于玲玲 寧德生 符毓夏 李連春 李海云 潘爭(zhēng)紅

摘 要：? 尖尾楓（Callicarpa longissima）有止血鎮(zhèn)痛的功效，其化學(xué)成分和藥理活性研究報(bào)道較少。為研究尖尾楓枝葉的化學(xué)成分以及抗炎活性，該實(shí)驗(yàn)用尖尾楓枝葉95%乙醇提取物通過(guò)柱層析和HPLC進(jìn)行分離純化，根據(jù)理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)鑒定所得化合物的結(jié)構(gòu)。采用LPS離體誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞的NO生成模型，研究主要化合物對(duì)NO生成的抑制活性。結(jié)果表明：（1）從尖尾楓中分離得到12個(gè)化合物，分別鑒定為4′，5-二羥基-7-甲氧基黃酮（1）、噴杜素（2）、薊黃素（3）、洋艾素（4）、4′，5-二羥基-3′，7-二甲氧基黃酮（5）、甲基條葉薊素（6）、金腰素（7）、泡桐素（8）、齊墩果酸（9）、樺木酸（10）、2，4，6-三甲氧基苯酚（11）、咖啡酸乙酯（12）。（2）化合物1-7在25 μmol·L-1濃度下對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7釋放的NO均具有明顯的抑制作用。化合物1、2、4、5、6、8、10、11、12均為首次從該植物中分離得到，化合物1-7均具有不同程度的抗炎作用，其中化合物2、3、6表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗炎活性。

關(guān)鍵詞： 尖尾楓， 化學(xué)成分， 分離鑒定， 抗炎活性

中圖分類號(hào)：? Q946

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A

文章編號(hào)：? 1000-3142（2021）11-1875-07

Chemical constituents and their anti-inflammatory activities of Callicarpa longissima

YU Lingling1，2， NING Desheng2， FU Yuxia2， LI Lianchun2， LI Haiyun1， PAN Zhenghong2*

（ 1. College of Chemistry and Bioengineering， Guilin University of Technology， Guilin 541006， Guangxi， China; 2. Guangxi Key Laboratory of Functional Phytochemicals Research and Utilization， Guangxi Institute of Botany， Guangxi Zhuang Autonomous

Region and Chinese Academy of Sciences， Guilin 541006， Guangxi， China ）

Abstract：? Callicarpa longissima has hemostatic and analgesic effects， and there are few reports on its chemical composition and pharmacological activity. In order to study the chemical composition and anti-inflammatory activity of C. longissima branches and leaves， the 95% ethanol extract of C. longissima branches and leaves were isolated and purified by column chromatography and HPLC， and the structures of the obtained compound were identified based on the physical and chemical properties and spectral data. Using LPS-activated RAW 264.7 cell line models in vitro， main compounds were evaluated for the inhibition against NO production. The results were as follows： Twelve compounds were isolated and identified as 4′，5-dihydroxy-7-methoxyflavone（1）， penduletin（2）， cirsimaritin（3）， artemetin（4）， 4′，5-dihydroxy-3′，7-dimethoxyflavone（5）， cirsilineol（6）， chrysosplenetin（7）， paulownin（8）， oleanolic acid（9）， betulinic acid（10）， 2，4，6-trimethoxyphenol（11）， ethyl caffeate（12）.

（2） Compounds 1-7 have significant inhibitory effect on the release of NO from mouse macrophages RAW 264.7 induced by LPS at a concentration of 25 μmol·L-1. In conclusion， compounds 1， 2， 4， 5， 6， 8， 10， 11 and 12 were isolated from this plant for the first time. Compounds 1-7 have anti-inflammatory effects， among which compounds 2， 3 and 6 show strong anti-inflammatory activity.

