張寶俊，馬 超，郭潔心，孫卓楠，張曉杰

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，太谷 030801）

芽胞桿菌Bacillussp.作為一類重要的生防資源，在植物病害微生物防治方面應(yīng)用廣泛。我國(guó)現(xiàn)已登記使用有130余個(gè)芽胞桿菌產(chǎn)品，包括：枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis、解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens、蠟質(zhì)芽胞桿菌Bacillus cereus等近10個(gè)種。以解淀粉芽胞桿菌F727為活性成分開(kāi)發(fā)的Stargus在美國(guó)獲批登記，可用于葡萄、豆科作物、馬鈴薯多種病害的防治[1]。以短小芽胞桿菌BUF-33為主要成分登記的Integral? F?33，主要用于尖孢鐮刀菌和鏈格孢菌引起的多種病害的防治[2]。芽胞桿菌可通過(guò)核糖體途徑合成SubtilosinA、TasA、Subtilin及非核糖體途徑合成Iturin、Surfactin、Fengycin、Bacilysin等多種抗菌物質(zhì)，作用范圍廣，能有效控制植物病害[9]。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)短小芽胞桿菌W-7純化得到Surfactin和Fengycin B物質(zhì)，其中fengycin B可直接抑制致病疫霉菌絲的生長(zhǎng)，而surfactin可誘導(dǎo)馬鈴薯植株的防御反應(yīng)，以控制晚疫病的發(fā)生。Jin等[11]研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽胞桿菌HN-2次生代謝物Bacillomycin D能損傷膠孢炭疽菌菌絲和孢子的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物滲出。

隨著RNA-seq等高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，為在分子水平上分析生防微生物對(duì)植物病原菌的抑菌機(jī)制提供了便利。Laur等[12]對(duì)大麥白粉病菌Blumeria graminisf. sp.hordei與大麥相互作用的轉(zhuǎn)錄分析表明，生防絲狀真菌可以寄生在大麥上，通過(guò)短暫釋放特異效應(yīng)物來(lái)轉(zhuǎn)移病菌汲取的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而起到生防效果。大麗輪枝菌Verticillium dahliae在枯草芽胞桿菌C232抗菌脂肽的作用下，出現(xiàn)菌絲腫脹、細(xì)胞溶解和黑色素合成相關(guān)基因顯著下調(diào)[13]。前期研究表明，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌G-1分泌的脂肽類抗菌物質(zhì)對(duì)番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌等具有良好的拮抗活性[14]，本研究通過(guò)對(duì)其抗菌物質(zhì)的分離鑒定，明確其抗菌物質(zhì)的類型及抑菌活性，并借助轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，在轉(zhuǎn)錄組水平上分析番茄灰霉病菌應(yīng)對(duì)脂肽類抗菌物質(zhì)脅迫的響應(yīng)機(jī)制，有助于生防微生物抑菌機(jī)理及作用靶標(biāo)的研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌G-1（Genbank登錄號(hào)：MT032113）分離自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園丁香樹(shù)莖部，由山西省植物內(nèi)生菌服務(wù)共享平臺(tái)保藏并提供。番茄灰霉病菌Botrytis cinerea由山西省綠色生物農(nóng)藥工程技術(shù)中心保存與提供。

PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，pH 7，蒸餾水定容至1 L。C18反相柱（38 g，粒徑40～63 μm，孔徑60 ?，流速10～25 mL/min），ODS C18柱（Shim-pack PREP-10 μm，20×250 nm）購(gòu)自常州三泰科技有限公司?？?RNA 提取試劑（Trizol）試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript? RT reagent Kit with DNA Eraser）、熒光定量試劑盒（2X SG Fast qPCR Master Mix）等購(gòu)自上海生工工程有限公司。

1.2 菌株G-1抗菌肽的分離、純化

采用鹽酸沉淀、甲醇提取的方法[15]從菌株G-1發(fā)酵液中提取抗菌脂肽粗提物，采用中壓層析分離系統(tǒng)進(jìn)行分離。色譜柱為C18反相柱；流動(dòng)相為去離子水和100%甲醇；洗脫條件為梯度洗脫，200～600 nm全波長(zhǎng)掃描；流速為10 mL/min；進(jìn)樣量為5 mL；柱溫為室溫。采用抑菌圈法測(cè)定各峰洗脫液抑菌活性，將150 μL 1×108cfu/mL的番茄灰霉病菌孢子懸浮液涂布于PDA平板中，用直徑5 mm打孔器打3個(gè)孔（孔間夾角為120°），孔中依次加入80 μL的無(wú)菌水及各峰洗脫液，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后測(cè)定抑菌活性。

