沈弘洋,鄧微,趙云珠,陳丹丹,王夢竹,劉國彥,劉俊梅,陳海燕

1(吉林農業(yè)大學 食品科學與工程學院,吉林 長春,130118)2(吉林省田野泉釀造有限公司,吉林 長春,130507) 3(擺渡創(chuàng)新工廠集團有限公司,吉林 長春,130012)4(長春科技學院,吉林 長春,100300)

傳統(tǒng)大豆醬是中國的四大發(fā)酵豆制品之一[1],以大豆為原料,經過蒸煮、制醅、晾曬、前發(fā)酵、鹽封固態(tài)發(fā)酵和后發(fā)酵等工序加工而成,采用自然發(fā)酵,保留了傳統(tǒng)大豆醬獨特的風味。其中前發(fā)酵階段是將大豆浸泡、蒸煮和擠壓后制成長方體的醬醅,置于發(fā)酵室中進行為期約2個月的自然發(fā)酵,在此階段主要是霉菌分泌多種酶類發(fā)揮主要作用；低鹽固態(tài)發(fā)酵階段,是將發(fā)酵室中成熟的醬醅刷洗粉碎后放入發(fā)酵桶中,加入鹽度為(20±1)°B的鹽水混合均勻再繼續(xù)發(fā)酵3個月左右,此階段中霉菌基本停止生長,耐鹽乳酸菌和酵母菌開始大量繁殖,可發(fā)酵糖被代謝生成乙醇、乳酸乙酯和乙酸乙酯等香氣物質[2],賦予傳統(tǒng)大豆醬獨特的風味。本研究采用Illumina MiSeq測序技術對傳統(tǒng)大豆醬前發(fā)酵階段和低鹽固態(tài)發(fā)酵階段進行細菌和真菌群落結構的分析,明確在不同發(fā)酵階段中發(fā)揮主要作用的微生物,有利于挖掘功能性菌株,縮短發(fā)酵時間,改善傳統(tǒng)大豆醬的風味。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

傳統(tǒng)大豆醬由吉林省田野泉釀造有限公司提供,對同一發(fā)酵室2個不同發(fā)酵階段的5個時間節(jié)點的傳統(tǒng)大豆醬進行取樣,第1個階段為醬醅放入發(fā)酵室的第1天(A),醬醅發(fā)酵的中間時間節(jié)點30 d(B)和在發(fā)酵室的最后一天50 d(C),稱之為前發(fā)酵階段；第2個階段為醬醅刷醬粉碎后加入鹽水進入低鹽固態(tài)發(fā)酵階段的起始點75 d(D)和結束點165 d(E),在每個時間節(jié)點取5個平行樣品共25個樣品,分別標記為A1～A5、B1～B5、C1～C5、D1～D5、E1～E5,樣品無菌采集后立即置于-20 ℃冰箱中保藏待用。

表1 材料信息Table 1 Material information

M0491L-Q5?High-Fidelity DNA Polymerase擴增聚合酶,美國紐英倫生物技術有限公司；P7589-Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit熒光定量染料、75510-019-Agarose瓊脂糖凝膠試劑、AM9870-TAE瓊脂糖凝膠電泳緩沖液,美國英杰公司；DL2000-DNA Marker,日本寶生物股份有限公司。

1.2 儀器與設備

2720 PCR儀,美國應用生物系統(tǒng)公司；FLX800T酶標儀,美國伯騰儀器(BioTek)有限公司；DYY-6C電泳儀,北京六一生物科技有限公司；BG-gdsAUTO 130型凝膠成像系統(tǒng),北京百晶生物技術有限公司；高通量測序平臺,美國Illumina公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 傳統(tǒng)大豆醬不同發(fā)酵階段微生物多樣性測定

將采集的5個不同發(fā)酵時間段的大豆醬樣本,每個樣本5個平行,送至上海派森諾生物科技股份有限公司進行測定。測定流程主要包括：微生物組總DNA的提取,對細菌使用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCGCAGCA-3′)和806R(5′-GG-ACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴增16S rRNA基因的V3～V4結構域。真菌使用內部轉錄間隔區(qū)ITS區(qū)用引物ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS1(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)擴增。將擴增產物進行回收純化,熒光定量處理,使用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library prep Kit進行測序文庫的制備,上機進行高通量測序。

1.3.2 生物信息分析

采用Illumina平臺對群落DNA片段進行雙端(Paired-end)測序,使用QIIME2(2019.4)對測序原始數(shù)據(jù)進行分析處理,得到有效序列；通過UCLUST序列比對工具,對獲得的序列按97%的序列相似度進行歸并和操作分類單元數(shù)(operational taxonomic unit,OTU)劃分,并選取每個OTU中豐度最高的序列注釋；利用R語言工具繪制各分類水平下的微生物多樣性群落結構圖,對各樣本在不同分類水平上的群落結構進行分析。

