與巨噬細胞融合模型，結果表明融合細胞的惡性增殖和遷移侵襲能力明顯增強，融合細胞獲得了腫瘤細胞無限增殖和巨噬細胞易于遷移的特性，而且可能是通過激活Wnt/β-catenin信號通路誘導EMT促進乳腺癌增殖轉移[9]。先前研究發(fā)現(xiàn)來源于乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞融合形成的雜交細胞表現(xiàn)出不同的RAF-AKT信號通路之間的交叉對話[15]，巨噬細胞與乳腺癌細胞融合是否也會影響PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路介導EMT促進乳腺癌增殖轉移并不清楚。

為解決上述問題，本研究結合前期建立的融合細胞模型和所取得的實驗結果，重點探索乳腺癌細胞與巨噬細胞融合對腫瘤增殖轉移密切相關的PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路的影響，揭示乳腺癌細胞與巨噬細胞融合是否可以通過這兩條信號通路介導EMT從而促進乳腺癌增殖轉移，以期為闡明細胞融合在腫瘤轉移中的分子機制提供新的視角和思路，也為干預細胞融合在腫瘤轉移治療中的應用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

采用自建的小鼠乳腺癌細胞-巨噬細胞融合模型(N2O2-RAW264.7)，融合細胞的具體構建方法詳見本課題組前期發(fā)表論文[9]。其中小鼠乳腺癌細胞N2O2來自Dr. Joseph Lustgarten (Sidney Kimmel Cancer Center, San Diego, CA)實驗室饋贈。

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、PBS、100×青霉素-鏈霉素雙抗和0.25% Trypsin-EDTA均為美國Hyclone公司產品；RIPA細胞裂解液、CCK-8細胞增殖檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、4×SDS蛋白上樣緩沖液、PMSF、脫脂奶粉、4%多聚甲醛和SDS-PAGE凝膠配制試劑均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；PVDF膜、ECL化學發(fā)光底物、Transwell穿透小室(24孔)為美國Millipore公司產品；Matrigel膠購自美國BD公司；結晶紫和DMSO購自美國Amresco公司；LY294002和PD98059抑制劑、β-actin、PI3K、p-PI3K(Tyr458)、AKT、p-AKT(Ser473)、ERK1/2和p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)一抗均購自美國CST公司；HRP標記的山羊抗兔和抗鼠IgG二抗是美國ABGENT公司產品。其他化學試劑均為國產試劑。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

乳腺癌細胞和融合細胞置于含10%FBS和1×青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞生長至90%密度，用0.25% Trypsin-EDTA消化傳代，放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞實驗。LY294002和PD98059信號通路阻斷劑用DMSO溶解，分別采用10 μmol/L終濃度處理細胞。

1.2.2 Western Blot實驗

用0.25%胰酶消化細胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min于4 ℃離心30 min，取上清液轉至1.5 mL EP管，用BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度。然后加入4×SDS上樣緩沖液，沸水浴煮10 min變性蛋白。配制10%聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣40 μg總蛋白，100 V恒壓電泳2 h，90 V恒壓轉膜1 h，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。然后分別加入PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2(1∶1 000稀釋)和β-actin(1∶5 000稀釋)，4℃孵育過夜。第2天回收一抗，TBST洗膜3次，然后加入HRP標記二抗(1∶6 000稀釋)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次。最后加入ECL化學發(fā)光底物，利用Tanon 4200化學發(fā)光成像系統(tǒng)掃描圖像。β-actin作為內參，每個Western Blot結果至少重復3次，選擇代表性結果展示。

1.2.3 CCK-8細胞增殖實驗

0.25%胰酶消化細胞并計數(shù)，96孔板每孔接種1×103個細胞，每組設4個復孔。分別培養(yǎng)24、48、72、96和120 h后，每孔更換100 μL新鮮培養(yǎng)基(同時設置只加培養(yǎng)基的空白對照)，然后每孔加10 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育1 h，用Bio-Tek酶標儀測定450 nm處吸光度。以培養(yǎng)時間為橫坐標，450 nm處吸光度(OD450實驗組-OD450空白對照)為縱坐標，繪制連續(xù)5 d的生長曲線。

1.2.4 細胞劃痕實驗

0.25%胰酶消化細胞接種至12孔板，待細胞貼壁匯合至80%密度時，用200 μL黃槍頭在孔中央劃一道橫線，PBS清洗去掉脫落的細胞，更換為含5% FBS的DMEM培養(yǎng)基。分別在0、12和24 h通過倒置顯微鏡拍照記錄細胞劃痕變化，并計算細胞相對遷移率。

