蔣寧寧，王鵬來(lái)，袁長(zhǎng)永，黃曉峰，蔣常委，劉宗響*，孫鐵忠

（1. 徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州口腔醫(yī)院口腔頜面外科，江蘇 徐州 221002；2. 南京大學(xué)附屬口腔醫(yī)院病理科，南京 210008）

舌鱗狀細(xì)胞癌（tongue squamous cell carcinoma,TSCC）是常見(jiàn)的口腔癌。TSCC的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程，受多種相關(guān)基因調(diào)控。腫瘤轉(zhuǎn)移抑制蛋白1（metastasis suppressor 1, MTSS1）是癌轉(zhuǎn)移機(jī)制研究時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種新基因[1-2]，與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)。Ki-67是一種存在于腫瘤細(xì)胞增殖周期的蛋白質(zhì)，可以評(píng)價(jià)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖活力[3]。MTSS1定位于人類(lèi)染色體 8q24.1上，編碼5.3Kb的轉(zhuǎn)錄本，廣泛表達(dá)于胸腺、脾臟、前列腺、睪丸、子宮、結(jié)腸和外周血液等正常組織中，研究[4]指出MTSS1作為支架蛋白可通過(guò)不同途徑調(diào)控肌動(dòng)蛋白參與各種類(lèi)型腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶類(lèi)，主要破壞ECM、降解腫瘤細(xì)胞基底膜等。本研究通過(guò)檢測(cè)80例TSCC中MTSS1表達(dá)情況及其與Ki-67和MMP-9的相關(guān)性，探討MTSS1的表達(dá)水平與TSCC轉(zhuǎn)移及與各臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

所有標(biāo)本來(lái)自于南京大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，收集2015年6月－2017年6月經(jīng)外科及病理科確診切除的TSCC組織80例，癌旁組織20例；患者年齡29～88歲，中位年齡55歲；TSCC組織中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組34例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組46例；高分化組28例，中～低分化組52例；臨床分期按UICC（2009）舌癌分類(lèi)分期方案分為Ⅰ～Ⅱ期組43例，Ⅲ～Ⅳ期組37例；所有標(biāo)本符合首次手術(shù)，住院前未經(jīng)過(guò)放、化療。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

采用EnVision免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)MTSS1、Ki-67、MMP-9蛋白的表達(dá)，兔抗人MTSS1 單克隆抗體、Ki-67兔抗人單克隆抗體及MMP-9鼠抗人單克隆抗體分別購(gòu)自CST公司、福建邁新公司；EnVision檢測(cè)試劑盒與DAB顯色劑均購(gòu)自DAKO公司。免疫組化取手術(shù)切除癌組織約1 cm處的黏膜做正常對(duì)照；PBS替代一抗作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

采用二級(jí)積分法進(jìn)行評(píng)分，MTSS1、MMP-9以胞質(zhì)陽(yáng)性染色多出現(xiàn)淡黃色、棕黃色、棕褐色，高倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)以上視野，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例積分：A，按顯色細(xì)胞數(shù)記分，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0，5%～25%為1分，26%～ 50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；B，按細(xì)胞顯色深淺記分，無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞為0分，淡黃色顯色1分，黃或棕黃色顯色2分，褐或棕褐色顯色3分。積分?jǐn)?shù)=A×B：0～2為（-），3～5為（+），6～8為（++），9～12為（+++）[2]。Ki-67陽(yáng)性染色多出現(xiàn)胞核著色，呈棕黃色或棕褐色，高倍鏡下隨機(jī)選10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，記錄其中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，測(cè)定Ki-67標(biāo)記指標(biāo)（LI），所選視野中陽(yáng)性細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞總和＞10為陽(yáng)性細(xì)胞[3]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。MTSS1蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況與臨床病理參數(shù)的關(guān)系均采用陽(yáng)性率及χ2檢驗(yàn)分析。當(dāng)n≥40，表格中有一個(gè)格的理論頻數(shù)1≤T＜5時(shí)，則需用Yates公式進(jìn)行連續(xù)性校正。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TSCC組織及癌旁正常黏膜中 MTSS1的表達(dá)

見(jiàn)表1，表2，圖1。

表1 MTSS-1蛋白在癌旁正常舌黏膜及舌鱗癌組織中的表達(dá)