2 結果與分析

2.1 傳統(tǒng)大豆醬不同發(fā)酵階段微生物多樣性分析

2.1.1 傳統(tǒng)大豆醬α多樣性分析

α多樣性是以Chao1指數(shù)表征豐富度,以Shannon和Simpson指數(shù)表征多樣性,以coverage指數(shù)表征覆蓋度[3]。本研究得到的傳統(tǒng)大豆醬不同發(fā)酵階段微生物群落α多樣性指數(shù)詳情見表2。

通過測序,去除嵌合體后序列量,得到的高質量序列量,16S rRNA 測序得到 1 795 797條高質量的序列,ITS 結果共得到2 615 938條高質量的序列。Chao1指數(shù)越大,說明群落豐富度越高[4],本研究結果中細菌的 Chao 1指數(shù)均比真菌高很多,說明傳統(tǒng)大豆醬發(fā)酵過程中主要優(yōu)勢菌群是細菌,所有豆醬樣品coverage指數(shù)都在99.71%以上,這表明樣品中菌群型基本被鑒定出來。

表2 傳統(tǒng)大豆醬α多樣性分析Table 2 α-diversity index of bacteria and fungi in traditional soybean pastes

2.1.2 傳統(tǒng)大豆醬不同發(fā)酵階段微生物多樣性Venn圖分析

Venn圖中1個圓圈代表1組樣本,不同的顏色代表不同的分組。由圖1-a可知,不同分組間細菌群落共有OTU數(shù)為20,獨有的OTU數(shù)量分別為320、805、599、554和1 072。由圖1-b可知,不同分組間真菌群落共有OTU數(shù)為27,獨有的OTU數(shù)量分別為20、86、62、143和131。其中,細菌在A時獨有的OTU數(shù)最少,在E時最多。真菌OTU數(shù)在A時最少,在D時最多。

在前發(fā)酵階段,細菌和真菌OTU數(shù)呈現(xiàn)的趨勢相同,在B(30 d)時最多；但在低鹽固態(tài)發(fā)酵階段D(75 d)和E(165 d)中,E時的細菌OTU數(shù)高于D,但真菌OTU數(shù)不及E時,可能由于在低鹽固態(tài)發(fā)酵階段,高的食鹽含量使得豆醬的水分活度降低,微生物生長受到抑制,一些厭氧耐高滲透壓的細菌適應了環(huán)境細菌迅速增長[5-6],使得好氧性真菌數(shù)量下降。

a-細菌；b-真菌圖1 傳統(tǒng)大豆醬細菌和真菌Venn圖分析Fig.1 Venn diagram analysis of traditional soybean paste

由圖2可知,細菌第一主成分(PC1)貢獻率為35.3%,第二主成分(PC2)的貢獻率為25.9%；真菌的第一主成分(PC1)貢獻率和第二主成分(PC2)的貢獻率分別為46.7%和36.4%。傳統(tǒng)東北大豆醬5個不同發(fā)酵時間的樣品細菌豐富度整體相對分散,說明不同發(fā)酵階段細菌群落結構具有差異性,但是D、E相對較近,有重疊現(xiàn)象出現(xiàn),說明鹽封入缸半固態(tài)發(fā)酵階段細菌群落結構具有相似性；而真菌在 B和C、D與E相對較近,即發(fā)酵30和50 d(發(fā)酵室醬醅階段)、75 和165 d(鹽封入缸半固態(tài)發(fā)酵階段)可說明在同一環(huán)境下真菌群落非常相似。

2.2 傳統(tǒng)大豆醬不同發(fā)酵階段微生物群落組成分析

2.2.1 細菌群落結構分析

根據(jù)物種注釋結果,從微生物分類門的水平上來看,細菌門主要包括厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)等。其中厚壁菌門在不同發(fā)酵階段中占比均較高。