Key words： Callicarpa longissima， chemical constituents， isolation and identification， anti-inflammatory activity

尖尾楓（Callicarpa longissima）為馬鞭草科紫珠屬植物，藥用全株，有止血鎮(zhèn)痛、祛瘀消腫、祛風(fēng)濕的功效，常用于治療風(fēng)濕性腰腿痛、跌打損傷、毒蛇咬傷、關(guān)節(jié)疼痛、產(chǎn)后風(fēng)、骨折、風(fēng)寒咳嗽等病癥（中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)，1982;江蘇新醫(yī)藥學(xué)院，1986）。尖尾楓作為一種廣西特色瑤藥，是“虎牛鉆風(fēng)”中“七十二風(fēng)”的粘手風(fēng)，在廣西瑤族、壯族等地區(qū)具有悠久的使用歷史（戴斌和李釗東，1988）。已有研究報(bào)道表明，尖尾楓含有萜類、黃酮類、木脂素類、苯丙素類等成分（Liu et al.， 2012;高微等，2013;袁經(jīng)權(quán)，2015），具有抗炎、美白等作用（Yamahara et al.， 2016;焦楊等，2016）。目前，有關(guān)尖尾楓化學(xué)成分文獻(xiàn)報(bào)道較少，針對(duì)其化學(xué)成分的活性研究更少，導(dǎo)致其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚未得到確定?；诩馕矖髟趶V西少數(shù)民族地區(qū)的實(shí)際應(yīng)用及確切療效，為了進(jìn)一步闡明該民族特色瑤藥的抗炎活性物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究對(duì)其枝葉的95%乙醇提取物進(jìn)行了分離純化，分離并鑒定了12個(gè)化合物（圖1），并對(duì)其主要黃酮類化合物進(jìn)行了抗炎活性測(cè)定。本研究結(jié)果不僅豐富了尖尾楓的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，也為其今后開(kāi)發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)藥材

尖尾楓枝葉采集于廣西桂林市雁山區(qū)，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所黃俞淞副研究員鑒定為馬鞭草科紫珠屬植物尖尾楓（Callicarpa longissima）的枝葉，憑證樣品保存于廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

細(xì)胞株：小鼠單核巨噬細(xì)胞（RAW 264.7細(xì)胞），購(gòu)買于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

布魯克AVANCE Ⅲ 500 MHz核磁共振波譜儀（瑞士布魯克公司）;Shimadzu LC/MS-IT-TOF質(zhì)譜儀、色譜柱PCR-ODS（日本島津公司）;Agilent 1200高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）;二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱、-80 ℃超低溫冰箱（美國(guó)Thermo Forma公司）;滅菌鍋（日本Hirayama公司）;倒置顯微鏡（舜宇光學(xué)科技有限公司）;0.1～1 mL、20～200 μL、2～20 μL移液槍（法國(guó)Gilson公司）;全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)耗材和試劑

DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Invitrogen）;HyClone胎牛血清（Fatal Bovine Serum，F(xiàn)BS）（美國(guó)HyClone公司）;內(nèi)毒素（LPS）、噻唑藍(lán) [3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide， MTT]、二甲基亞砜（DMSO）（美國(guó)Sigma公司）;NO檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Promege公司）;12孔培養(yǎng)板、75 cm2培養(yǎng)瓶、100 mm培養(yǎng)皿、細(xì)胞刮刀、1.5 mL EP管（美國(guó)Corning costar公司）;MCI gel（日本三菱化學(xué)公司）;柱層析分離填料硅膠（100～200目，青島海洋化工廠）;葡聚糖凝膠Sephadex LH-20（美國(guó)GE公司）。二氯甲烷、甲醇、95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、丙酮（分析純，廣東光華科技股份有限公司）;乙腈 [色譜純，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取與分離

尖尾楓枝葉4.95 kg，陰干后粉碎，加入95%乙醇20 L，在室溫下浸泡48 h，過(guò)濾，濾渣再重復(fù)上述操作4次，合并5次提取液，減壓回收溶劑得到浸膏557 g。取500 g浸膏用水分散后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取3次，每次萃取的溶劑為2 L，回收溶劑后得到石油醚部位138.7 g、氯仿部位87.2 g、乙酸乙酯部位251.3 g。

