張芮芮 吳 彤 施郁淼 羅佳美 蘇殿三 田 婕

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)是指患者在麻醉及手術(shù)后出現(xiàn)的認(rèn)知功能下降，主要表現(xiàn)為注意力無法集中、記憶受損、學(xué)習(xí)執(zhí)行和語言理解能力下降[1-3]，是一種常發(fā)生于老年患者術(shù)后的臨床并發(fā)癥。盡管POCD的病理生理學(xué)機制尚不明確，但越來越多的研究認(rèn)為高齡已經(jīng)成為POCD重要且獨立的危險因素[4-5]。由于人口老齡化逐年加重，接受麻醉手術(shù)的老年患者比例也不斷攀升。因此，針對老年患者這一特殊群體的POCD 誘因、預(yù)防、診斷及治療的相關(guān)研究越來越受到重視。

外周炎癥反應(yīng)可能是POCD發(fā)生的重要因素[6-8]。中性粒細胞是外周血中數(shù)量最多的炎癥細胞[9]，也是參與機體固有免疫應(yīng)答的重要組成部分，在損傷及炎癥早期是調(diào)節(jié)控制及清除初始損傷刺激物的重要細胞[10]。然而，中性粒細胞在老年小鼠POCD發(fā)展中的作用尚不清楚。本研究采用中性粒細胞拮抗劑——粒細胞分化抗原1抗體(anti-granulocyte-differentiation antigen 1, 抗Gr1)清除小鼠體內(nèi)的中性粒細胞[11]，并通過新物體識別(novel object recognition, NOR)實驗[12]檢測老年小鼠經(jīng)過處理后的識別記憶能力的變化，探索中性粒細胞在老年小鼠POCD發(fā)生、發(fā)展中扮演的角色。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 C57BL/6J小鼠由上海實驗動物研究中心提供，18～20月齡，健康雄性，每只體重約30 g。小鼠于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院東院麻醉實驗室飼養(yǎng)并進行相應(yīng)實驗。首先將小鼠分為對照組(6只)和手術(shù)組(5只)，手術(shù)組在異氟烷麻醉下制備脛骨骨折復(fù)位內(nèi)固定術(shù)模型，對照組不予手術(shù)處理。使用流式細胞術(shù)檢測術(shù)后第2天兩組小鼠外周血中性粒細胞百分比。另取一批小鼠，用于探討中性粒細胞對小鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知功能影響。根據(jù)給藥和手術(shù)情況，隨機分為對照組、抗Gr1組、手術(shù)組和抗Gr1+手術(shù)組，每組8只。其中，對照組和手術(shù)組小鼠予腹腔內(nèi)注射100 μL 0.9%氯化鈉(NaCl)溶液；抗Gr1組和抗Gr1+手術(shù)組小鼠予腹腔內(nèi)注射以0.9%NaCl溶液稀釋的抗Gr1(6 mg/kg)100 μL，以上各組每天注射1次,共注射4 d。在注射的第2天，手術(shù)組和抗Gr1+手術(shù)組小鼠進行脛骨骨折復(fù)位內(nèi)固定術(shù)。

1.2 脛骨骨折復(fù)位內(nèi)固定術(shù) 手術(shù)組和抗Gr1+手術(shù)組在異氟烷麻醉下行脛骨骨折復(fù)位內(nèi)固定術(shù)，具體操作步驟：異氟烷麻醉誘導(dǎo)后，將小鼠固定于保溫板上，左后側(cè)脛前皮膚備皮和消毒，沿中線做一長約1 cm的縱行切口，鈍性分離并暴露小鼠脛骨，分離骨膜，注意保護肌肉組織。將一根長度為8 mm、直徑0.38 mm的針刺入骨髓腔，切斷脛骨，然后用針將脛骨復(fù)位并固定。術(shù)畢，以0.9%NaCl溶液清理傷口，縫合切口，待麻醉30 min后，將小鼠放入干凈的鼠籠內(nèi)，予烤燈照射保溫，等待自然蘇醒。

1.3 流式細胞術(shù)檢測中性粒細胞百分比 脛骨骨折復(fù)位內(nèi)固定手術(shù)后第2天，將小鼠麻醉后心尖取血；加入紅細胞裂解液，室溫避光20 min，離心后棄上清液，PBS重懸；加入熒光素標(biāo)記的小鼠流式抗體(PE-CD45、BV421-CD11b、FITC-Ly6G、APC-Ly6C)，濃度均為1∶100，4 ℃避光孵育30 min后以PBS洗滌、離心、重懸，應(yīng)用流式細胞分析儀檢測CD45+CD11b+Ly6G+Ly6Cint細胞群。比較各組小鼠中性粒細胞百分比的差異。

