郭依依,吳崢,馬天穎,蔡俊*

1(發(fā)酵工程教育部重點實驗室(湖北工業(yè)大學),湖北 武漢,430068) 2(工業(yè)微生物湖北省重點實驗室(湖北工業(yè)大學),湖北 武漢,430068)

甲殼素(C8H13O5N)n,又稱幾丁質,是存在于各類甲殼動物的外殼及真菌細胞壁中的一種難溶的N-乙酰-D-葡萄糖胺聚合物。甲殼素脫乙酰率達到55%及以上即為殼聚糖,殼聚糖廣泛應用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、漁業(yè)、醫(yī)療產(chǎn)業(yè)等領域,尤其在生物醫(yī)學領域,由于其良好的生物相容性,在組織工程、創(chuàng)傷愈合、生物傳感器上有很好的應用前景[1-3]。

甲殼素脫乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)是專一性的用于甲殼素脫去乙?；拿?它可代替現(xiàn)有的濃堿熱解法,生產(chǎn)出化學法無法得到的某些高質量的殼聚糖[4-5]。紅球菌屬(Rhodococcus)是一類呈短桿狀、不產(chǎn)孢子、革蘭氏染色呈陽性的細菌,可由甲殼素誘導產(chǎn)CDA[6-7]。但研究發(fā)現(xiàn),由于天然大分子甲殼素水溶性低,暴露的乙?；鶊F過少,導致紅球菌無法高效利用天然大分子甲殼素,從而造成酶活力低,應用價值不高[1-2,7-9]。本文作者發(fā)現(xiàn),將蠟狀芽胞桿菌與紅球菌混合培養(yǎng)時,培養(yǎng)基中的膠體甲殼素降解速度明顯增快,對發(fā)酵液的脫乙酰酶活力測定結果顯示,酶活力得到了極大的提高。本文將2株菌進行混合發(fā)酵,以單菌發(fā)酵為對比,同時監(jiān)測甲殼素酶和CDA的酶活力變化,并對兩菌的混合時間、接種量配比及發(fā)酵條件等單因素進行優(yōu)化,并進一步設計Plackett-Burman(PB)實驗、中心組合設計(central composite design,CCD)實驗和響應面優(yōu)化實驗確定適宜兩菌株協(xié)同發(fā)酵的培養(yǎng)基中各成分的水平,為工業(yè)化生產(chǎn)CDA提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種及培養(yǎng)基

實驗菌株：RhodococcusHQcdag從潛江市蝦池土壤中篩選得到,并經(jīng)16S rRNA鑒定;BacilluscereusCJPE209為本實驗室保存菌株。

活化培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10,牛肉膏3,NaCl 5,瓊脂 20,pH 6.6。

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10,牛肉膏3,NaCl 5,瓊脂 20,pH 6.6。

富集培養(yǎng)基(g/L)：膠體甲殼素5,NaCl 8,K2HPO40.5,KH2PO41,MgSO40.5,pH 6.8。

篩選培養(yǎng)基(g/L)：膠體甲殼素5,NaCl 8,K2HPO40.5,KH2PO41,MgSO40.5,對硝基乙酰苯胺0.2,瓊脂20,pH 7。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：膠體甲殼素5,酪蛋白2,酵母浸粉2,NaCl 8,K2HPO40.5,KH2PO41,MgSO40.5,pH 6.8。

優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨2.5,K2HPO40.6,MgSO41.5,酵母浸粉3.0,NaCl 8.5,KH2PO40.8,膠體甲殼素8.0。

1.1.2 實驗材料

甲殼素,上海源葉生物有限公司；對硝基乙酰苯胺,上海麥克林生化科技有限公司；膠體甲殼素,自制。

1.1.3 儀器與設備

FW100高速萬能粉碎機,天津市泰斯特儀器有限公司；YXQ-LS—75211型立式壓力蒸汽滅菌器,上海博迅實業(yè)有限公司；HH-S型水浴鍋,鞏義市矛華儀器有限公司；ZSD-1270型全自動生化培養(yǎng)箱,上海智誠分析儀器制造有限公司；TG16-II,高速離心機長沙平凡儀器儀表有限公司；SYNERGY2酶標儀,Gene Company Limited；ZHWY系列雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器,中國科學院武漢科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 雙菌株協(xié)同作用驗證

將蠟狀芽胞桿菌和紅球菌37 ℃分別培養(yǎng)24 h制備種子液,將其單獨和按活菌數(shù)1∶1接種于基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r/min發(fā)酵36 h,同時監(jiān)測CDA酶和甲殼素酶的酶活力變化,采用變色圈法[9-10]測定CDA的酶活力,甲殼素酶活力用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法測定[11]。