從微生物分類屬水平上來看,不同的發(fā)酵階段有不同的優(yōu)勢細菌屬,但在所有樣品中芽孢桿菌屬(Bacillus)均存在。在傳統(tǒng)大豆醬發(fā)酵1 d時,主要細菌屬有芽胞桿菌屬占比55.19%、狹義梭菌(Clostridiumsensustricto12)占比19.07%、魏斯氏菌屬(Weissella)和明串珠菌屬(leuconostoc)均為乳酸菌屬,占比分別為11.23%和9.28%。這一結果與陳浩等[7]的研究結果相似。乳酸菌是人體腸道系統(tǒng)中最主要的有益菌,能夠產生良好的感官風味和豐富的營養(yǎng)物質,在各種發(fā)酵食品中發(fā)揮關鍵作用[8-10]。芽胞桿菌屬能分泌多種酶類和抗生素；魏斯氏菌屬可以增加在食品發(fā)酵過程中的有機酸、酯等含量[11],促進風味物質的合成,是參與食品發(fā)酵的微生物;明串珠菌可以作為食品發(fā)酵中的起始劑、調味劑和膨松劑,改善食品的安全性和感官特性[12]。李璐等[13]用腸膜明串珠菌發(fā)酵的菠蘿果汁能夠延緩維生素C的流失,感官評價較優(yōu)。

在醬醅發(fā)酵中后期30和50 d(B和C)時,隨著發(fā)酵時間增長,芽胞桿菌屬在逐漸降低,枝芽胞菌屬(Virgibacillus)在30 d時出現(xiàn)且增長迅猛,在50 d達到最大占比為85.47%。在發(fā)酵30 d時還有厭氧菌(Anaerosalibacter)、片球菌屬(Pediococcus)和克羅彭斯特菌屬(Kroppenstedtia)等,發(fā)酵50 d時優(yōu)勢細菌屬與30 d基本一致,說明醬醅在發(fā)酵室中相同環(huán)境下細菌群落結構基本相似。左麗麗等[14]對傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中乳酸菌進行分離和鑒定,初步推斷出戊糖片球菌是吉林市農家醬發(fā)酵過程中的優(yōu)勢乳酸菌群,對傳統(tǒng)豆醬的風味起著至關重要的作用。

在低鹽固態(tài)發(fā)酵起始階段75 d(D)主要優(yōu)勢細菌屬為四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus)占總數(shù)52.71%,還有少量狹義梭菌(Clostridiumsensustricto12)；在終止階段165 d(E)四聯(lián)球菌和芽孢桿菌屬有降低趨勢,但同時出現(xiàn)了乳桿菌屬(Lactobacillus)占比32.94%,主要優(yōu)勢細菌屬同75 d時一致。嗜鹽四聯(lián)球菌是發(fā)酵食品常用的微生物之一[15],可以用于釀造醬油、發(fā)酵食品和腌制品中,改善產品的風味。

a-門水平；b-屬水平圖3 不同分類水平下的傳統(tǒng)大豆醬主要細菌群落結構Fig.3 Bacterial community structure of traditional soybean paste under different classification levels

2.2.2 真菌群落結構分析

由圖4-a可知,在門水平下,最豐富真菌菌門是子囊菌門(Ascomycota)、比較豐富的毛霉菌門(Mucoromycota)、擔子菌門(Basidiomycota) 以及被孢霉門(Mortierellomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)和芽枝霉門(Blastocladiomycota)等少量豐度菌門。其中,在發(fā)酵1 d時毛霉菌門為優(yōu)勢菌門,相對豐度高達 96.77%,隨著發(fā)酵時間的延長,毛霉菌門銳減,子囊菌門增加,在發(fā)酵30 d時達到頂峰；在發(fā)酵后期出現(xiàn)少量擔子菌門,相對豐度僅為 0.32%。

a-門水平；b-屬水平圖4 不同分類水平下的傳統(tǒng)大豆醬主要真菌群落結構Fig.4 Community structure of main fungi in traditional soybean paste under different classification levels

由圖4-b可見,屬水平下,樣品在真菌中檢測出最豐富菌屬是曲霉屬(Aspergillus),次之是毛霉屬(Mucor)、青霉屬(Penicillum)。在發(fā)酵初期1 d時毛霉屬為主要優(yōu)勢菌,30 d以后曲霉屬為主要優(yōu)勢菌；在發(fā)酵的最后階段165 d時出現(xiàn)假絲酵母屬(Candida)、耐干霉菌屬(Xeromyces),其余還有小囊菌屬(Microascus)、根毛霉屬(Rhizomucor)、赤霉菌(Gibberrella)、狹義梭菌屬。其中,曲霉屬[16]具有較強的酶活性,廣泛應用于食品發(fā)酵；毛霉屬能產生果膠酶、凝乳酶和脂肪酶等[17],可用于制曲和釀酒。因此,有必要對豆醬的微生物多樣性進行研究,了解豆醬的微生物群落結構,充分利用優(yōu)勢菌株。