1.2.5 Transwell細胞遷移和侵襲實驗

0.25%胰酶消化細胞并計數(shù)，遷移實驗時，將細胞重懸于無血清DMEM培養(yǎng)基，以每孔5×104個細胞密度接種于24孔Transwell穿透小室。侵襲實驗是預先在24孔Transwell小室鋪Matrigel膠，每孔接種5×105個細胞。然后在24孔板加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃孵育24 h后，用棉簽刮掉小室內細胞，4%多聚甲醛固定，0.5%結晶紫染色，最后通過Olympus IX71倒置顯微鏡觀察拍照。隨機選取5個視野統(tǒng)計穿透膜的細胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果與分析

2.1 乳腺癌細胞與巨噬細胞融合對PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路的影響

為了確定乳腺癌細胞與巨噬細胞融合對PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路的影響，首先通過Western Blot實驗檢測這兩條信號通路中關鍵標志蛋白的表達變化。結果表明，與對照組乳腺癌細胞相比，融合細胞中磷酸化的p-PI3K、p-AKT和p-ERK1/2表達水平顯著升高，而非磷酸化的總PI3K、AKT和ERK1/2蛋白的表達則沒有明顯變化(圖1)。該結果說明乳腺癌細胞與巨噬細胞融合可能會激活PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路，從而促進乳腺癌增殖轉移。

圖1 乳腺癌細胞與巨噬細胞融合對增殖轉移相關的PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路關鍵蛋白的影響Figure 1 Effects of fusion between breast cancer cells and macrophages on the key proteins of PI3K/AKT and MAPK/ERK signaling pathways related to proliferation and metastasis

2.2 抑制劑阻斷融合細胞中PI3K/AKT和MAPK/ERK通路效果檢測

檢測LY294002和PD98059特異性抑制劑處理對融合細胞中PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路的阻斷效果。Western Blot實驗結果表明，LY294002和PD98059抑制劑處理導致融合細胞中磷酸化的p-AKT和p-ERK1/2表達水平顯著降低，而未磷酸化的AKT和ERK1/2表達則沒有明顯變化(圖2)。該結果也進一步說明融合細胞中的PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路是處于被激活的狀態(tài)。

圖2 LY294002和PD98059抑制劑處理對融合細胞中PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路的影響Figure 2 Effects of LY294002 and PD98059 inhibitor treatment on PI3K/AKT and MAPK/ERK signaling pathways in the fused cells,respectively

2.3 抑制劑對融合細胞增殖的影響

通過CCK-8實驗分析LY294002和PD98059抑制劑阻斷PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路后細胞的增殖能力變化。從圖3(a)和(b)中可以看出，對照乳腺癌N2O2細胞組在450 nm處的吸光值明顯低于融合細胞組，說明融合細胞的增殖能力顯著強于對照乳腺癌細胞，LY294002和PD98059抑制劑處理導致對照乳腺癌細胞和融合細胞的增殖能力均受到抑制，尤其對融合細胞的抑制效果更明顯。

(a)對照乳腺癌細胞CCK-8實驗結果；(b)融合細胞CCK-8實驗結果。* P<0.05; ** P<0.01。圖3 CCK-8實驗分析抑制PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路對細胞增殖能力的影響Figure 3 Effects of inhibition of PI3K/AKT and MAPK/ERK signaling pathways on the cell proliferation ability by CCK-8 assay

2.4 抑制劑對融合細胞遷移能力的影響

通過劃痕損傷實驗分析LY294002和PD98059抑制劑處理后融合細胞的遷移能力變化。結果表明與未經抑制劑處理組相比，LY294002和PD98059抑制劑處理12 h和24 h組融合細胞的劃痕明顯愈合較慢，劃痕也較寬一些[圖4(a)]。通過定量分析發(fā)現(xiàn)LY294002和PD98059抑制劑處理組細胞的相對遷移率明顯低于未處理對照組，抑制劑處理導致融合細胞的遷移顯著受阻[圖4(b)]。

此外，進一步通過Transwell實驗分析LY294002和PD98059抑制劑處理后融合細胞的遷移能力變化，發(fā)現(xiàn)阻斷PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路后，融合細胞的遷移能力顯著被抑制[圖5(a)和(b)]。

2.5 抑制劑對融合細胞侵襲能力的影響

通過Transwell侵襲實驗分析LY294002和PD98059抑制劑處理后融合細胞的侵襲能力變化。結果如圖6(a)和(b)所示，LY294002和PD98059抑制劑處理阻斷PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路后，融合細胞的侵襲能力也明顯被抑制。

(a)細胞劃痕損傷實驗結果(標尺：100 μm)；(b)細胞遷移能力的相對定量統(tǒng)計分析。* P<0.05; ** P<0.01。圖4 劃痕損傷實驗分析抑制PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路對融合細胞遷移能力的影響Figure 4 Effects of inhibition PI3K/AKT and MAPK/ERK signaling pathways on the migration ability of the fused cells by wound healing assay