1.2.2 雙菌株協(xié)同發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.2.1 菌種活化

分別測定兩菌株的生長曲線,確定其最佳的混合接種時間。

1.2.2.2 種子液的配比優(yōu)化

根據(jù)測定的兩菌株的生長曲線,取兩菌株的生長對數(shù)期用血球計數(shù)法測定活菌數(shù),然后按一定數(shù)量比例(10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10)換算成體積比同時接入基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵。以對硝基乙酰苯胺為底物,用分光光度法測定酶活力。

1.2.2.3 PB實驗設計

發(fā)酵條件優(yōu)化：由上述實驗所得種子液最佳配比,在其他條件不變的前提下,依次改變發(fā)酵周期、發(fā)酵溫度、發(fā)酵轉速、裝液量、接種量5因素的水平,用分光光度法測定酶活力,確定促進產(chǎn)酶的最適條件。

發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化：由上述實驗所得最佳發(fā)酵條件,在其他條件不變的前提下,依次改變基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源、無機鹽等,確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組分。在單因素實驗的基礎上,將上述所得發(fā)酵培養(yǎng)基組分根據(jù)PB設計正交實驗,篩選出影響酶活力的顯著性因子[7,12-14],實驗的因素水平如表1所示,CDA的酶活力(Y)作為響應值。

表1 Plackett-Burman實驗設計因素與水平 單位：g/L

1.2.2.4 響應面實驗設計

基于PB實驗的結果,根據(jù)CCD中心組合設計原理,以酵母浸粉(X2),NaCl(X3),KH2PO4(X5),膠體甲殼素(X7)4個因素為自變量,以酶活力為響應值,設計4因素5水平響應面實驗,因素水平如表2所示[7,12-14]。

表2 CCD設計試驗的因素與水平 單位：g/L

1.2.2.5 數(shù)據(jù)處理

每個指標重復測定3次,采用Design Expert 8.0軟件進行PB實驗、CCD實驗、響應面實驗設計及其數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 雙菌株協(xié)同發(fā)酵效果驗證

由圖1可知,蠟狀芽胞桿菌單獨發(fā)酵時只產(chǎn)甲殼素酶,紅球菌單獨發(fā)酵只產(chǎn)CDA,但酶活力并不太高。兩菌混合發(fā)酵時CDA的活力在24 h時最高,比紅球菌單獨發(fā)酵提前了約12 h,且最高點約為其單獨發(fā)酵的10倍。此外,混合發(fā)酵時甲殼素酶的活力與桿菌單獨發(fā)酵相比也有所提高。可見,甲殼素酶和CDA共同作用,不僅提高了底物膠體甲殼素的降解速率和效果,還對各自酶的產(chǎn)生有促進作用。

圖1 菌株B.cereus、Rhodococcus和兩菌混合發(fā)酵過程中甲殼素酶和甲殼素脫乙酰酶酶活力的變化Fig.1 Effects of culture time on activity of chitin deacetylase and chitinase during B.cereus,Rhodococcus and co-fermentation

2.2 雙菌株協(xié)同發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 菌種活化

兩菌株活化后所測生長曲線如圖2所示,由于生長對數(shù)期的細菌生長旺盛,產(chǎn)酶活力強。因此選取皆處于兩菌株生長對數(shù)期的第20 h的種子液,將兩菌按比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。

圖2 菌株B.cereus和Rhodococcus的生長曲線Fig.2 Growth curve of strain B.cereus and Rhodococcus

2.2.2 種子液優(yōu)化

由圖3可知,蠟狀芽胞桿菌單獨發(fā)酵時CDA的酶活力為1.43 U,可忽略不計。紅球菌單獨發(fā)酵時,CDA的酶活力為19.47 U,經(jīng)過混合發(fā)酵后,發(fā)酵液中的酶活力大幅提升。而當配比為蠟狀芽胞桿菌∶紅球菌=2∶8時,發(fā)酵液中的CDA的酶活力達到最高值,為226.27 U,然后隨著蠟狀芽孢桿菌比例的增加而逐漸降低。這意味著協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)酶的過程是以紅球菌為主導,在此過程中借助蠟狀芽胞桿菌分泌的糖苷酶對底物甲殼素的糖鏈進行水解,使其更易被紅球菌利用或其他方式使得酶活力大幅提升。而桿菌比重逐漸增大后,培養(yǎng)液的酶活力呈現(xiàn)下降趨勢,很可能是由于桿菌擠壓了球菌的生存空間導致。

圖3 菌株B.cereus和Rhodococcus的接種比例對酶活力的影響Fig.3 Effects of ratio of B/R on activity of chitin deacetylase