2.3 傳統(tǒng)大豆醬不同發(fā)酵階段微生物群落差異分析

采用線性判別分析(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)法分析傳統(tǒng)大豆醬前發(fā)酵醬醅微生物群落的差異顯著性,尋找生物標識物[18]。由圖5-a可知,不同發(fā)酵時期豆醬細菌群落結構存在顯著豐度差異的。在發(fā)酵1 d時,芽胞桿菌屬、魏斯氏菌屬、明串珠菌屬等為顯著差異菌屬；在30 d時,有Anaerosalibacter、Pediococcus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus等為顯著差異菌屬；在50 d時只有Virgibacillus差異顯著；在75 d時,Oligella、Vibrio等為差異顯著菌屬；在165 d時,只有Lactobacillus為差異顯著菌屬。由圖5-b可知，不同發(fā)酵時期豆醬存在真菌有4組是有顯著差異的,但是在165 d時差異不顯著。發(fā)酵1 d時Mucor為顯著差異菌屬,在30 d時Licanicillum為差異顯著菌屬；在50 d時Lichtheimia差異顯著菌屬；在75 d時沒有顯著差異菌屬,但165 d差異顯著菌屬相對來說比較多,包括Aspergillus、Curvularia、Tausonia、Fusarium和Pichia等。

3 討論

目前采用高通量測序技術對于大豆醬發(fā)酵過程中微生物群落結構的分析已有報道。張穎等[19]利用PCR-DGGE結合高通量測序技術分析了自然發(fā)酵豆醬過程中細菌的多樣性和動態(tài)變化,并得出細菌多樣性也隨著發(fā)酵時間的變化而變化的結論。向凡舒等[20]對鶴峰地區(qū)渣豆醬中的微生物研究結果表明芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬是主要的細菌屬,青霉屬、耐堿酵母屬和接合酵母屬是主要的真菌屬。JUNG等[21]利用焦磷酸測序法研究了韓國豆醬發(fā)酵過程中微生物,發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌和毛霉是主要的細菌和真菌。馬巖石等[22]對東北5個不同產地的豆醬微生物群落進行分析,表明細菌屬主要為葡萄球菌屬、腸桿菌屬、明串珠菌屬和芽胞桿菌屬。本研究采用 Illumina MiSeq高通量測序技術對傳統(tǒng)大豆醬2個不同發(fā)酵階段5個時間節(jié)點微生物多樣性差異分析。其中在傳統(tǒng)大豆醬前發(fā)酵階段的細菌群落結構上,主要以厚壁菌門和芽胞菌屬為主,在低鹽固態(tài)發(fā)酵階段中75和165 d時,四聯(lián)球菌屬為主要優(yōu)勢細菌屬,還有部分乳桿菌屬。在真菌的群落結構上,發(fā)酵1 d時毛霉菌門優(yōu)勢菌門,毛霉屬為主要優(yōu)勢菌屬,其他發(fā)酵階段均以子囊菌門為優(yōu)勢菌門,曲霉屬為主要優(yōu)勢菌屬。此結果與韓俊燕等[23]對4個不同地區(qū)的發(fā)酵辣椒制品的研究結果具有相似性。但本研究在細菌屬水平和真菌屬水平不同發(fā)酵階段優(yōu)勢菌有很大差異,可能與地域及加工環(huán)境有密切關系,微生物群落多樣性在細菌門上差異原因與部分報道相一致,如上述馬巖石等[22]的結論。

a-傳統(tǒng)大豆醬細菌LEfSe分析；b-傳統(tǒng)大豆醬真菌LEfSe分析圖5 傳統(tǒng)大豆醬不同發(fā)酵階段LEfSe分析Fig.5 Analysis of LEfSe in different fermentation stages of traditional soybean paste

在細菌群落結構上,主要優(yōu)勢菌屬也包括明串珠菌屬和芽胞桿菌屬,與其不同的是四聯(lián)球菌屬和乳桿菌屬也均為優(yōu)勢菌屬,有研究表明二者會產生優(yōu)良風味且對人體有益,比如CUI等[24]通過在醬醪中先接種嗜鹽四聯(lián)球菌,后接種耐鹽酵母菌的方式,明顯提高了醇類、酮類和吡嗪類物質等風味物質的含量。乳桿菌屬可以通過發(fā)酵碳水化合物產生ATP,廣泛用于生產商業(yè)酸奶,含乳桿菌的酸奶對腸道有益[25]。

本研究從前發(fā)酵醬醅階段到鹽封半固態(tài)發(fā)酵實驗研究,該結果對了解傳統(tǒng)大豆醬不同發(fā)酵微生物多樣性變化能夠提供一定的理論數(shù)據(jù)。為進一步明確優(yōu)勢菌株和風味物質的相關性研究提供依據(jù),可以通過不同發(fā)酵天數(shù)的傳統(tǒng)大豆醬中優(yōu)勢菌屬進行篩選,定植發(fā)酵,以縮短生產周期,控制和改善風味。