王禹錫,程萍,李若萱,王沁,周哲敏,周麗

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)

廣藿香醇是一種天然的三環(huán)倍半萜化合物,是廣藿香油的主要成分[1]。廣藿香油在日化品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,可用于香水、精油的制作[2],也常被用于食品、藥品的分析[3]。廣藿香醇具有抗菌消炎止痛的作用,在治療抑郁癥方面也有一定功效,具有潛在的藥用價(jià)值[4-6]。隨著消費(fèi)意識(shí)的提升,人們對(duì)廣藿香醇的需求量逐年遞增[7-8]。

目前有3類方法可以合成廣藿香醇,即植物提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵合成法。其中,植物提取法是目前生產(chǎn)廣藿香醇的主要方法,然而此種方法需要大量廣藿香植株作為原料,占用農(nóng)用耕地；廣藿香醇的產(chǎn)量和品質(zhì)受地理位置、氣候環(huán)境和植株品質(zhì)影響較大；另外,提取廣藿香醇的過(guò)程耗能巨大,不利于環(huán)保[8]?；瘜W(xué)合成法雖可以合成純度較高的廣藿香醇,但是步驟繁多,操作復(fù)雜,合成成本高,產(chǎn)率卻很低[9],無(wú)法應(yīng)用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。

利用微生物發(fā)酵合成廣藿香醇,具有成本低、利于保護(hù)環(huán)境和創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)效益等優(yōu)勢(shì)。目前多數(shù)采用釀酒酵母或者谷氨酸棒桿菌作為宿主菌[8-10]。但截止目前,所有發(fā)酵法合成廣藿香醇的研究仍處于實(shí)驗(yàn)室探索階段,其產(chǎn)量均無(wú)法達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。酵母菌內(nèi)含有麥角固醇和類胡蘿卜素合成代謝途徑,競(jìng)爭(zhēng)利用廣藿香醇前體物質(zhì)法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP),對(duì)廣藿香醇產(chǎn)量和純度不利。而大腸桿菌中沒有此類代謝途徑[2,11-12],同時(shí),大腸桿菌遺傳背景清晰,基因操作簡(jiǎn)便,營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單,生長(zhǎng)迅速,可通過(guò)分批補(bǔ)料方式實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵[13],已廣泛應(yīng)用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中,有望最大化地實(shí)現(xiàn)廣藿香醇發(fā)酵合成。AGUILAR等[2]將甲羥戊酸途徑和廣藿香醇合酶(patchoulol synthase,PTS)在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),并優(yōu)化發(fā)酵條件和產(chǎn)物提取條件,首次報(bào)道了大腸桿菌廣藿香醇發(fā)酵合成。然而,他們沒有對(duì)PTS或者廣藿香醇合成代謝途徑進(jìn)行深入改造,相關(guān)研究將對(duì)解析廣藿香醇合成機(jī)制以及促進(jìn)廣藿香醇的大規(guī)模應(yīng)用具有重要意義。

PTS的表達(dá)水平和催化能力是影響廣藿香醇合成的重要因素。然而,PTS在大腸桿菌內(nèi)可溶性表達(dá)量很低[14],嚴(yán)重影響廣藿香醇的發(fā)酵合成。添加可以增強(qiáng)蛋白溶解性的多肽標(biāo)簽是提高外源蛋白在大腸桿菌中表達(dá)水平的一種策略[15],然而目前尚無(wú)利用相關(guān)策略提高廣藿香醇發(fā)酵合成的報(bào)道。同時(shí),目前仍沒有PTS的晶體結(jié)構(gòu),因此其催化機(jī)制并非完全清晰。根據(jù)其他倍半萜合酶的晶體結(jié)構(gòu)推測(cè),PTS的活性中心主要由DDXXD和NSE/DTE基序組成。DDXXD基序與Mg2+結(jié)合,協(xié)助底物形成正確取向；NSE/DTE基序位于DDXXD基序?qū)γ?結(jié)合另一Mg2+,影響PTS的底物譜[14,16]。截止目前,仍未有對(duì)PTS分子改造獲得催化能力增強(qiáng)的突變酶。