采用制備型高效液相色譜對(duì)抗菌活性物質(zhì)進(jìn)行再次洗脫分離，色譜柱為ODS C18柱，流動(dòng)相A液為含0.05% TFA的去離子水，流動(dòng)相B液為100%甲醇；洗脫程序?yàn)榧状?水（v:v=1:4～4:1），線性梯度洗脫45 min，在211 nm波長(zhǎng)檢測(cè)；流速為1 mL/min；柱溫30 ℃。按峰收集濃縮，甲醇溶解后采用抑菌圈法測(cè)定各峰洗脫液的抑菌活性。

1.3 菌株G-1抗菌肽的鑒定

采用Thermo Fisher液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)分離的抑菌物質(zhì)進(jìn)行鑒定。液相條件：流動(dòng)相為甲醇和含0.1% TFA的去離子水；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；洗脫為10%～90%甲醇梯度洗脫45 min；分子量掃描范圍為500～2000 Da。

1.4 菌株G-1抗菌肽抑制番茄灰霉病菌的顯微觀測(cè)

用直徑5 mm打孔器打取3個(gè)番茄灰霉病菌菌餅，將其接種于100 mL PDB培養(yǎng)液中，25 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，加入1.2獲得的抑菌活性物質(zhì)1 mL，分別在處理3和5 d時(shí)挑取病菌菌絲，無(wú)菌水清洗2～3次后，4 ℃、8000 r/min離心10 min收集菌體。一份置于2.5%戊二醛固定液中固定，0.1 mol/L（pH 7.4）磷酸緩沖液漂洗3遍，30%～100%乙醇梯度脫水，經(jīng)冷凍干燥、噴金處理后在掃描電鏡下觀察菌絲的形態(tài)變化。一份液氮速凍并置于-80 ℃保存用于后續(xù)試驗(yàn)。以在PDB培養(yǎng)5 d的番茄灰霉病菌菌絲為對(duì)照，3次重復(fù)。

1.5 抗菌肽抑制番茄灰霉病菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析

采用RNA提取試劑盒（Trizol）提取番茄灰霉病菌菌絲總RNA，檢測(cè)合格后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建cDNA文庫(kù)后，由北京百邁克生物科技有限公司使用Illumina HiSeq平臺(tái)完成轉(zhuǎn)錄測(cè)序與分析。原始序列（Raw Read）經(jīng)過(guò)濾，去除接頭、無(wú)效堿基大于5%及低質(zhì)量的Reads得到Clean Reads。使用TopHat2軟件將得到的Clean Reads與葡萄孢菌基因組序列（GCF_000143535.2，參考基因組來(lái)源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/494）進(jìn)行比對(duì)，獲得Mapped Reads用于表達(dá)量計(jì)算[16]。利用DESeq,軟件進(jìn)行DEGs篩選，篩選條件：FDR＜0.05 & |log2FC(Fold Change)|≥1。利用COG、GO、KEGG、NR、Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Unigene進(jìn)行基因功能注釋。在BMKCloud（www.biocloud.net）平臺(tái)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行顯著性富集分析。

1.6 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

隨機(jī)挑選差異表達(dá)基因8個(gè)，根據(jù)cDNA序列設(shè)計(jì)、合成qRT-PCR引物（表1），以cDNA為模板建立擴(kuò)增體系，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約90～140 bp。采用熒光定量試劑盒2×SG Fast qPCR預(yù)混液進(jìn)行驗(yàn)證，反應(yīng)體系為 20 μL：2×SG Fast qPCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L Forward Primer 0.4 μL，10 μmol/L Reverse Primer 0.4 μL，DNF Buffer（Optional）2 μL，cDNA1 μL，PCR-grade water 補(bǔ)足至 20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性7 min，95 ℃變性30 s，55 ℃～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，40個(gè)循環(huán)。以Actin基因作為內(nèi)參基因，基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算方法采用2-△△CT法。

表1 qRT-PCR驗(yàn)證基因選擇及引物設(shè)計(jì)Table 1 Gene selection and primer design for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株G-1抗菌肽分離結(jié)果

