尹霜霜，李 雋

（湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬第一醫(yī)院口腔科，株洲 412000）

牙髓炎是臨床常見疾病之一，其主要是由于牙齒齲壞引起的一種炎癥反應(yīng)，牙髓中革蘭陰性菌可釋放脂多糖（LPS）等多種毒性產(chǎn)物從而影響牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)功能[1]。牙髓干細(xì)胞具有高度自我更新能力及多向分化能力，并可在牙髓自我修復(fù)過程中分化為牙本質(zhì)細(xì)胞[2]。牙齒齲壞可影響牙髓細(xì)胞的生物學(xué)功能，而牙髓干細(xì)胞在牙體再生過程中發(fā)揮重要作用[3-4]。目前關(guān)于影響人牙髓干細(xì)胞增殖、分化能力的基因研究相對較少，因而本研究從分子水平探究基因?qū)θ搜浪韪杉?xì)胞增殖、成脂分化能力的影響及其調(diào)控機(jī)制。研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）可調(diào)控人牙髓干細(xì)胞增殖、成脂分化過程[5]。相關(guān)報(bào)道指出，HOXC10 是同源異型盒基因（homeobox genes，HOX）的家族成員，HOXC10 可促進(jìn)綿羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖并減少脂質(zhì)積累[6]。但HOXC10對體外人牙髓干細(xì)胞增殖和成脂分化的調(diào)控作用尚未闡明。因此，本研究主要探討HOXC10 在成脂誘導(dǎo)后人牙髓干細(xì)胞中的表達(dá)狀態(tài)，探究其對人牙髓干細(xì)胞增殖及成脂分化的影響及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco；Dispase酶與Ⅰ型膠原酶購自美國Sigma；Lipofectamine2000 購自美國Invitrogen；si-HOXC10、si-con購自蘇州吉瑪生物；Trizol試劑購自美國Ambion；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量PCR 試劑盒購自北京TaKaRa；成脂誘導(dǎo)液購自美國Gibco；Transwell 小室購自美國Corning；MTT購自上海晶抗生物；兔抗人HOXC10抗體購自美國Abcam公司；兔抗人PPARγ、C/EBP-α抗體購自上海鈺博生物；兔抗人GSK3β、β-catenin 抗體購自美國Cell Signaling Technology；二抗購自武漢博士德生物。牙體組織來源：收集20例本院口腔科拔除的智齒或因正畸拔牙，選取無牙體及牙周組織疾病的牙體組織，將牙體組織置于含有青霉素與鏈霉素雙抗的培養(yǎng)基中，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情且簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1 人牙髓干細(xì)胞分離培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 人牙髓干細(xì)胞分離培養(yǎng)：取出凍存牙體組織，PBS 清洗，使用無菌骨鑿、鼓錘沿著牙體長軸縱行避開牙體，取出牙髓組織，剪去根尖，置于無菌離心管內(nèi)（15 mL），采用PBS沖洗，剪碎牙髓組織（1 mm3），4 ℃條件下經(jīng)600 r/min離心3 min，棄上清，加入Ⅰ型膠原酶液與Dispase 酶液，37 ℃消化15 min，加入含有胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，4 ℃條件下經(jīng)600 r/min離心3 min，棄上清，平鋪于培養(yǎng)皿底部，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%融合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)[7]。取生長狀態(tài)良好的第三代細(xì)胞，待細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，加入胰蛋白酶消化，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，接種于96 孔板（100 μL/孔），分別將si-HOXC10、si-con轉(zhuǎn)染至人牙髓干細(xì)胞，分別記作si-HOXC10 組、si-con 組，同時(shí)將未經(jīng)轉(zhuǎn)染的人牙髓干細(xì)胞記作NC組。轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine2000試劑說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 細(xì)胞成脂誘導(dǎo) 采用PBS 緩沖液洗滌轉(zhuǎn)染24 h 后的人牙髓干細(xì)胞，加入0.125%胰蛋白酶消化，加入1 mL含有15%胎牛血清的培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度后接種于24孔板（6×104個(gè)/孔），置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，使用含有青霉素與鏈霉素雙抗的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，棄PBS，每孔加入0.8 mL 成脂誘導(dǎo)液，每隔3 d 更換一次成脂誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)21 d。