取氯仿部位70 g經(jīng)凝膠柱分離，以氯仿-甲醇（1∶1）洗脫，得到8個(gè)組分A1～A8。組分A3經(jīng)硅膠柱，以石油醚-丙酮（20∶1-1∶1）洗脫，經(jīng)HPLC（0～40 min，乙腈-水=48∶52）純化得化合物9（22.6 mg）、10（10.1 mg），經(jīng)HPLC（0～40 min，乙腈-水=46∶54）純化得化合物11（6.9 mg）、12（7.4 mg）。組分A7經(jīng)硅膠柱， 石油醚-乙酸乙酯（100∶1～10∶1）洗脫，用Sephadex LH-20柱色譜（氯仿∶甲醇=1∶1）純化，重結(jié)晶，得化合物1（6.5 mg）、4（9.9 mg）、5（8.3 mg）、7（5.5 mg）、8（4.2 mg）。取乙酸乙酯部位200 g，過(guò)MCI（甲醇-水=70∶30、80∶20、90∶10、100∶0）得到4個(gè)部位B1～B4，B1經(jīng)硅膠柱分離，石油醚-丙酮梯度洗脫（50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1），得5個(gè)組分C1～C5，組分C1、C3經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜（氯仿∶甲醇=1∶1）純化，甲醇反復(fù)結(jié)晶，得到化合物2（18.8 mg）、3（7.3 mg）、6（8.2 mg）。

2.2 抗炎活性實(shí)驗(yàn)

利用國(guó)際公認(rèn)的脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7作為抗炎活性篩選模型，采用Griess試劑顯色法檢測(cè)NO的釋放量（楊曉露等，2013）。操作步驟如下：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的巨噬細(xì)胞RAW 264.7，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整密度為5×104 ～ 6×104個(gè)每毫升的單細(xì)胞懸液，于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種，且每孔加入100 μL密度為0.2 μg·mL-1 脂多糖（LPS）進(jìn)行誘導(dǎo)刺激，同時(shí)加入待測(cè)的化合物（25 μmol·L-1），實(shí)驗(yàn)設(shè)置不加藥物的組為對(duì)照，放置在CO2濃度為5%、溫度為37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h之后，吸取其培養(yǎng)液，加入Griess試劑，輕搖至混和均勻，在避光條件下，靜靜等待10 min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀讀取在570 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光值。NO生成抑制率（%）=（模型組A570 nm-樣品組A570 nm）/模型組A570 nm×100%，對(duì)于NO產(chǎn)生抑制率高于50%的化合物，實(shí)驗(yàn)設(shè)置25.00、12.50、6.25、3.12 μmol·L-1濃度梯度，測(cè)定得出其不同濃度下的吸光值，再采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行回歸計(jì)算IC50值。同一批次的細(xì)胞采用MTT法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的活力（Mosmann， 1983）。

3 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 黃色粉末。ESI-MS m/z： 283.1? [M-H]-， 分子式為C16H12O5。1H NMR （500 MHz， C5D5N） δ： 7.96 （2H， d， J = 9.0 Hz， H-2′， 6′）， 7.28 （2H， d， J = 9.0 Hz， H-3′， 5′）， 6.98 （1H， s， H-3）， 6.69 （1H， d， J = 2.0 Hz， H-8）， 6.59 （1H， d， J = 2.0 Hz， H-6）， 3.78 （3H， s， OMe-7）; 13C NMR （125 MHz， C5D5N） δ： 164.7 （C-2）， 104.2 （C-3）， 183.0 （C-4）， 162.5 （C-5）， 98.7 （C-6）， 165.9 （C-7）， 93.1 （C-8）， 157.9 （C-9）， 105.4 （C-10）， 122.1 （C-1′）， 128.9 （C-2′， 6′）， 116.7 （C-3′， 5′）， 162.8 （C-4′）， 56.0 （OMe-7）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（余正文等，2005）基本一致，故將化合物1鑒定為4′，5-dihydroxy-7-methoxyflavone（4′，5-二羥基-7-甲氧基黃酮）。

化合物2 黃色晶體。ESI-MS m/z： 343.7? [M-H]-， 分子式為C18H16O7。1H NMR （500 MHz， （CD3）2CO） δ： 8.05 （2H， d， J = 8.5 Hz， H-2′， 6′）， 6.98 （2H， d， J = 8.5 Hz， H-3′， 5′）， 6.80 （1H， s， H-8）， 3.96 （3H， s， OMe-3）， 3.90 （3H， s， OMe-7）， 3.81 （3H， s， OMe-6）; 13C NMR （125 MHz， （CD3）2CO） δ： 153.6 （C-2）， 139.2 （C-3）， 179.9 （C-4）， 159.9 （C-5）， 133.0 （C-6）， 161.7 （C-7）， 91.9 （C-8）， 152.8 （C-9）， 107.3 （C-10）， 122.8 （C-1′）， 131.4 （C-2′， 6′）， 116.5 （C-3′， 5′）， 157.1 （C-4′）， 60.6 （OMe-6）， 60.2 （OMe-3）， 56.8 （OMe-7）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（李順林和丁靖塏，1994）基本一致，故將化合物2鑒定為penduletin（噴杜素）。

