余 保，申 嚴，卓宋明

（深圳市龍崗中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，深圳 518000）

哮喘是指由常見的氣敏性過敏原（如屋塵螨，真菌和空氣污染物）引起的氣道炎性疾病，是國際醫(yī)學界公認的主要頑固性疾病之一[1]。氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑是哮喘的重要病理生理特征。一線用于治療哮喘的藥物仍然是β2腎上腺素能受體激動劑和糖皮質激素。然而，這種治療策略有嚴重的不良反應，如頭痛，震顫，心悸，和心臟衰竭[2]，因此有必要開發(fā)新型的抗哮喘藥，以提高療效，減少不良反應。氣道平滑肌細胞（airway smooth muscle cells，ASMCs）是參與哮喘氣道重塑的重要組分，具有增殖、遷移、分泌等功能，能釋放促炎、抗炎介質及免疫調節(jié)因子，調控氣道炎癥反應。氣道平滑肌細胞的異常增殖是氣道重塑的重要病理過程[3]。因此，從調控ASMCs增殖的角度探尋治療哮喘的新靶點及藥物具有重要意義。黃芩素是從黃芩的干燥根中分離得到的一類黃酮類化合物，也是黃芩的主要活性成分。研究表明，黃芩素具有抗炎、抗氧化、抗病毒、修復受損肺組織等作用[4]，也可抑制多種腫瘤細胞的增殖、遷移[5]，且黃芩中黃酮類提取物對血管平滑肌細胞的增殖和遷移具有抑制作用[6]，而黃芩素對哮喘是否有保護作用還未見相關報道。Janus蛋白酪氨酸激酶(Janus protein tyrosine kinase,JAK)/信號轉導和轉錄活化蛋白(signal transducer and activator of transcription,STAT)途徑對哮喘中多種細胞因子和黏附分子表達起重要作用[7-8]。黃芩素可通過抑制JAK/STAT抑制膀胱癌細胞的遷移侵襲[5]。因此，本研究以哮喘小鼠ASMCs為對象，探究黃芩素對ASMCs增殖、遷移的影響及可能的作用機制，為哮喘的防治及黃芩素的臨床應用提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性健康SPF 級Balb/c 小鼠，6～8 周齡，體重（18～22）g，購自濟南朋悅動物繁育有限公司，合格證號為SCXK(魯)20140007。所有動物均嚴格按照動物飼養(yǎng)規(guī)則喂養(yǎng)，溫度為（24±2）℃，濕度為50%～60%，12 h明暗交替，自由飲水和攝食。

1.2 藥品及試劑

黃芩素（純度＞98%，DH0024）購自成都德思特生物技術有限公司；重組小鼠血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor,PDGF,貨號:AF-100-14B-100）、重組小鼠白介素6（Interleukin 6,IL-6,貨號:AF-216-16）購自派普泰克生物科技（蘇州）有限公司；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gbico 公司；四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）、蛋白提取試劑盒、BCA 試劑盒均購自上海碧云天公司；二甲基亞砜（DMSO,美國Sigma公司）；小鼠IL-6（MU30044）、IL-8（MU30010）ELISA檢測試劑盒購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；兔抗JAK2（ab108596）、p-JAK2（ab32101）、STAT3（ab68153）、p-STAT3（ab76315）、β-actin（ab8227）、山羊抗兔IgG H&L(HRP)（ab205718）均購自英國abcam公司；細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific 公司；iMark680 多功能酶標儀、蛋白轉膜裝置購自美國Bio-Rad 公司；IX71 型相差顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠原代ASMCs的分離與培養(yǎng)

小鼠頸椎脫臼法處死后，75%乙醇浸泡消毒，取出氣管和肺組織，參照文獻[9]將取出的組織浸泡在含1%青霉素和鏈霉素的PBS 中，剔除食管及多余組織，剝離氣管平滑肌組織，分離、剪碎后，將其放入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合至80%以上時進行傳代。差速貼壁法純化細胞，純化后繼續(xù)培養(yǎng)，用4～6代細胞進行實驗。

1.3.2 MTT法檢測細胞增殖能力

取第4～6 代對數(shù)生長期的ASMCs，胰蛋白酶消化后將細胞懸液密度調整為4×104/mL，接種于96孔板（邊緣孔用無菌PBS填充），每孔100 μL。待細胞貼壁長至80%密度時，更換不含血清的培養(yǎng)基饑餓處理24 h，加入PDGF（10 ng/mL）[10]干預試劑繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后分別加入不同濃度的黃芩素（0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L）藥液10 μL。另設對照組（加培養(yǎng)液和細胞，不加干預試劑）、JAK/STAT信號通路激活劑IL-6與黃芩素聯(lián)用組（加50 ng/mL的IL-6和40 μmol/L的黃芩素）[5]，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。在培養(yǎng)結束前4 h，每孔加入10 μL 的MTT 溶液（5 mg/mL），于培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸去上層清液后加入150 μL/孔的DMSO，490 nm波長處測定各孔吸光度（OD），實驗重復3次。