菌株G-1抗菌粗提物經(jīng)中壓層析分離、HPLC純化，共檢測(cè)到5個(gè)吸收峰（圖1）。將洗脫液濃縮回收后，發(fā)現(xiàn)僅峰3有較好的抑菌活性，抑菌圈達(dá)41 mm，其余峰無(wú)明顯抑菌效果，表明菌株G-1主要的抗菌物質(zhì)基本得到純化（圖2）。

圖1 菌株G-1脂肽物質(zhì)HPLC分離圖譜Fig. 1 The HPLC purification map of the lipopeptide material from strain G-1

圖2 各吸收峰對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌活性Fig. 2 The antifugnal activity of each absorption peak against B. cirere

2.2 抗菌肽LC-MS分析

LC-MS分析結(jié)果表明，在保留時(shí)間29.08和29.38 min出現(xiàn)較強(qiáng)的吸收峰（圖3）。質(zhì)譜分析結(jié)果表明，保留時(shí)間為29.08 min時(shí)，碎片離子質(zhì)核比為（m/z）為1043.55、1065.53、1081.51，并且離子峰分子量之間分別相差22和16，其規(guī)律同脂肽化合物中C14 IturinA的理論分子量及相應(yīng)離子質(zhì)核比1043.5508（C14 iturin [M+H]+）、1065.5328（C15 iturin [M+Na]+）、1081.5067（C16 iturin [M+K]+）相同，表明菌株G-1產(chǎn)生的抗菌脂肽類物質(zhì)主要為Iturin A類（圖4）。

圖3 甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌G-1脂肽抗菌物質(zhì)色圖譜Fig. 3 UPLC-ESI -MS TICs of antimicrobial lipopeptide antimicrobial material of B. methylotrophicus G-1

圖4 甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌G-1脂肽抗菌物質(zhì)保留時(shí)間29.08 min時(shí)MS圖譜Fig. 4 The MS chromatograms of antimicrobial lipopeptide of B. methylotrophicus G-1 at the retention time of 29.08 min

2.3 抗菌肽對(duì)番茄灰霉病菌菌絲的影響

掃描電鏡觀測(cè)結(jié)果表明，對(duì)照組灰霉病菌菌絲表面光滑，細(xì)胞壁完整（圖5A），抗菌肽處理菌絲3 d后，灰霉病菌菌絲細(xì)胞壁發(fā)生穿孔、破裂現(xiàn)象（圖5B）；處理5 d后，部分菌絲表面皺縮、部分畸形腫脹，胞內(nèi)物質(zhì)外溢，甚至出現(xiàn)菌絲消融現(xiàn)象（圖5C）。

圖5 抗菌肽處理番茄灰霉病菌后掃描電鏡圖Fig. 5 Scanning electron micrographs of B. cinerea treated with antimicrobial peptides

2.4 轉(zhuǎn)錄組組裝與注釋

利用Illumina 2×150 bp雙端測(cè)序共測(cè)得149671736條Reads，產(chǎn)生22.33 Gb數(shù)據(jù)。經(jīng)Trinity從頭組裝得到12207條轉(zhuǎn)錄本，與基因功能注釋數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果表明，12084條在NCBI的非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)（NR）中可注釋到（98.99%）；4173條在蛋白質(zhì)直系同源簇（COGs）數(shù)據(jù)庫(kù)可注釋到（34.19%）、6230條在基因本體論（GO）數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋（51.04%），3169條在 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG）中得到注釋（25.96 %），6179條注釋到SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)中（50.62 %）（表2）。

表2 基因功能注釋統(tǒng)計(jì)表Table 2 Statistical table of gene function annotation

在3個(gè)轉(zhuǎn)錄組樣品的GO功能注釋中，共有28135條Unigene得到注釋，其中8284條Unigene注釋到細(xì)胞組分，其中“cell”和“cell part”注釋的占比最高，分別為21.17%和21.19%，其次 “membrane”、“membrane part”分別占18.86%和18.32%，而“extracellular region part”注釋到的Unigene只有1個(gè)，占比最低為0.01%；分子功能中注釋比例較高的是“catalytic activity”和“binding”分別為 47.30%和 37.28%，注釋比例最低的為“protein tag”僅占0.01%；有7671個(gè)Unigene注釋到分子功能中，12180個(gè)Unigene在生物學(xué)過(guò)程中得到注釋（圖6）。在生物學(xué)過(guò)程分類中，有4167個(gè)Unigene 注釋到“metabolic process”中，占 34.21%為最高，“rhythmic process”注釋到的Unigene僅有1個(gè)。