化合物3? 淡黃色晶體。ESI-MS m/z： 313.1? [M-H]-， 分子式為C17H14O6。1H NMR （500 MHz， （CD3）2CO） δ： 7.96 （2H， d， J = 9.0 Hz， H-2′， 6′）， 7.03 （2H， d， J = 9.0 Hz， H-3′， 5′）， 6.86 （1H， s， H-8）， 6.71 （1H， s， H-3）， 4.01 （3H， s， OMe-7）， 3.79 （3H， s， OMe-6）; 13C NMR （125 MHz， （CD3）2CO） δ： 165.1 （C-2）， 104.1 （C-3）， 183.3 （C-4）， 154.2 （C-5）， 132.9 （C-6）， 160.4 （C-7）， 92.2 （C-8）， 153.8 （C-9）， 106.1 （C-10）， 122.7 （C-1′）， 129.4 （C-6′， 2′）， 116.9 （C-5′， 3′）， 161.8 （C-4′）， 60.5 （OMe-6）， 56.8 （OMe-7）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（Scharkowski et al.， 2018）基本一致，故將化合物3鑒定為cirsimaritin（薊黃素）。

化合物4? 黃色粉末。ESI-MS m/z： 389.1? [M+H]+， 分子式為C20H20O8。1H NMR （500 MHz， CDCl3） δ： 7.73 （1H， dd， J = 2.0， 9.0 Hz， H-6′）， 7.70 （1H， d， J = 2.0 Hz， H-2′）， 6.97（1H， d， J = 9.0 Hz， H-5′）， 6.51 （1H， s， H-8）， 3.98 （3H， s， OMe-3′）， 3.97 （3H， s， OMe-3）， 3.97 （3H， s， OMe-4′）， 3.93 （3H， s， OMe-7）， 3.87 （3H， s， OMe-6）; 13C NMR （125 MHz， CDCl3） δ： 155.9 （C-2）， 138.9 （C-3）， 178.9 （C-4）， 152.1 （C-5）， 132.7 （C-6）， 159.0 （C-7）， 90.6 （C-8）， 153.1 （C-9）， 106.7 （C-10）， 122.1 （C-1′）， 110.8 （C-2′）， 149.1 （C-3′）， 151.3 （C-4′）， 111.2 （C-5′）， 123.0 （C-6′）， 60.9 （OMe-3）， 60.2 （OMe-6）， 56.4 （OMe-7）， 56.2 （OMe-4′）， 56.0 （OMe-3′）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（姚巍等，2007）基本一致，故將化合物4鑒定為artemetin（洋艾素）。

化合物5? 黃色針形。ESI-MS m/z： 337.3? [M+Na]+， 分子式為C17H14O6。1H NMR （500 MHz， CDCl3） δ： 12.81 （1H， s， OH）， 7.51 （1H， dd， J = 1.5， 8.0 Hz， H-6′）， 7.36 （1H， d， J = 1.5 Hz， H-2′）， 7.06 （1H， d， J = 8.0 Hz， H-5′）， 6.60 （1H， s， H-3）， 6.52 （1H， d， J = 1.5 Hz， H-8）， 6.40 （1H， d， J = 1.5 Hz， H-6）， 4.01 （3H， s， OMe-3′）， 3.90 （3H， s， OMe-7）; 13C NMR （125 MHz， CDCl3） δ： 164.3 （C-2）， 104.7 （C-3）， 182.6 （C-4）， 162.2 （C-5）， 98.13 （C-6）， 165.4 （C-7）， 93.0 （C-8）， 158.1 （C-9）， 105.9 （C-10）， 123.4 （C-1′）， 108.7 （C-2′）， 149.3 （C-3′）， 146.8 （C-4′）， 115.4 （C-5′）， 121.2 （C-6′）， 56.4 （OMe-3′）， 55.9 （OMe-7）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（彭可等，2010）基本一致，故將化合物5鑒定為4′，5-dihydroxy-3′，7-dimethoxyflavone（4′，5-二羥基-3′，7-二甲氧基黃酮）。