細胞增殖率=（用藥組OD 值-空白孔OD 值）/（對照組OD值-空白孔OD值）×100%。

1.3.3 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

取第4～6 代對數(shù)生長期的ASMCs，胰蛋白酶消化后調整細胞濃度為1×105個/mL，接種于6 孔板中，待細胞完全貼壁后，用移液器尖端在每個孔內(nèi)劃一道痕，細胞分組及給藥同“2.2 項”，分別于加藥前和加藥培養(yǎng)48 h后在倒置顯微鏡下拍照，觀察劃痕愈合情況，計算細胞遷移率，實驗重復3次。細胞遷移率（%）=（0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%

1.3.4 ELISA 法檢測各組細胞培養(yǎng)上清中相關炎癥因子水平

細胞按照“2.2 項”操作步驟進行分組和給藥。收集加藥后培養(yǎng)48 h的細胞上清液，按照試劑盒說明書的操作，檢測細胞上清液中IL-6、IL-8水平。

1.3.5 蛋白免疫印跡(western blotting)檢測JAK／STAT通路相關蛋白表達

細胞按照“2.2 項”操作步驟進行分組和給藥。收集加藥后培養(yǎng)48 h 的細胞，提取細胞中的總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度后取等量蛋白質樣品上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉法轉膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗（JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3，βactin，按1∶1 000的比例稀釋；β-actin按1∶2 000的比例稀釋），4 ℃下孵育過夜，HRP 標記的羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）室溫孵育1h，化學發(fā)光法（ECL）顯色，以β-actin為內(nèi)參，通過與內(nèi)參的灰度比，得出目的條帶的相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間有差異進一步采用SNK-q檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 黃芩素對ASMCs細胞增殖的影響

與對照組相比，PDGF 組細胞增殖率顯著升高（P＜0.05）；與PDGF 組相比，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L 黃芩素組細胞增殖率明顯降低（P＜0.05）；與40 μmol/L 黃芩素組相比，IL-6+40 μmol/L黃芩素組細胞增殖率明顯升高（P＜0.05），見表1。

表1 黃芩素對ASMCs細胞增殖的影響 ，n=3

與對照組相比，aP＜0.05；與PDGF 組相比，bP＜0.05；與40 μmol/L黃芩素組相比，cP＜0.05。

3.2 黃芩素對ASMCs細胞遷移能力的影響

劃痕愈合實驗結果顯示，與對照組相比，PDGF組細胞遷移率顯著增加（P＜0.05）;與PDGF組相比，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L黃芩素組細胞遷移率明顯降低（P＜0.05）；與40 μmol/L黃芩素組相比，IL-6+40 μmol/L黃芩素組細胞遷移率明顯增加（P＜0.05），見圖1、表2。

表2 黃芩素對ASMCs細胞遷移能力的影響 ，n=3

與對照組相比，aP＜0.05；與PDGF 組相比，bP＜0.05；與40 μmol/L黃芩素組相比，cP＜0.05。

3.3 黃芩素對ASMCs細胞上清液中炎癥相關因子水平的影響

與對照組相比，PDGF組細胞上清液中IL-6、IL-8水平顯著增加（P＜0.05），與PDGF組相比，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L黃芩素組細胞上清液中IL-6、IL-8 水平明顯降低（P＜0.05）；與40 μmol/L 黃芩素組相比，IL-6+40 μmol/L 黃芩素組細胞上清液中IL-6、IL-8水平明顯增加（P＜0.05），見表3。

表3 黃芩素對ASMCs細胞上清液中炎癥相關因子水平的影響 ，pg/mL，n=3

表3 黃芩素對ASMCs細胞上清液中炎癥相關因子水平的影響 ，pg/mL，n=3

與對照組相比，aP＜0.05；與PDGF 組相比，bP＜0.05；與40 μmol/L黃芩素組相比，cP＜0.05。

3.4 黃芩素對ASMCs 細胞JAK/STAT 通路相關蛋白表達的影響

Western blotting檢測結果顯示，與對照組相比，PDGF組細胞p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達顯著增加（P＜0.05）;與PDGF 組相比，20 μmol/L、40 μmol/L 黃芩素組細胞p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 表達明顯降低（P＜0.05）；與40 μmol/L 黃芩素組相比，IL-6+40 μmol/L 黃芩素組細胞p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 表達明顯增加（P＜0.05）,見圖2、表4。