(a)Transwell遷移實驗結果(×200)；(b)Transwell遷移實驗結果的定量統(tǒng)計分析(隨機選取5個視野統(tǒng)計分析)。** P<0.01。圖5 Transwell實驗分析抑制PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路對融合細胞遷移能力的影響Figure 5 Effects of inhibition PI3K/AKT and MAPK/ERK signaling pathways on the migration ability of the fused cells by Transwell migration assay

(a)Transwell侵襲實驗結果(×200)；(b)Transwell侵襲實驗結果的定量統(tǒng)計分析(隨機選取5個視野統(tǒng)計分析)。* P<0.05； ** P<0.01。圖6 Transwell實驗分析抑制PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路對融合細胞侵襲能力的影響Figure 6 Effects of inhibition PI3K/AKT and MAPK/ERK signaling pathways on the migration ability of the fused cells by Transwell invasion assay

3 討論與結論

細胞融合是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的一種常見現(xiàn)象，研究表明腫瘤細胞同其他正常細胞形成的融合細胞往往表現(xiàn)出比親代腫瘤細胞更惡性的特征，包括形成異倍體，增殖轉移能力增強，獲得耐藥性及干細胞樣特性等[2,16-19]。腫瘤細胞融合理論目前也被認為是腫瘤轉移的一種新機制[11-12,20]。通過對腫瘤細胞與間充質干細胞融合研究發(fā)現(xiàn)，不同的腫瘤細胞與間充質干細胞融合對腫瘤的生長轉移存在一定爭議。多數(shù)研究認為間充質干細胞融合促進腫瘤生長轉移[4,16,21]；還有一些研究認為間充質干細胞融合抑制腫瘤生長轉移[22-23]。巨噬細胞作為腫瘤微環(huán)境中重要的免疫細胞，也是細胞融合研究經常選用的細胞類型。我們前期通過建立小鼠乳腺癌細胞與巨噬細胞融合模型研究發(fā)現(xiàn)融合細胞的惡性增殖和遷移侵襲能力明顯增強，巨噬細胞融合會促進乳腺癌增殖轉移[9]。

研究表明腫瘤細胞與間充質干細胞融合是通過誘導EMT促進腫瘤轉移[24-25]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞與巨噬細胞融合也會誘發(fā)EMT促進乳腺癌增殖轉移[9]。經典的TGF-β、Wnt/β-catenin、Notch等信號通路均被證實參與EMT調控[13]。此外，與增殖轉移密切相關的PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路也與EMT調控相關[26-27]。EMT相關信號通路的異?；罨瘎t促進腫瘤發(fā)生轉移。已有研究表明細胞融合可通過不同的信號通路調控腫瘤發(fā)生轉移。Ozel等[15]發(fā)現(xiàn)乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞融合形成的雜交細胞表現(xiàn)出RAF-AKT信號通路的交叉對話。Fu等[28]發(fā)現(xiàn)巨噬細胞可通過分泌IL-8激活JAK2/STAT3/Snail信號通路，從而誘導肝癌細胞發(fā)生EMT促進肝癌轉移。我們前期結果表明乳腺癌細胞與巨噬細胞融合是通過激活Wnt/β-catenin信號通路誘發(fā)EMT促進乳腺癌增殖轉移[9]。

本研究重點分析乳腺癌細胞與巨噬細胞融合對增殖轉移密切相關的PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路的影響。結果表明：與對照乳腺癌細胞相比，融合細胞中這兩條通路的標志蛋白即磷酸化的p-PI3K、p-AKT和p-ERK1/2表達水平顯著升高，而總PI3K、AKT和ERK1/2表達沒有變化；LY294002和PD98059抑制劑阻斷PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路后，融合細胞中p-AKT和p-ERK1/2表達明顯降低，而且融合細胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著被抑制。結果初步表明乳腺癌細胞與巨噬細胞融合可能通過激活PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路誘導EMT從而促進乳腺癌增殖轉移。

在本研究基礎上，再結合前期研究結果，進一步提示乳腺癌細胞與巨噬細胞融合可能會通過激活多條EMT相關的信號通路誘導EMT從而促進乳腺癌增殖轉移。由此推斷，調控細胞融合與腫瘤轉移的信號通路是復雜多樣的，細胞融合可能會導致多條EMT相關信號通路的改變協(xié)同調控腫瘤的發(fā)生轉移。因此，關于細胞融合、信號通路調控與腫瘤發(fā)生轉移之間的具體作用機制仍有待深入研究。