化合物6? 黃色粉末。ESI-MS m/z： 345.1? [M+H]+， 分子式為C18H16O7。1H NMR （500 MHz， （CD3）2CO） δ： 12.98 （1H， s， OH）， 7.64 （1H， s， H-2′）， 7.59 （1H， d， J = 9.0 Hz， H-6′）， 7.01 （1H， d， J = 9.0 Hz， H-5′）， 6.86 （1H， s， H-8）， 6.75 （1H， s， H-3）， 4.00 （3H， s， OMe-3′）， 3.97 （3H， s， OMe-7）， 3.81 （3H， s， OMe-6）; 13C NMR （125 MHz， （CD3）2CO） δ： 165.1 （C-2）， 104.1 （C-3）， 183.7 （C-4）， 154.3 （C-5）， 133.6 （C-6）， 159.9 （C-7）， 92.1 （C-8）， 154.0 （C-9）， 106.4 （C-10）， 123.6 （C-1′）， 110.7 （C-2′）， 149.1 （C-3′）， 151.8 （C-4′）， 116.4 （C-5′）， 121.4 （C-6′）， 60.5 （OMe-6）， 56.8 （OMe-7）， 56.6 （OMe-3′）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（Scharkowski et al.， 2018）基本一致，故將化合物6鑒定為cirsilineol（甲基條葉薊素）。

化合物7? 黃色粉末。ESI-MS m/z： 373.2? [M-H]-， 分子式為C19H18O8。1H NMR （500 MHz， CDCl3） δ： 12.61 （1H， s， OH）， 7.71 （1H， d， J = 2.0 Hz， H-2′）， 7.66 （1H， dd， J = 2.0， 8.5 Hz， H-6′）， 7.03 （1H， d， J = 9.0 Hz， H-5′）， 6.48 （1H， s， H-8）， 3.97 （3H， s， OMe-3′）， 3.93 （3H， s， OMe-3）， 3.91 （3H， s， OMe-7）， 3.88 （3H， s， OMe-6）; 13C NMR （125 MHz， CDCl3） δ： 156.0 （C-2）， 138.7 （C-3）， 178.9 （C-4）， 152.5（C-5）， 132.3 （C-6）， 158.5 （C-7）， 90.1 （C-8）， 152.6 （C-9）， 106.6 （C-10）， 122.1 （C-1′）， 110.8 （C-2′）， 146.6 （C-3′）， 148.1 （C-4′）， 114.4 （C-5′）， 122.6 （C-6′）， 60.7 （OMe-3）， 60.1 （OMe-6）， 56.3 （OMe-7）， 56.2 （OMe-3′）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（Numonov et al.， 2013）基本一致，故將化合物7鑒定為chrysosplenetin（金腰素）。

化合物8? 白色粉末。ESI-MS m/z： 371.3? [M+H]+， 分子式為C20H18O7。1H NMR （500 MHz， MeOD） δ： 6.96 （1H， d， J = 1.5 Hz， H-2′），6.95 （1H， d， J = 1.5 Hz， H-2″），6.90-6.88 （1H， m， H-6′），6.88-6.86 （1H， m， H-6″），6.80 （1H， d， J = 1.5 Hz， H-5′），6.78 （1H， d， J = 1.5 Hz， H-5″）， 5.94 （2H， s， OCH2O）， 5.93 （2H， s， OCH2O）， 4.84 （1H， d， J = 5.0 Hz， H-6）; 13C NMR （125 MHz， MeOD） δ： 92.8 （C-1）， 87.6 （C-2）， 76.2 （C-4）， 72.0 （C-5）， 86.6 （C-6）， 74.9 （C-8）， 136.3 （C-1′）， 109.4 （C-2′）， 149.4 （C-3′）， 148.8 （C-4′）， 108.6 （C-5′）， 120.9 （C-6′）， 131.7 （C-1″）， 109.0 （C-2″）， 148.9 （C-3″）， 148.7 （C-4″）， 107.8 （C-5″）， 120.7 （C-6″）， 102.4 （OCH2O）， 101.2 （OCH2O）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（羅國(guó)良等，2017）基本一致，故將化合物8鑒定為paulownin（泡桐素）。