本研究采用大腸桿菌作為宿主菌合成廣藿香醇,在PTS2上添加5種促溶標(biāo)簽,篩選到1種可以增強(qiáng)PTS2可溶表達(dá)且增加廣藿香醇產(chǎn)量的標(biāo)簽。對(duì)廣藿香醇合酶PTS2進(jìn)行了同源比對(duì)和序列分析,分子改造獲得突變株,確定了影響酶活力的關(guān)鍵位點(diǎn)。通過(guò)對(duì)FPP供體代謝途徑進(jìn)行改造,增強(qiáng)了廣藿香醇合成過(guò)程中的底物供應(yīng)。將篩選獲得的最優(yōu)標(biāo)簽與改造后的底物供體途徑組合,獲得1株最優(yōu)的重組菌。本結(jié)果為以大腸桿菌為宿主合成廣藿香醇提供了一定參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與引物

菌株E.coliBL21(DE3)、E.coliDH5α為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。質(zhì)粒pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO,ispA)[17](本文簡(jiǎn)寫為pMev),Addgene；pET28a-PTS2質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。本實(shí)驗(yàn)中所用引物如表1所示。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

續(xù)表1

1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

Prime Star Max DNA聚合酶、ExTaqDNA聚合酶、In-Fusion組裝試劑盒、DNA Marker、Protein Marker(Broad),寶生物工程(大連)公司；質(zhì)粒小提試劑盒、純化試劑盒、卡那霉素、氯霉素,生工生物工程(上海)股份有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)、十二烷,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10。

M9培養(yǎng)基(g/L)：Na2HPO46,KH2PO43,NaCl 0.3,NH4Cl 1,葡萄糖 5,MgSO42.0 mmol/L,微量元素液0.1%(體積分?jǐn)?shù))。

微量元素(g/L)：MnSO4·4H2O 0.5,FeSO4·7H2O 10,CaCl22,(NH4)Mo7O240.1,CuSO4·5H2O 3,Na2B4O7·10H2O 0.2,ZnSO4·7H2O 5.25,溶于0.1 mol/L HCl溶液。

根據(jù)需要,向培養(yǎng)基中添加卡那霉素至終質(zhì)量濃度為50 mg/L、氯霉素至終質(zhì)量濃度為37 mg/L。

1.3 儀器與設(shè)備

PCR儀、凝膠成像儀、蛋白電泳儀,BIO RAD公司；UV 1800 PC型紫外可見分光光度計(jì),上海美普達(dá)有限公司；pH計(jì),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；生物傳感分析儀,深圳市西爾曼科技有限公司；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,日立(HITACHI)公司。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.4.1 融合標(biāo)簽改造重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以pET28a-PTS2質(zhì)粒為模板,使用表1中所列T7AF+T7AR等引物,全質(zhì)粒PCR,產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中,挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證,得到重組質(zhì)粒pET28a-PTS2/T7A、pET28a-PTS2/T7A2、pET28a-PTS2/T7A3、pET28a-PTS2/NT11、pET-28a-PTS2/SKIK。

1.4.2 廣藿香醇合酶分子改造重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以pET28a-PTS2質(zhì)粒為模板,以I438VF和I438VR為上下游引物全質(zhì)粒PCR擴(kuò)增,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-PTS2/I438V(簡(jiǎn)寫為I438V)。分別以pET-28a-PTS2質(zhì)粒為模板,用表1所示相應(yīng)上下游引物進(jìn)行全質(zhì)粒PCR擴(kuò)增,構(gòu)建突變體質(zhì)粒,重組質(zhì)粒分別簡(jiǎn)寫為K28R、K57R、K91R、K102R、K131R、K136R、K191R、K226R、K230R、K333R、K343R、K358R、K389R、K391R、K395R、K399R、K425R、K475R、K478R。

1.4.3 FPP合成途徑的改造重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以本實(shí)驗(yàn)室保藏的pT7P-T7T質(zhì)粒為模板,使用表1中引物T7TF和T7PR,PCR擴(kuò)增T7 terminator-T7 promoter片段；以pMev質(zhì)粒為模板,用引物T7T-tHMGRR和T7P-MKF,PCR擴(kuò)增質(zhì)粒骨架,將兩片段使用In-Fusion試劑盒組裝連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMev-T7M2。以pMev-T7M2質(zhì)粒為模板,用T7T-pBbA5CR和T7P-atoBF引物,PCR擴(kuò)增質(zhì)粒骨架,與已獲得的T7 terminator-T7 promoter基因片段In-Fusion組裝連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMev-T7M1M2。