圖6 GO功能注釋Fig. 6 GO function annotation classification

2.5 轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因比較分析

以FDR＜0.05、|log2FC|≥1作為篩選條件進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選結(jié)果表明，CK vs 3 d的DEGs數(shù)目有90個(gè)，其中上調(diào)基因35個(gè)，下調(diào)基因55個(gè)；CK vs 5 d的DEGs 數(shù)目有1831個(gè)，其中上調(diào)基因1058個(gè)，下調(diào)基因773個(gè)；3 d vs 5 d的DEGs 數(shù)目有1692個(gè)，其中上調(diào)基因928個(gè)，下調(diào)基因764個(gè)。且抗菌肽處理番茄灰霉病菌后共有40個(gè)基因在2個(gè)時(shí)期均差異表達(dá)，其中與萜烯合酶、氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的 15個(gè)基因在各時(shí)期均上調(diào)表達(dá)，與細(xì)胞表面受體信號(hào)通路、氧化還原酶、果膠裂解酶、單加氧酶等有關(guān)的25個(gè)基因均下調(diào)表達(dá)（圖7）。

圖7 差異表達(dá)基因維恩圖Fig. 7 Venn diagram of differentially expressed genes

2.6 差異表達(dá)基因GO及KEGG功能富集分析

將篩選的40個(gè)unigenes在GO蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行聚類，在生物學(xué)過(guò)程中有15個(gè)差異表達(dá)基因顯著富集，23個(gè)差異表達(dá)基因在分子功能中顯著富集，在細(xì)胞組分中僅有3個(gè)差異表達(dá)基因被富集。從40對(duì)差異表達(dá)基因中篩選了8個(gè)相關(guān)候選基因，其中調(diào)控3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶合成的Bcin04g04450基因、與P450單加氧酶活性相關(guān)的Bcin01g00020基因、細(xì)胞表面受體信號(hào)通路相關(guān)的Bcin04g03050基因、與果膠裂解酶活性Bcin03g05820基因、氧化還原Bcin04g05700基因、與血紅素相關(guān)Bcin01g0003基因均下調(diào)表達(dá)；與氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的Bcin08g04970基因、與萜烯合酶活性相關(guān)的Bcin01g03520基因上調(diào)表達(dá)（圖8）。

圖8 差異表達(dá)基因的GO富集分析Fig. 8 GO enrichment analysis of differentially expressed genes

KEGG功能富集分析表明，Bcin04g04450基因參與到丁酸代謝（ko00650）、酮體的合成與降解（ko00072）、萜類骨架生物合成（ko00900）、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解（ko00280）等 4條代謝通路中，Bcin03g05820基因參與戊糖與葡萄糖醛酸酯的相互轉(zhuǎn)化（ko00040）（圖9）。

圖9 差異表達(dá)基因的Pathways富集分析Fig. 9 Pathways enrichment analysis of differentially expressed genes

2.7 候選基因表達(dá)水平的qRT-PCR驗(yàn)證

通過(guò) FPKM 值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，Bcin04g04450、Bcin01g00030、Bcin01g00040、Bcin03g05820、Bcin04g03050、Bcin04g05700、Bcin01g03520和Bcin08g04970基因在整個(gè)抗菌肽處理灰霉病菌的不同時(shí)均差異表達(dá)。以Actin基因?yàn)閮?nèi)參，采用qRT-PCR對(duì)篩選的8對(duì)候選基因進(jìn)行驗(yàn)證（圖10），將RNA-seq和qRT-PCR中差異基因變化倍數(shù)均Log2轉(zhuǎn)化后進(jìn)行比較，結(jié)果表明兩組數(shù)據(jù)R2達(dá)0.7144， 被檢測(cè)基因在3、5 d時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量與DGE分析結(jié)果具有相似的表達(dá)趨勢(shì)（圖11）。

圖10 基因表達(dá)水平及qRT-PCR 驗(yàn)證結(jié)果Fig. 10 Gene expression levels and qRT-PCR validation results