圖2 黃芩素對ASMCs 細胞p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達的影響

表4 黃芩素對ASMCs 細胞p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達的影響 ，n=3

表4 黃芩素對ASMCs 細胞p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達的影響 ，n=3

與對照組相比，aP＜0.05；與PDGF 組相比，bP＜0.05；與40 μmol/L黃芩素組相比，cP＜0.05。

3 討論

支氣管哮喘患者在接受常規(guī)霧化治療后，相當多的患者仍難以緩解癥狀，從而發(fā)展為難治性支氣管哮喘；哮喘發(fā)病機理尚不清楚，許多研究認為氣道炎癥細胞因子在哮喘的發(fā)病中表現(xiàn)出異常高的水平，并且是導致氣道重塑的關鍵因素[11]。ASMCs是調節(jié)氣道阻力和反應過度的主要細胞，其過度收縮會通過縮小氣道內(nèi)腔，限制氣體交換而導致哮喘癥狀的發(fā)展[12]。

近年來，中藥因其藥理作用廣泛、毒性小、不良反應少等優(yōu)點受到越來越多的關注，不少中藥及其有效成分可以有效緩解哮喘發(fā)作，已經(jīng)成為哮喘治療的熱點。黃芩素（5,6,7-三羥基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮）是從黃芩根中提取的主要黃酮之一。在多種疾病中具有藥理特性，包括心血管疾病[13]、細菌感染[14]和癌癥[15]。有越來越多的研究報道了黃芩素的抗過敏作用。黃芩素可以有效抑制塵螨和卵白蛋白（OVA）誘導的氣道過敏小鼠模型中肺部嗜酸性粒細胞浸潤[16]。Xu 等[17]研究發(fā)現(xiàn)黃芩素可通過滅活NF-κB 途徑來有效降低OVA 誘導的嗜酸性氣道炎癥、黏液過度產(chǎn)生、氣道重塑和氣道高反應性，表明黃芩素可作為預防或治療哮喘的藥物。Kong等[18]發(fā)現(xiàn)在PDGF 誘導的ASMCs 增殖和遷移過程中炎性因子TNF-α，IL-1β，IL-6 和IL-8 的釋放增加。在人氣道平滑肌細胞中增加IL-6，IL-8 的生物合成，可促進氣道狹窄并誘導促炎表型和氣道平滑肌收縮，促進哮喘發(fā)作[19]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，在PDGF 誘導的小鼠ASMCs 增殖過程中IL-6，IL-8 水平顯著增加，而黃芩素能明顯降低IL-6，IL-8 水平，抑制小鼠ASMCs 的增殖和遷移，提示黃芩素可能通過抑制炎癥和氣道重塑對哮喘具有治療作用，與以上研究結果一致。

JAK/STAT 信號傳導途徑是少數(shù)多效性級聯(lián)反應之一，在細胞增殖過程中起著至關重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素和哮喘相關靶標（IL-4，IL-5，IL-10，IL-13和IFN-γ）直接參與Th1和Th2細胞分化以及與哮喘相關的信號通路（NF-κB，IL-17，T 細胞受體，TNF，JAK-STAT信號通路等）[20]。Qi等[21]的研究表明，黃芩素可通過抑制JAK2/STAT3 活化來減輕LPS 誘導的巨噬細胞炎癥和活性氧（ROS）積累；并且可通過抑制JAK2/STAT3信號通路抑制膀胱癌細胞增殖并促進凋亡[5]。說明黃芩素的抗炎、抗氧化應激和抗腫瘤細胞增殖活性與JAK2/STAT3信號通路的調節(jié)有關[22]。研究發(fā)現(xiàn)，應用JAK 的抑制劑可以減少變應原誘導的氣道炎癥，晚期哮喘反應和p-STAT活化，減輕哮喘模型大鼠中的肺部炎癥并改善肺功能[23]；且STAT3 的活化在氣道平滑肌細胞的有絲分裂中發(fā)揮重要作用[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，在PDGF誘導的小鼠氣道平滑肌細胞增殖過程中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 表達顯著增加，經(jīng)黃芩素干預后，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 表達明顯降低，而JAK/STAT 通路激活劑IL-6 與40μmol/L 黃芩素聯(lián)合干預后細胞增值率、遷移率及p-JAK/JAK、p-STAT6/STAT6表達較40μmol/L黃芩素組明顯增加，說明IL-6可逆轉黃芩素對ASMCs 增殖和遷移的抑制作用，提示黃芩素對ASMCs 增殖和遷移的抑制作用可能與抑制JAK2/STAT3信號通路有關。

綜上所述，黃芩素可抑制哮喘小鼠氣道平滑肌細胞的增殖和遷移，其作用機制可能與抑制JAK2/STAT3 信號通路有關。本研究尚存在一定不足，未對JAK/STAT 信號通路中其他STAT 家族蛋白進行深入研究并驗證其相關性，這也是我們下一步研究的方向。