1.5 重組菌株發(fā)酵合成廣藿香醇方法

將pMev質(zhì)粒化學(xué)轉(zhuǎn)化入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)中,涂布于氯霉素抗性的平板,篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,挑取單菌落轉(zhuǎn)接至搖瓶中,培養(yǎng)至OD6000.3～0.4,收集菌體,1 800 V、0.5 ms電擊轉(zhuǎn)化pET28a-PTS2質(zhì)粒。將菌液涂布于卡那霉素和氯霉素雙抗性的平板,挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌株,獲得供發(fā)酵驗(yàn)證的重組菌株E.coliBL21(DE3)/pMev+pET28a-PTS2。

含有雙質(zhì)粒的菌株在含有卡那霉素和氯霉素的平板上劃線活化,挑取單菌落接種于50 mL LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)10～12 h。種子液以4%(體積分?jǐn)?shù))接種量轉(zhuǎn)接到50 mL M9培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為2,補(bǔ)加質(zhì)量濃度為500 g/L葡萄糖溶液3 mL、十二烷10 mL,并補(bǔ)加IPTG至終濃度為0.5 mmol/L,在20 ℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)至96 h,其間每12 h檢測(cè)一次發(fā)酵液殘?zhí)呛?并補(bǔ)加葡萄糖,維持糖質(zhì)量濃度大于10 g/L,并用氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至7.0左右。

1.6 廣藿香醇的檢測(cè)方法

離心收集發(fā)酵液上層十二烷,用乙酸乙酯適度稀釋,并用無(wú)水Na2SO4除水,使用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)。

色譜分離條件：初始柱溫為50 ℃,恒溫1 min；以10 ℃/min的升溫速度升至200 ℃；再以20 ℃/min的升溫速度升至280 ℃,恒溫持續(xù)3 min。

質(zhì)譜條件：選擇掃描m/z為35～300的離子,進(jìn)樣口溫度為280 ℃,流速為1.2 mL/min,離子源溫度為280 ℃,電離模式為電子電離(60 eV),選擇分流進(jìn)樣模式,分流比為4.2,進(jìn)樣量為1 μL,用選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)進(jìn)行定量分析。定量母離子m/z為138.2,子離子m/z分別為110.1、95.1和123.1,碰撞能量分別為8、14和10。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣藿香醇合酶可溶性表達(dá)改造

PTS2在大腸桿菌內(nèi)可溶性表達(dá)很低[14],嚴(yán)重限制了廣藿香醇的產(chǎn)量。添加可以增強(qiáng)蛋白溶解性的多肽標(biāo)簽是提高外源蛋白在大腸桿菌中表達(dá)水平的一種策略[15]。在此,我們利用5種短的融合標(biāo)簽(圖1-a)來(lái)提高PTS2的可溶性表達(dá)和廣藿香醇的產(chǎn)量。

雖然有研究表明NT11和SKIK標(biāo)簽?zāi)軌蛴行У卮龠M(jìn)難以表達(dá)的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達(dá)[18-19],本研究在PTS2的N端添加這2種標(biāo)簽都未能進(jìn)一步提高廣藿香醇的合成量(圖1-b)。而在C端添加T7A、T7A1、T7A3標(biāo)簽,明顯減少了PTS2包涵體的形成(圖1-c),并在一定程度上提高了PTS2的可溶性表達(dá)。同時(shí),T7A-T7A3標(biāo)簽的酸性越強(qiáng),PTS2的可溶性表達(dá)量越高。然而,廣藿香醇的產(chǎn)量隨著標(biāo)簽的酸性增強(qiáng)而逐漸減少(圖1-b),這表明過(guò)多的負(fù)電荷會(huì)降低PTS2的催化活性。與原始PTS2相比,將T7A標(biāo)簽融合到PTS2上,可有效地將廣藿香醇合成量提高39.74%。

a-不同標(biāo)簽融合策略；b-融合不同標(biāo)簽對(duì)廣藿香醇合成的影響；c-廣藿香醇合酶融合T7A-T73標(biāo)簽SDS-PAGE圖譜M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker；S-細(xì)胞破碎上清液；P-細(xì)胞破碎沉淀圖1 融合標(biāo)簽對(duì)廣藿香醇合成的影響Fig.1 The effects of fusion tags on patchoulol synthesis