1.2.3 qPCR 檢測細(xì)胞中HOXC10、PPARγ、C/EBPα mRNA 的表達(dá)水平 收集誘導(dǎo)前、成脂誘導(dǎo)后及轉(zhuǎn)染后各組人牙髓干細(xì)胞，采用Trizol 法提取細(xì)胞中的總RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作將總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系：RNA 2 μL，10×RT Buffer 2 μL，dNTP 0.4 μL，Multiscripe RT 1 μL，10×Random Primer 2 μL，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至20 μL；反應(yīng)條件：25 ℃10 min，37 ℃60 min，95 ℃5 min，4 ℃保存。HOXC10 正向引物5’-ACAGACCTCAATCGCTCAGGA-3’，反向引物5’-AGGGGTAAATCTGGATACTGGC-3’；PPARγ 正向引物5’-CTGCGTCCCCGCCTTATTAT-3’，反向引物5’-GGCATTGTGAGACATCCCA-3’；C/EBP-α正向引物5’-TCACTTGCAGTTCCAGATCG-3’，反向引物5’-TTGACCAAGGAGCTCTCAGG-3’；β-actin正向引物5’-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3’，反向引物5’-TGATGTCACGCACGATTT-3’。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，qRT-PCR反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，Real-Time Master Mix 10 μL，正反向引物各1 μL，RNase-Free ddH2O 補(bǔ)足體系至20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃2 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，72 ℃30 s（循環(huán)40次），HOXC10、PPARγ、C/EBP-α均以βactin 為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算HOXC10、PPARγ、C/EBP-α mRNA相對表達(dá)量。

1.2.4 MTT 檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)期人牙髓干細(xì)胞每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96 孔板，按照“1.2.1”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)分組處理后，分別于成脂誘導(dǎo)1 d、3 d、5 d 時(shí)每孔加入MTT 試劑20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心后棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測OD。

1.2.5 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 收集各組人牙髓干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×104個(gè)/mL，向Tranwell 小室的下室加入600 μL 培養(yǎng)液，取100 μL 人牙髓干細(xì)胞加入Tranwell 小室的上室，Tranwell小室插入培養(yǎng)液中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取出Tranwell 小室，吸干上室液體，轉(zhuǎn)移至含有800 μL 甲醇中，使用甲醇固定遷移到Tranwell 小室下層的細(xì)胞，固定15 min，流水沖洗，應(yīng)用顯微鏡觀察遷移到膜下層的細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞遷移數(shù)。

1.2.6 酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞黏附能力 采用PBS 按照（1∶8）比例稀釋Ⅰ型膠原（50 mg/L），按照每孔50 μL 加入96 孔板，4 ℃條件下孵育24 h，吸出Ⅰ型膠原，PBS 洗滌，加入含有1%牛血清白蛋白，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，每孔加入含有100 μL 轉(zhuǎn)染后的人牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min，細(xì)胞饑餓處理24 h，收集細(xì)胞置于無菌離心管內(nèi)，4 ℃條件下經(jīng)1 000 r/min 離心5 min，棄舊培養(yǎng)液，加入不含血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞接種于96 孔板（5×104個(gè)/孔），每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)90 min，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，PBS洗滌，采用4%多聚甲醛固定5 min，PBS 洗滌，加入0.5%甲苯胺藍(lán)染色5 min，蒸餾水洗滌，加入100 μL醋酸（33%），勻速振蕩15 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔在595 nm 波長處的吸光度值（OD 值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 Western blotting 檢 測HOXC10、PPARγ、C/EBP-α、WNT 通路相關(guān)蛋白GSK3β、β-catenin 的蛋白表達(dá) RIPA 蛋白裂解液提取各組人牙髓干細(xì)胞總蛋白，蛋白樣品中加入5×SDS 上樣緩沖液，沸水煮10 min，蛋白變性。取50 μg 蛋白樣品進(jìn)行10%SDS-PAGE 分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入HOXC10（1∶1 000）、PPARγ（1∶800）、C/EBP-α（1∶800）、GSK3β（1∶800）、β-catenin（1∶1 000）與內(nèi)參β-actin（1∶1 000）一抗稀釋液，4 ℃條件下孵育過夜，TBST洗膜，加入二抗稀釋液（1:5 000），滴加ECL，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用Quantityone軟件檢測條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人牙髓干細(xì)胞誘導(dǎo)成脂分化過程中HOXC10基因表達(dá)