化合物9? 白色粉末。ESI-MS m/z： 455.1? [M-H]-， 分子式為C30H48O3。1H NMR （500 MHz， CDCl3） δ： 5.31 （1H， t， J = 3.5 Hz， H-12）， 3.23 （1H， dd， J = 5.0， 11.5 Hz， H-3）， 1.17 （3H， s， CH3）， 1.02 （3H， s， Me）， 0.96 （3H， s， Me）， 0.94 （3H， s， Me）， 0.93 （3H， s， Me）， 0.81 （3H， s， Me）， 0.80 （3H， s， Me）; 13C NMR （125 MHz， CDCl3） δ： 38.5 （C-1）， 27.2 （C-2）， 79.1 （C-3）， 38.8 （C-4）， 55.3 （C-5）， 18.3 （C-6）， 32.7 （C-7）， 39.3 （C-8）， 47.7 （C-9）， 37.1 （C-10）， 23.0 （C-11）， 122.7 （C-12）， 143.6 （C-13）， 41.7 （C-14）， 27.7 （C-15）， 23.4 （C-16）， 46.5 （C-17）， 41.2 （C-18）， 45.9 （C-19）， 30.7 （C-20）， 33.8 （C-21）， 32.4 （C-22）， 28.1 （C-23）， 15.5 （C-24）， 15.3 （C-25）， 17.1 （C-26）， 25.9 （C-27）， 182.6 （C-28）， 33.1 （C-29）， 23.6 （C-30）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（方進(jìn)波等，2006）基本一致，故將化合物9鑒定為oleanolic acid（齊墩果酸）。

化合物10? 白色粉末。ESI-MS m/z： 455.2 ?[M-H]-， 分子式為C30H48O3。1H NMR （500 MHz， CDCl3） δ： 3.20 （1H， dd， J = 5.0， 11.5 Hz， H-3）， 1.00 （3H， s， Me）， 0.99 （3H， s， Me）， 0.96 （3H， s， Me）， 0.85 （3H， s， Me）， 0.78 （3H， s， Me）; 13C NMR （125 MHz， CDCl3） δ： 38.7 （C-1）， 27.4 （C-2）， 79.0 （C-3）， 38.9 （C-4）， 55.4 （C-5）， 18.3 （C-6）， 34.4 （C-7）， 40.7 （C-8）， 50.6 （C-9）， 37.2 （C-10）， 20.9 （C-11）， 25.5 （C-12）， 38.4 （C-13）， 42.5 （C-14）， 30.6 （C-15）， 32.2 （C-16）， 56.3 （C-17）， 49.3 （C-18）， 46.9 （C-19）， 150.4 （C-20）， 29.7 （C-21）， 37.0 （C-22）， 28.0 （C-23）， 15.3 （C-24）， 16.1 （C-25）， 16.0 （C-26）， 14.7 （C-27）， 179.2 （C-28）， 19.4 （C-29）， 109.7 （C-30）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（Yili et al.， 2009）基本一致，故將化合物10鑒定為betulinic acid（樺木酸）。

化合物11 白色粉末。ESI-MS m/z： 183.2? [M-H]-， 分子式為C9H12O4。1H NMR （500 MHz， （CD3）2CO） δ： 6.13 （2H， s， H-3， 5）， 3.75 （6H， s， OMe-2， 6）， 3.62 （3H， s， OMe-4）; 13C NMR （125 MHz， （CD3）2CO） δ： 155.6 （C-1）， 154.9 （C-2， 6）， 94.1 （C-3， 5）， 60.6 （OMe-4）， 56.3 （OMe-2， 6）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（徐文等，2010）基本一致，故將化合物11鑒定為2，4，6-trimethoxyphenol（2，4，6-三甲氧基苯酚）。