2.3 單因素實驗結果

2.3.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化

發(fā)酵條件優(yōu)化結果表明,促進產(chǎn)酶的最佳單因素條件分別為發(fā)酵周期24 h,發(fā)酵溫度35 ℃,轉速160 r/min,裝液量50 mL/250 mL,接種量3%。發(fā)酵條件的交互影響較小,因此,在確定發(fā)酵條件的基礎上,再對發(fā)酵培養(yǎng)基的成分進一步優(yōu)化。

2.3.2 PB實驗設計結果

PB實驗的分析結果如表3所示,模型具有高度的顯著性,失擬項不顯著。其中酵母浸粉(X2)、NaCl(X3)、KH2PO4(X5)和膠體甲殼素(X7)的P值在5%水平上是顯著的,這說明酵母浸粉、NaCl、KH2PO4和膠體甲殼素是促進CDA產(chǎn)生的顯著影響因素。

表3 PB設計試驗的回歸分析Table 3 Regression analysis for the PB design

2.3.3 響應面實驗設計結果

表4 CCD設計試驗與結果Table 4 Experiment design and results of CCD

表5 響應面二次式模型的方差分析表Table 5 ANOVA table of response surface quadratic model

續(xù)表5

通過軟件對回歸方程中的X2X5、X2X7、X3X7、X5X7交互項繪制響應面分析圖,結果如圖4所示。用方程預測的結果表明,酵母浸粉3.0 g/L、NaCl 8.5 g/L、KH2PO40.8 g/L、甲殼素8.0 g/L是CDA生產(chǎn)的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成,與表4中的運行結果一致。

a-酵母浸粉和KH2PO4；b-酵母浸粉和膠體甲殼素；c-NaCl和膠體甲殼素；d-KH2PO4和膠體甲殼素圖4 不同因素的交互作用對混合菌株發(fā)酵產(chǎn)CDA的影響響應面圖Fig.4 Response surface contour plots of CDA production by complex bacteria optimization of variables

3 結論

本文發(fā)現(xiàn)了蠟狀芽孢桿菌和紅球菌混合發(fā)酵,可大幅提高CDA產(chǎn)量的現(xiàn)象,并測得兩菌株接種量最佳配比為2∶8,相比紅球菌單獨發(fā)酵酶活力提升了約12倍。對混合發(fā)酵產(chǎn)CDA的培養(yǎng)基條件進行響應面優(yōu)化。響應面實驗結果表明,兩菌協(xié)同發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)組分為：蛋白胨0.25 g/L、K2HPO40.6 g/L、MgSO41.5 g/L、酵母浸粉3.0 g/L、NaCl 8.5 g/L、KH2PO40.8 g/L、膠體甲殼素8.0 g/L。優(yōu)化后菌株產(chǎn)CDA的活力約為優(yōu)化前的1.96倍。

天然甲殼素由于其高度延伸的氫鍵半晶結構使其難以溶于一般的稀酸、稀堿及有機溶劑,在沒有經(jīng)過處理的情況下難以被CDA作用[2,15-18]。有文獻表明,在預先使用類似糖苷酶的多糖裂解單加氧酶氧化裂解甲殼素原纖維表面上的糖鏈后,其晶體內(nèi)部的乙酰基暴露出來,大大加快了CDA后續(xù)的脫乙酰進程[16,19-20]。根據(jù)文獻提示,蠟狀芽胞桿菌可產(chǎn)多種糖苷酶(如甲殼素酶),因此產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因很可能是由于蠟狀芽胞桿菌產(chǎn)生的甲殼素酶通過作用于糖鏈的糖苷鍵,使甲殼素分子鏈長度減小并破壞其晶態(tài)結構,內(nèi)部乙酰基暴露從而更易被CDA作用的同時誘導紅球菌產(chǎn)生更多的CDA[1,15-17,21]。

作者已驗證了蠟狀芽胞桿菌中甲殼素酶基因(CP028009.1)和紅球菌中甲殼素脫乙酰酶基因(MH244430.1)的存在。下一階段將通過對其及殼聚糖酶(CP029454.1)、甲殼二糖酶(CP001176.1)等甲殼素酶系基因的轉錄水平分析,來進一步揭示雙菌株協(xié)同降解甲殼素,并促進紅球菌產(chǎn)脫乙酰酶的機理。同時作者也在進一步研究誘導紅球菌產(chǎn)脫乙酰酶的物質,實驗發(fā)現(xiàn),蠟狀芽胞桿菌單獨發(fā)酵滅菌后的培養(yǎng)液仍能誘導紅球菌產(chǎn)脫乙酰酶。因此下一階段將對該菌株發(fā)酵甲殼素的產(chǎn)物進行檢測和分離,并對紅球菌做產(chǎn)酶誘導實驗。但發(fā)酵液中成分復雜,要準確的分析出發(fā)酵液中產(chǎn)酶誘導物的組分,對于其純化制備的精度和產(chǎn)量有著很高的要求。