表2 MTSS-1的表達(dá)與舌鱗癌臨床生物學(xué)行為的關(guān)系

MTSS1蛋白主要顯色于細(xì)胞質(zhì)，染色強(qiáng)度為淺黃色到棕褐色不等，在腫瘤細(xì)胞中呈片狀分布（圖1-A，圖1-B）。MTSS1蛋白在癌旁正常黏膜中呈現(xiàn)較強(qiáng)或強(qiáng)的陽(yáng)性反應(yīng)（圖1-C），其表達(dá)率與TSCC組織中相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MTSS1蛋白的表達(dá)與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期高低、MMP-9以及Ki-67表達(dá)有關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)率顯著降低（P＜0.05）；臨床Ⅲ～Ⅳ期組較Ⅰ～Ⅱ期組的表達(dá)率顯著降低（P＜0.001）；MMP-9和Ki-67陽(yáng)性的表達(dá)率顯著降低（P＜0.001）；2）MMP-9蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及包膜，染色強(qiáng)度為棕黃色或棕褐色，在癌巢邊緣處表達(dá)較明顯（圖1-D，圖1-E）。MMP-9蛋白在癌旁正常黏膜中呈現(xiàn)較弱的陽(yáng)性反應(yīng)（圖1-F）；3）Ki-67蛋白主要顯色于胞核，染色主要呈棕黃或棕褐色（圖1-G、圖1-H）。Ki-67蛋白在癌旁正常黏膜中呈現(xiàn)較弱的陽(yáng)性反應(yīng)（圖1-I）。

3 討論

在不同來(lái)源類(lèi)型的腫瘤中，MTSS1蛋白的調(diào)控機(jī)制存在不同的作用。目前有研究表明，MTSS1在胰腺癌[5]、肺鱗癌[6]、膽管癌[7]、急性粒細(xì)胞白血病[8]等惡性腫瘤中的表達(dá)下調(diào)并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；在肝細(xì)胞癌[9]、宮頸癌[2]等惡性腫瘤中表達(dá)升高。本研究通過(guò)檢測(cè)20例癌旁正常黏膜與80例TSCC組織中MTSS1蛋白表達(dá)的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)80例TSCC組織中MTSS1蛋白表達(dá)量顯著低于20例癌旁正常黏膜；34例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的蛋白表達(dá)量顯著低于46例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，37例臨床Ⅲ～Ⅳ期組顯著低于43例臨床Ⅰ～Ⅱ期組。提示MTSS1蛋白與TSCC浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)，MTSS1不但抑制了TSCC的發(fā)生，還影響TSCC的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程，MTSS1蛋白與TSCC的惡性生物學(xué)行為有關(guān)。該結(jié)果符合Yan Guo等[10]研究MTSS1在舌鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況。John C. Dawson 等[11]發(fā)現(xiàn)MTSS1在頭頸部腫瘤細(xì)胞早期表達(dá)量升高，并且在EGF信號(hào)通路中扮演重要角色。

MMP-9活化后通過(guò)降解膠原進(jìn)而破壞細(xì)胞基底膜和ECM，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[12]。Ki-67能準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的增殖能力，是檢測(cè)腫瘤增殖活性的有效指標(biāo)之一[13]。本研究顯示，TSCC組織中的MMP-9和Ki-67的表達(dá)較高，癌旁組織中的表達(dá)較低。因此，提示MMP-9和Ki-67的高表達(dá)可能反映了TSCC病變的發(fā)生發(fā)展程度。

很多學(xué)者提出基因協(xié)同作用的假設(shè)，認(rèn)為至少有2種或2種以上不同功能且呈激活狀態(tài)的基因在惡性腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮了不同的作用，或者相互配合，或者互相拮抗，從而促進(jìn)了腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。Nagai等[14]研究胰腺癌細(xì)胞系時(shí)發(fā)現(xiàn)，過(guò)度活化的Hh-Gli信號(hào)通路通過(guò)從基因轉(zhuǎn)錄的水平上調(diào)節(jié)MMP-9的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，而MTSS1蛋白屬于SHh-Gli信號(hào)通路上的一員，其失活變化可通過(guò)激活SHh-Gli信號(hào)通路影響腫瘤的惡性進(jìn)程。本 研 究 顯 示，MTSS1和 MMP-9、Ki-67在 80例TSCC組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)MTSS1的失活可能激活了SHh-Gli信號(hào)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)MMP-9表達(dá)升高并且促進(jìn)TSCC侵襲轉(zhuǎn)移。Ki-67的改變反映了腫瘤細(xì)胞的增殖活性，TSCC中MMP-9和Ki-67表達(dá)率較高的腫瘤細(xì)胞中MTSS1表達(dá)率降低，提示MTSS1在TSCC侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能起到抑制作用。

綜上所述，MTSS1參與了TSCC的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程，與Ki-67和MMP-9的表達(dá)具有一定的相關(guān)性，檢測(cè)MTSS1可作為T(mén)SCC發(fā)展和轉(zhuǎn)移的診斷學(xué)指標(biāo)之一。