與成脂誘導(dǎo)前相比，成脂分化誘導(dǎo)后人牙髓干細(xì)胞中HOXC10 mRNA 及蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），PPARγ、C/EBP-α 的表達(dá)水平顯著降低（均P＜0.05），見圖1、表1。

表1 成脂分化誘導(dǎo)液對人牙髓干細(xì)胞成脂分化過程中HOXC10 mRNA、HOXC10mRNA、PPARγ和C/EBP-α mRNA表達(dá) ，n=9

表1 成脂分化誘導(dǎo)液對人牙髓干細(xì)胞成脂分化過程中HOXC10 mRNA、HOXC10mRNA、PPARγ和C/EBP-α mRNA表達(dá) ，n=9

圖1 人牙髓干細(xì)胞誘導(dǎo)成脂分化過程中HOXC10、PPARγ和C/EBP-α蛋白表達(dá)

2.2 沉默HOXC10對人牙髓干細(xì)胞活性的影響

與si-con 組相比，si-HOXC10 組人牙髓干細(xì)胞活性顯著降低（P＜0.05），見圖2、表2。

圖2 沉默HOXC10后人牙髓干細(xì)胞中HOXC10蛋白表達(dá)

表2 沉默HOXC10對人牙髓干細(xì)胞活性的影響 ，n=9

表2 沉默HOXC10對人牙髓干細(xì)胞活性的影響 ，n=9

與si-con組相比較，*P＜0.05。

2.3 沉默HOXC10 對人牙髓干細(xì)胞遷移和細(xì)胞黏附的影響

相較于si-con 組，si-HOXC10 組人牙髓干細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)顯著增多（P＜0.05），細(xì)胞黏附能力顯著升高（P＜0.05），見表3。

表3 沉默HOXC10 對人牙髓干細(xì)胞對遷移和細(xì)胞黏附能力的影響 ，n=9

表3 沉默HOXC10 對人牙髓干細(xì)胞對遷移和細(xì)胞黏附能力的影響 ，n=9

與si-con組相比較，*P＜0.05。

2.4 沉默HOXC10 對人牙髓干細(xì)胞對成脂分化的影響

與si-con 組相比，si-HOXC10 組人牙髓干細(xì)胞中PPARγ、C/EBP-α 的表達(dá)水平顯著降低（均P＜0.05），見圖3。

圖3 沉默HOXC10 對人牙髓干細(xì)胞中PPARγ 和C/EBP-α蛋白表達(dá)的影響

2.5 沉默HOXC10對人牙髓干細(xì)胞WNT通路的影響

與si-con 組相比，si-HOXC10 組人牙髓干細(xì)胞WNT 通路中GSK3β 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），β-catenin蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見圖4。