目前研究中,僅HARTWIG等[14]利用長(zhǎng)多肽融合標(biāo)簽將PTS在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)提高了40%,然而長(zhǎng)多肽標(biāo)簽往往干擾目的蛋白的功能,需要在表達(dá)后切除。本研究表明,僅有22個(gè)氨基酸的短肽T7A標(biāo)簽也能有效提高PTS2的可溶性表達(dá)以及廣藿香醇發(fā)酵合成產(chǎn)量。同時(shí),將T7A標(biāo)簽融合到PTS2的C端,便于在N端進(jìn)一步融合其他促溶蛋白質(zhì)。該結(jié)果為提高PTS可溶表達(dá)以及進(jìn)一步組合多種改造策略提高廣藿香醇發(fā)酵合成水平提供了借鑒。

2.2 廣藿香醇合酶分子改造

2.2.1 基于序列同源性分析的分子改造

目前尚無(wú)PTS晶體結(jié)構(gòu)的報(bào)道,其催化機(jī)制尚不清晰,因此通過(guò)理性設(shè)計(jì)對(duì)PTS進(jìn)行分子改造較為困難,導(dǎo)致關(guān)于PTS分子改造也很少有文獻(xiàn)報(bào)道,尚未獲得催化活性增強(qiáng)的突變體。然而,具有不同催化活性的PTS自然變異體,可為其分子改造提供素材。例如,廣藿香醇合酶PTS1與PTS2分別來(lái)源于廣藿香(Pogostemoncablin)的不同植株,它們的氨基酸序列相似性為96.2%。本課題組前期研究結(jié)果顯示PTS2合成廣藿香醇的能力要明顯高于PTS1。

a-氨基酸序列同源比對(duì)結(jié)果；b-PTS2三維結(jié)構(gòu)；c-PTS2突變體菌株的廣藿香醇產(chǎn)量圖2 I438V和E457A氨基酸突變對(duì)廣藿香醇合成的影響Fig.2 The effects of amino acid mutations of I438V and E457A on patchoulol synthesis

利用BLAST軟件搜索與PTS2氨基酸序列相似性高的酶,與PTS1、PTS2氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)(圖2-a)。并用SWISS-MODEL在線服務(wù)器(https://swissmodel.expasy.org/),以黃花蒿(Artemisiaannua)來(lái)源的倍半萜合酶晶體結(jié)構(gòu)為模板(PDB：4fjq.1),對(duì)PTS2進(jìn)行分子建模(圖2-b,廣藿香醇合酶PTS2與A.annua來(lái)源的倍半萜合成酶氨基酸序列同源性達(dá)到43.12%,表明模擬的模型可信度較高)。分析活性中心附近、氨基酸序列不一致的位點(diǎn)。其中,438位的異亮氨酸(Ile,I)在其他倍半萜合酶對(duì)應(yīng)位置均為纈氨酸(Val,V),因此構(gòu)建相應(yīng)I438V突變體,驗(yàn)證其對(duì)廣藿香醇合成的作用。此外,據(jù)推測(cè)457位的谷氨酸(Glu,E)可能參與結(jié)合Mg2+,Mg2+是輔助結(jié)合底物FPP的金屬陽(yáng)離子,是影響催化活性的關(guān)鍵位點(diǎn),而在有些倍半萜合酶中該位點(diǎn)突變?yōu)椴粠щ姾傻母拾彼?Gly,G),將會(huì)影響Mg2+的結(jié)合能力,因此將其突變?yōu)楸彼?Ala,A)進(jìn)行驗(yàn)證。

發(fā)酵結(jié)果如圖2-c所示,I438V突變導(dǎo)致重組菌E.coliBL21(DE3)/pMev+I438V廣藿香醇產(chǎn)量降低為原始菌的38.72%。Ile和Val都為非極性氨基酸,但Val的側(cè)鏈更短,表明Ile的長(zhǎng)側(cè)鏈有利于PTS2的酶活性。另一方面,457位Glu殘基突變?yōu)锳la導(dǎo)致廣藿香醇產(chǎn)量顯著降低,表明457位點(diǎn)Glu參與結(jié)合Mg2+,突變?yōu)椴粠щ姾傻腁la,影響了與Mg2+的結(jié)合。因此,I438對(duì)PTS2活性有一定影響,而E457是其關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。