3 討論

芽胞桿菌可以產(chǎn)生Surfactin、Iturin及Fengycin等多種抗菌脂肽類物質(zhì)[17]，可通過(guò)抑制病原菌細(xì)胞壁組分的生物合成，降低真菌細(xì)胞膜表面的張力，形成微孔，促使K+及其他重要離子的滲漏等方式，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[18,19]。Rong等[20]從沙福芽胞桿菌Bacillus safensis中分離得到Iturin A2和Iturin A6 2種抗真菌化合物，可通過(guò)改變菌絲的膜透性而抑制菌絲的生長(zhǎng)。本研究從甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌G-1發(fā)酵液中純化得到的抗菌脂肽經(jīng)LC-MS分析鑒定為Iturin A，掃描電鏡觀測(cè)發(fā)現(xiàn)G-1抗菌肽處理番茄灰霉病菌后菌絲發(fā)生畸形腫脹，大量?jī)?nèi)溶物外滲，表明G-1菌株抑菌物質(zhì)可破壞灰霉病菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的完整性來(lái)達(dá)到抑制或殺菌的效果。

為揭示番茄灰霉病菌受到甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌脅迫后基因表達(dá)特征的變化，本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)有40個(gè)基因在3、5 d時(shí)期均差異表達(dá)，其中與萜烯合酶、氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的15個(gè)基因在各時(shí)期均上調(diào)表達(dá)，與細(xì)胞表面受體信號(hào)通路、氧化還原酶、果膠裂解酶、單加氧酶等有關(guān)的 25個(gè)基因在各時(shí)期均下調(diào)表達(dá)。KEGG代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，下調(diào)表達(dá)基因Bcin02g06840和Bcin04g04450分別參與了琥珀酸、甲羥戊酸的形成，其中Bcin02g06840基因編碼琥珀脫氫酶（SDH），Bcin04g04450基因編碼3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶A還原酶（HMGR）。

研究表明，琥珀酸脫氫酶（SDH）是線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅱ中的關(guān)鍵酶，是三羧酸循環(huán)中可以與內(nèi)膜結(jié)合的酶蛋白，可為生物體生長(zhǎng)發(fā)育提供能量。甾醇調(diào)節(jié)膜的流動(dòng)性和某些膜蛋白的功能，HMGR是甾醇生物合成的限速酶，可作用于3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶A（HMG-CoA）還原生成甲羥戊酸，甲羥戊酸是真菌合成麥角甾醇（ERG）的重要前體[21,22]，而麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜必需的脂質(zhì)組分，在維持細(xì)胞膜的完整性、流動(dòng)性中起關(guān)鍵作用。楊智娟[23]構(gòu)建了大豆疫霉琥珀酸脫氫酶A亞基PsSDHA基因的沉默表達(dá)載體，該基因沉默轉(zhuǎn)化菌株菌絲形態(tài)發(fā)生變異，菌絲生長(zhǎng)速率、孢子囊的形成、游動(dòng)孢子釋放速度明顯下降。Basson[24]、Croxen[25]分別將釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae、玉米黑穗菌Ustilago maydis中的 HMGR序列敲除后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞不能正常進(jìn)行孢子萌發(fā)和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。田雪亮等[26]在轉(zhuǎn)錄組水平上揭示玉米大斑病菌Setosphaeria turcica對(duì)解淀粉芽胞芽胞桿菌脅迫的響應(yīng)機(jī)制，揭示了玉米大斑病菌可通過(guò)調(diào)節(jié)葡聚糖生物合成途徑、麥角固醇合成途徑等相關(guān)基因的表達(dá)以響應(yīng)芽胞桿菌環(huán)脂肽類抗菌物質(zhì)的脅迫作用。因此，推測(cè)甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌 G-1抗菌肽可能抑制 SDH的生物合成，致使多聚葡聚糖的合成和能量代謝受阻，或通過(guò)降低HMGR的活性，使得下游麥角固醇的合成受阻，導(dǎo)致番茄灰霉病菌生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)孢能力下降。

本研究在轉(zhuǎn)錄組水平揭示了番茄灰霉病菌對(duì)甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌抗菌肽脅迫的響應(yīng)機(jī)制，將有助于生防微生物抑菌機(jī)理及作用靶標(biāo)的研究。但 HMGR作為次生代謝的重要調(diào)控因子，缺失后是否影響麥角固醇產(chǎn)量，麥角固醇作為細(xì)胞質(zhì)膜合成的主要物質(zhì)，其變化是否影響番茄灰霉病菌細(xì)胞膜形態(tài)和功能等有待進(jìn)一步研究。