化合物12? 透明晶體。ESI-MS m/z： 231.3? [M+Na]+， 分子式為C11H12O4。1H NMR （500 MHz， （CD3）2CO） δ： 7.53 （1H， d， J = 16.0 Hz， H-7）， 7.17 （1H， d， J = 2.0 Hz， H-2）， 7.04 （1H， dd， J = 2.0， 8.5 Hz， H-6）， 6.87 （1H， d， J = 8.5 Hz， H-5）， 6.27 （1H， d， J = 16.0 Hz， H-8）， 4.18 （2H， q， J = 7.0 Hz， H-10）， 1.28 （3H， t， J = 7.5 Hz， H-11）; 13C NMR （125 MHz， （CD3）2CO） δ： 122.5 （C-1）， 115.2 （C-2）， 145.6 （C-3）， 148.8 （C-4）， 116.4 （C-5）， 127.6 （C-6）， 146.4 （C-7）， 115.8 （C-8）， 167.4 （C-9）， 60.5 （C-10）， 14.7 （C-11）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（趙東保等，2006）基本一致，故將化合物12鑒定為ethyl caffeate（咖啡酸乙酯）。

4 抗炎活性測(cè)試結(jié)果

將脂多糖（LPS）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW 264.7釋放NO作為篩選模型，對(duì)本研究分離得到的7個(gè)黃酮化合物采用Griess法來(lái)進(jìn)行抗炎活性評(píng)價(jià)。在25 μmol·L-1的濃度下，化合物1-7對(duì)巨噬細(xì)胞RAW 264.7生長(zhǎng)無(wú)明顯的負(fù)面影響，細(xì)胞的存活率均在90%以上（圖2：B），結(jié)果表明這些化合物在濃度為25 μmol·L-1時(shí)對(duì)細(xì)胞都沒(méi)有毒性作用，而且化合物對(duì)于脂多糖（LPS）誘導(dǎo)RAW 264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，抑制率最低為26.72%，最高為68.84%，結(jié)果見(jiàn)表1和圖2：A。值得關(guān)注的是化合物2、3、6表現(xiàn)出明顯優(yōu)于其他化合物的抑制活性，所以進(jìn)一步測(cè)定其IC50值，測(cè)得化合物2、3、6的IC50值依次為24.31、13.24、12.45 μmol·L-1。

5 討論

本研究共從尖尾楓枝葉部位分離鑒定12個(gè)單體化合物，包括黃酮類7個(gè)、三萜類2個(gè)、木脂素1個(gè)、酚類2個(gè)，其中化合物1、2、4、5、6、8、10、11、12均為首次從該植物中分離得到。

炎癥是機(jī)體在受到各種內(nèi)外環(huán)境的刺激而引發(fā)的應(yīng)激防御性反應(yīng)，是臨床中常見(jiàn)的一個(gè)病理過(guò)程。炎癥本身是把雙刃劍，適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)有助于機(jī)體清除損傷，抵御外來(lái)感染，促進(jìn)傷口的愈合;過(guò)度的炎癥反應(yīng)則會(huì)對(duì)正常組織和細(xì)胞造成損傷，引起機(jī)體功能的失調(diào)，進(jìn)而促使多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤、敗血癥以及老年性癡呆等疾病都與異常的炎癥反應(yīng)有關(guān)聯(lián)。天然藥物具有多靶點(diǎn)、多機(jī)制、副作用小的獨(dú)特本質(zhì)，在治療和預(yù)防炎癥性疾病中發(fā)揮著重要作用。

尖尾楓在瑤族民間常用來(lái)治療關(guān)節(jié)炎、 風(fēng)濕痛等。本研究采用國(guó)際公認(rèn)的脂多糖誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO為模型，篩選了從尖尾楓中分離得到主要單體化合物對(duì)NO生成的抑制作用。本研究結(jié)果表明，7個(gè)多甲氧基黃酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞釋放NO均有不同程度的抑制作用，其中化合物2、3、6的效果更好，從構(gòu)效關(guān)系分析來(lái)看，6位上的甲氧基和4′位上的羥基可能是其發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵基團(tuán)。多甲氧基黃酮化合物已被報(bào)道具有較強(qiáng)的抗炎活性（郭珊珊，2012），在本實(shí)驗(yàn)中得到進(jìn)一步證實(shí)。本研究結(jié)果驗(yàn)證了尖尾楓的民間抗炎功效，為其下一步的藥理研究奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 李 莉）