2.2.2 基于表面賴氨酸殘基替換的分子改造

本實(shí)驗(yàn)室前期研究中發(fā)現(xiàn)將酶分子表面的賴氨酸(Lys,K)殘基替換為精氨酸(Arg,R),可以有效提高酶的熱穩(wěn)定性和酶活力[20-22]。本研究利用該策略對(duì)PTS2進(jìn)行分子改造。將PTS的三維模型提交于GETAREA在線服務(wù)器(http://curie.utmb.edu/getarea.html),篩選到19個(gè)表面暴露比率大于50%的Lys殘基,結(jié)果如表2和圖3-a所示。將這些位點(diǎn)突變?yōu)锳rg,重組菌株發(fā)酵結(jié)果如圖3-b所示。

表2 PTS2表面賴氨酸殘基預(yù)測(cè)Table 2 Prediction of surface lysine residue

所有表面Lys突變?yōu)锳rg的突變體導(dǎo)致了廣藿香醇產(chǎn)量不同程度下降,其中28、136、343位突變導(dǎo)致廣藿香醇幾乎不能合成。Lys和Arg同為堿性氨基酸,但Arg的側(cè)鏈基團(tuán)要大于Lys,氨基酸替換后的空間位阻改變可能是導(dǎo)致酶活下降的主要原因。28、136、343這3個(gè)PTS表面氨基酸位點(diǎn)雖然并不靠近活性中心,也不參與Mg2+的結(jié)合,卻對(duì)PTS的催化活性有重要作用,后續(xù)實(shí)驗(yàn)可對(duì)這3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行更深入的研究。上述結(jié)果為深入解析PTS催化機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

a-廣藿香醇合酶PTS2表面賴氨酸殘基位置；b-PTS2突變體菌株的廣藿香醇產(chǎn)量圖3 廣藿香醇合酶表面賴氨酸突變?yōu)榫彼釋?duì)廣藿香醇合成的影響Fig.3 The effects of mutating surface lysine of PTS2 into arginine on patchoulol synthesis

2.3 FPP合成代謝途徑的改造

大腸桿菌自身具有廣藿香醇前體化合物——FPP的合成代謝途徑,但該途徑效率低。FRANCISCO等[2]通過(guò)引入pMev質(zhì)粒,在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)甲羥戊酸代謝途徑,提高了廣藿香醇產(chǎn)量,表明該途徑對(duì)廣藿香醇發(fā)酵合成有重要作用。但他們并未對(duì)pMev質(zhì)粒上的基因表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化,相關(guān)研究將有利于進(jìn)一步提高廣藿香醇合成水平。

pMev質(zhì)粒含有從乙酰-CoA合成FPP代謝途徑的8個(gè)基因,以lacUV5啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。單啟動(dòng)子后串聯(lián)的編碼基因較多,排序在后的基因可能表達(dá)效果較差,因此將pMev質(zhì)粒上攜帶的8個(gè)基因劃分為2個(gè)模塊,增強(qiáng)其表達(dá)。前3個(gè)基因atoB、HMGS、tHMGR編碼的酶將乙酰-CoA催化合成甲羥戊酸,將其劃分為第一模塊(簡(jiǎn)寫為M1)；MK、PMK、PMD編碼的酶又將甲羥戊酸催化生產(chǎn)異戊二烯焦磷酸(isopentenylpyrophosphate,IPP),IDI將IPP異構(gòu)化為二甲基烯丙基焦磷酸,1分子IPP和2分子二甲烯丙基二磷酸(dimethylallylpyrophosphate,DMAPP)在ISPA的催化下縮合形成FPP。將MK、PMK、PMD、idi和ispA劃分為第二模塊(簡(jiǎn)寫為M2)。在模塊1和模塊2之間插入T7終止子和PT7啟動(dòng)子,用來(lái)終止模塊1的轉(zhuǎn)錄,并增強(qiáng)模塊2的表達(dá),構(gòu)建重組質(zhì)粒pMev-T7M2(圖4-a)。用引物YtHMGRF和YMKR 進(jìn)行PCR驗(yàn)證,瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證圖譜如圖4-b所示,原始質(zhì)粒應(yīng)獲得152 bp條帶,整合后應(yīng)為303 bp,表明成功獲得了pMev-T7M2重組質(zhì)粒。進(jìn)一步,將pMev-T7M2質(zhì)粒上模塊1的啟動(dòng)子替換為T7強(qiáng)啟動(dòng)子,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMev-T7M1M2(圖4-a),用YpBbA5CF和YatoBR引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證,電泳驗(yàn)證圖譜如圖4-c所示,原始質(zhì)粒應(yīng)獲得240 bp條帶,整合后應(yīng)為340 bp,表明成功獲得了pMev-T7M1M2重組質(zhì)粒。