1.4 小鼠行為學(xué)測定 為了評估中性粒細胞在老年小鼠POCD中的作用，脛骨骨折復(fù)位固定術(shù)后第2天，通過NOR實驗檢測小鼠的物體識別和記憶能力。NOR是一種高效快速測定小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的實驗，利用嚙齒類動物記住熟悉物體后會花費更多時間探索新物體這一現(xiàn)象設(shè)計而成。具體方法：術(shù)后第1天將小鼠放到實驗房間適應(yīng)0.5 h，再移至實驗用黑色無頂塑料箱(60 cm×50 cm×40 cm)中自由探索5 min，讓小鼠適應(yīng)實驗環(huán)境。24 h后，箱內(nèi)提前放入2個相同物體，分別距離箱壁15 cm，兩物體間距20 cm；將小鼠貼箱壁放入，放入點距兩物體的距離相同；自由探索5 min，然后取出小鼠，讓其休息3 h。隨后將其中1個物體替換為材質(zhì)相同、顏色與形狀不同的新物體，再將小鼠從原位置放入箱內(nèi)自由探索5 min。對新、舊物體的探索行為是指小鼠在看向新物體或舊物體時用鼻子嗅其氣味或做出用前肢觸碰物體這一動作。實驗中通過用攝像機記錄、回看以精確計算小鼠在箱中探索新、舊兩個物體的時間?？偺剿鲿r間=新物體探索時間+舊物體探索時間，代表了各組小鼠好奇并探索物體的基本能力。識別系數(shù)=探索新物體的時間/(探索新物體時間+探索舊物體時間)×100%，代表了小鼠識別和分辨新物體的能力。每只小鼠實驗結(jié)束后用75%乙醇擦拭箱子，避免前一只小鼠殘留的氣味和排泄物影響實驗結(jié)果。

1.5 流式細胞術(shù)檢測抗Gr1消除中性粒細胞的效果 NOR實驗后，4組小鼠麻醉后心尖取血，流式細胞術(shù)檢測步驟同1.3。

2 結(jié) 果

2.1 老年小鼠術(shù)后外周中性粒細胞增多 脛骨骨折復(fù)位內(nèi)固定術(shù)后第2天，使用流式細胞儀檢測老年小鼠對照組和手術(shù)組外周血中性粒細胞(CD45+CD11b+Ly6G+Ly6Cint)的比例。比較白細胞內(nèi)中性粒細胞百分比可以發(fā)現(xiàn)，術(shù)后第2天老年小鼠外周血中中性粒細胞比例顯著升高(57.88%±2.76%比51.15%±1.16%，P<0.01)。見圖1。

圖1 流式細胞術(shù)檢測中性粒細胞(CD45+CD11b+Ly6G+Ly6Cint)百分比

2.2 消除中性粒細胞后老年小鼠術(shù)后識別記憶能力明顯改善 4組小鼠對新、舊物體的總探索時間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示小鼠探索物體的能力基本處于同一水平。但對照組、抗Gr1+手術(shù)組小鼠在新物體上的探索時間顯著長于舊物體(P值分別<0.01、0.05)，即明顯表現(xiàn)出對新物體的偏好。而手術(shù)組小鼠在新、舊物體上的探索時間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，手術(shù)組小鼠的識別系數(shù)顯著低于對照組(P<0.05)。抗Gr1+手術(shù)組小鼠的識別系數(shù)與對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。表明手術(shù)后老年小鼠的識別記憶能力受到一定程度的損傷。但在用抗Gr1消除中性粒細胞后，接受手術(shù)的老年小鼠仍舊表現(xiàn)出對新物體的偏好。以上結(jié)果表明，消除體內(nèi)中性粒細胞可以改善老年小鼠術(shù)后的認(rèn)知能力損傷。