圖4 沉默HOXC10對人牙髓干細(xì)胞WNT通路GSK3β 和βcatenin蛋白的影響

3 討論

人牙髓干細(xì)胞具有多向分化的能力，在一定條件下可增殖分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞，LPS 可通過激活單核巨噬細(xì)胞而誘導(dǎo)牙髓系統(tǒng)中的細(xì)胞釋放炎癥因子從而引起宿主的炎癥反應(yīng)，研究表明A20 基因沉默可抑制人牙髓干細(xì)胞增殖及分化能力[8-10]。但仍有多種基因可參與人牙髓干細(xì)胞增殖及分化過程，因而本研究探尋新型基因并分析其對人牙髓干細(xì)胞增殖及分化的影響。

HOXC10 與其天然反義轉(zhuǎn)錄物L(fēng)ncRNA HOXC-AS3 相互作用可調(diào)節(jié)間質(zhì)/基質(zhì)細(xì)胞的成骨作用[11]。HOXC10可抑制間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化潛能[12]。相關(guān)報(bào)道指出，HOXC10 可作為區(qū)分羊膜和蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的潛在標(biāo)志物[13]。以上研究結(jié)果提示，HOXC10 在細(xì)胞成骨分化過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示，成脂誘導(dǎo)后人牙髓干細(xì)胞中HOXC10的表達(dá)水平顯著降低，成脂相關(guān)蛋白PPARγ、C/EBP-α 的表達(dá)量顯著降低，提示HOXC10 表達(dá)量降低可能參與人牙髓干細(xì)胞成脂分化過程。本研究結(jié)果顯示，沉默HOXC10后人牙髓干細(xì)胞增殖活力顯著降低，提示沉默HOXC10可抑制人牙髓干細(xì)胞增殖。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，沉默HOXC10 后人牙髓干細(xì)胞遷移能力與細(xì)胞吸附能力明顯增強(qiáng)，提示沉默HOXC10可促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞遷移及增強(qiáng)吸附能力。研究表明，成脂分化主要是指脂肪組織中的細(xì)胞增殖、分化轉(zhuǎn)換成能夠儲(chǔ)存脂類的細(xì)胞的過程，PPARγ、C/EBP-α表達(dá)下調(diào)可抑制成脂分化的發(fā)生[14-15]。本研究結(jié)果顯示，沉默HOXC10 表達(dá)后人牙髓干細(xì)胞中PPARγ、C/EBP-α表達(dá)水平降低，提示HOXC10 可能通過上調(diào)PPARγ、C/EBP-α 的表達(dá)從而促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞的成脂分化。

WNT 通路可調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移，還可調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞及胚胎肝細(xì)胞的自我更新及分化，研究表明，WNT通路在牙齒發(fā)育及牙源性干細(xì)胞增殖分化等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用[16]。相關(guān)報(bào)道指出GSK3β、β-catenin 是WNT 通路的主要蛋白，抑制WNT 通路可通過上調(diào)GSK3β 表達(dá)及下調(diào)β-catenin表達(dá)從而上調(diào)PPARγ、C/EBP-α 的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的成脂分化[17]。研究表明通過下調(diào)WNT通路的表達(dá)可促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞的成骨向分化及成牙本質(zhì)向分化[18]。本研究結(jié)果顯示，沉默HOXC10 后人牙髓干細(xì)胞中WNT 通路相關(guān)蛋白GSK3β 的表達(dá)水平降低，β-catenin 的表達(dá)水平升高，提示沉默HOXC10 可能通過激活WNT 通路進(jìn)而抑制牙髓干細(xì)胞的成脂分化。

綜上所述，成脂誘導(dǎo)的牙髓干細(xì)胞中HOXC10低表達(dá)，沉默HOXC10可抑制牙髓干細(xì)胞增殖及成脂分化，并可促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的遷移及細(xì)胞黏附，其作用機(jī)制可能是通過激活WNT 通路而發(fā)揮作用，可為進(jìn)一步揭示人牙髓干細(xì)胞增殖及成脂分化的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。但關(guān)于HOXC10 在人牙髓干細(xì)胞增殖及成脂分化過程中的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。