a-插入強(qiáng)啟動(dòng)子策略；b-pMev-T7M2重組質(zhì)粒PCR驗(yàn)證電泳圖譜；c-pMev-T7M1M2重組質(zhì)粒PCR驗(yàn)證電泳圖譜M-DNA Marker；1-對(duì)照；2-模塊2啟動(dòng)子替換；3-對(duì)照；4-模塊1啟動(dòng)子替換圖4 法尼基焦磷酸合成途徑改造Fig.4 The modification of farnesyl pyrophosphate synthetic pathway

重組菌株E.coliBL21(DE3)/pMev-T7M2+pET28a-PTS2和E.coliBL21(DE3)/pMev-T7M1-T7M2+pET28a-PTS2廣藿香醇發(fā)酵結(jié)果如圖5所示,表明加強(qiáng)兩個(gè)模塊均使廣藿香醇產(chǎn)量有不同程度的提高。兩模塊都使用T7啟動(dòng)子加強(qiáng)表達(dá)后,廣藿香醇產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了55.95%,產(chǎn)量提升效果相較于單模塊增強(qiáng)的重組菌株更為顯著。說(shuō)明增強(qiáng)FPP合成代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá),以增加底物的供給,可有效促進(jìn)廣藿香醇發(fā)酵合成。該結(jié)果對(duì)發(fā)酵合成其他倍半萜化合物也有一定的借鑒意義。

圖5 法尼基焦磷酸代謝途徑改造對(duì)廣藿香醇合成的影響Fig.5 The effects of improving synthetic pathway of farnesyl diphosphate on patchoulol synthesis

2.4 組合策略提高廣藿香醇發(fā)酵合成

將篩選到的有效提高PTS2可溶性表達(dá)且能夠增加廣藿香醇產(chǎn)量的質(zhì)粒pET28a-PTS2T7A與最優(yōu)的FPP供體質(zhì)粒pMev-T7M1-T7M2轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中,發(fā)酵驗(yàn)證組合兩種策略的最優(yōu)結(jié)果對(duì)廣藿香醇合成的作用。結(jié)果如圖6所示,重組菌株E.coliBL21(DE3)/pMev-T7M1M2+pET28a-PTS2/T7A產(chǎn)量比出發(fā)菌株提升了72.22%,達(dá)到24.1 mg/L,表明兩種策略的有益結(jié)果成功實(shí)現(xiàn)了疊加。該結(jié)果為組合多種策略提高倍半萜化合物在大腸桿菌中的發(fā)酵合成提供了借鑒。

圖6 最優(yōu)改造策略組合對(duì)廣藿香醇合成的影響Fig.6 The effects of combining optimal strategies on patchoulol synthesis

3 結(jié)論

本研究在大腸桿菌中對(duì)PTS和合成FPP的外源代謝途徑進(jìn)行了改造。對(duì)廣藿香醇合酶PTS2添加T7A促溶標(biāo)簽,可增強(qiáng)其可溶性表達(dá),使廣藿香醇產(chǎn)量提升39.74%。對(duì)構(gòu)成PTS的氨基酸突變,發(fā)現(xiàn)28位、136位、343位的賴氨酸和457位的谷氨酸是影響酶活力的重要位點(diǎn),為深入揭示PTS的催化機(jī)制提供了借鑒。對(duì)PTS的底物合成途徑進(jìn)行強(qiáng)化,使廣藿香醇產(chǎn)量提升55.95%。進(jìn)一步疊加促溶標(biāo)簽改造策略與底物合成途徑強(qiáng)化策略,所獲得的重組菌株比優(yōu)化前的菌株產(chǎn)量提升72.22%。本研究相關(guān)改造策略對(duì)提高PTS催化能力、優(yōu)化倍半萜化合物合成代謝途徑和進(jìn)一步提高廣藿香醇產(chǎn)量提供了借鑒。