表1 4組老年小鼠外周血中性粒細胞百分比和NOR實驗探索時間及識別系數(shù)的比較

2.3 抗Gr1明顯消除中性粒細胞 連續(xù)4 d腹腔內(nèi)注射抗Gr1后，使用流式細胞儀檢測小鼠外周血中性粒細胞(CD45+CD11b+Ly6G+Ly6Cint)的變化情況。從表1可見，與各自對照組相比，使用抗Gr1的兩組小鼠外周血中中性粒細胞幾乎完全被消除(P值均<0.01)。單純使用抗Gr1(抗Gr1組)和使用抗體并且進行手術(shù)處理(抗Gr1+手術(shù)組)小鼠外周血中性粒細胞的消除效果的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)老年小鼠經(jīng)脛骨骨折復(fù)位內(nèi)固定術(shù)處理后第2天，外周血中性粒細胞比例明顯增多。NOR實驗的結(jié)果顯示，使用抗Gr1處理老年小鼠，消除其體內(nèi)的中性粒細胞后，接受手術(shù)的老年小鼠對新物體的探索時間延長，識別能力增強，提示中性粒細胞參與到老年小鼠POCD的發(fā)生、發(fā)展過程中。清除中性粒細胞可以改善老年小鼠的術(shù)后認(rèn)知功能。

近年來，麻醉和手術(shù)的安全性有極大提高，但老年患者術(shù)后的行為和認(rèn)知功能仍然備受關(guān)注。之前的動物實驗結(jié)果表明，吸入麻醉劑暴露或者局部麻醉下手術(shù)造成的認(rèn)知功能障礙大多發(fā)生在老年而非成年動物，其原因可能為：老年動物的腦血流量減少、神經(jīng)系統(tǒng)代謝障礙、小膠質(zhì)細胞活化增加和神經(jīng)遞質(zhì)功能損害等[13-15]，但具體發(fā)生機制尚不明確。其中，手術(shù)誘發(fā)的外周炎癥反應(yīng)與術(shù)后中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥及認(rèn)知障礙有關(guān)[16]。He等[17]研究發(fā)現(xiàn)，麻醉和手術(shù)后，老年小鼠外周血中的促炎細胞因子高遷移率族蛋白B1(HMGB1)明顯升高，血腦屏障破壞，并出現(xiàn)神經(jīng)炎癥和記憶損傷，伴有POCD發(fā)生。

中性粒細胞在對抗機體急性炎癥中起重要作用，雖然生理條件下小鼠體內(nèi)的中性粒細胞生存時間僅12.5 h左右[18]，但在外周炎癥時，其可被病原體等多種刺激物激活，表達一系列選擇素配體及整合素，與血管內(nèi)皮細胞黏附，并通過血管內(nèi)皮細胞之間的間隙滲入組織。中性粒細胞壽命延長并從血液中被趨化至炎癥部位，有助于小鼠脛骨骨折復(fù)位內(nèi)固定術(shù)后傷口的愈合，促進炎癥消退。然而，中性粒細胞就像一把雙刃劍，既能對抗病原體，保護受損組織，當(dāng)其過度浸潤和激活時卻又可能破壞正常的組織結(jié)構(gòu)，對宿主自身造成嚴(yán)重的損害。例如，在感染性關(guān)節(jié)炎和阿爾茲海默病等多種人類疾病中扮演重要角色[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，老年小鼠脛骨骨折復(fù)位內(nèi)固定術(shù)后第2天外周血中性粒細胞百分比顯著升高；消除體內(nèi)中性粒細胞可明顯改善小鼠術(shù)后認(rèn)知功能損傷，提示中性粒細胞也參與了老年小鼠POCD的發(fā)生。

在連續(xù)4 d使用抗Gr1將小鼠體內(nèi)中性粒細胞幾乎完全清除后，并未觀察到小鼠術(shù)后感染率或死亡率有所增加。這可能與機體的免疫系統(tǒng)是一個包括了多種先天性及獲得性免疫細胞的復(fù)雜系統(tǒng)有關(guān)。中性粒細胞只是先天性免疫系統(tǒng)中的一部分，在中性粒細胞被消除后，其他先天免疫細胞，如自然殺傷細胞、嗜酸或堿性粒細胞、巨噬細胞等可能發(fā)揮了代償作用，保護實驗動物免受感染。

綜上所述，本研究認(rèn)為老年小鼠接受手術(shù)后中性粒細胞數(shù)量增加，參與POCD的發(fā)生、發(fā)展?？笹r1可以清除小鼠體內(nèi)中性粒細胞，改善其認(rèn)知功能。然而，中性粒細胞影響術(shù)后認(rèn)知功能的機制并不十分明確，應(yīng)進一步研究中性粒細胞的滾動、黏附和遷移過程，找到其與中樞的聯(lián)系“樞紐”。本研究結(jié)果可為通過減少中性粒細胞預(yù)防POCD的發(fā)生提供實驗依據(jù)。