黃玉娟 許 淼 沈 蕾 劉 堅 陳婷婷 張國琴

熱性驚厥(febrile seizure, FS)是兒科最常見的驚厥性疾病，其好發(fā)年齡為6月齡至5歲之間[1-2]。FS確切的發(fā)病機制目前尚不明確，其具有明顯的年齡依賴性及家族遺傳傾向，常為多基因遺傳或常染色體顯性遺傳伴不完全外顯[3-4]。此類患兒某些參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和調(diào)控體溫的炎癥介質(zhì)及細胞因子可能在此類患兒FS的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用。由單核巨噬細胞產(chǎn)生的TNFα的啟動子區(qū)238位點存在單核苷酸多態(tài)性，被認為可調(diào)節(jié)TNFα的轉(zhuǎn)錄水平，參與炎癥反應(yīng)過程和體溫調(diào)控[5-6]。本研究通過分析單純性熱性驚厥(simple febrile seizure, SFS)和復(fù)雜性熱性驚厥(complex febrile seizure, CFS)的臨床特征，以及比較TNFα-238基因多態(tài)性在SFS和CFS患兒及健康人群中分布的差異,探討TNFα-238基因多態(tài)性與中國漢族兒童FS發(fā)生的相關(guān)性，以期為預(yù)測FS的遺傳易感性提供參考依據(jù)，同時從基因角度為FS的發(fā)病機制和治療靶點提供新思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2017年6月—2018年5月在上海市兒童醫(yī)院急診科診治的108例FS患兒的臨床資料，皆為漢族，其中男69例、女39例，男女比值為1.77∶1。納入標(biāo)準：符合美國兒科學(xué)會(APP)2011標(biāo)準，F(xiàn)S為發(fā)熱狀態(tài)下(肛溫≥38.5 ℃、腋溫≥38.0 ℃)的驚厥發(fā)作。根據(jù)臨床特征，將納入FS組的患兒分為SFS亞組(82例，75.9%)和CFS亞組(26例，24.1%)。SFS表現(xiàn)為全身性發(fā)作，持續(xù)時間<15 min，1次熱程中發(fā)作1次，無異常神經(jīng)系統(tǒng)體征。表現(xiàn)為局灶性發(fā)作，持續(xù)時間≥15 min或1次熱程中發(fā)作≥2次，符合3條中的1條即診斷為CFS[7]。排除標(biāo)準：中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染；既往有癲癇病史者因感染誘發(fā)驚厥發(fā)作；既往有“無熱驚厥”史；新生兒發(fā)熱伴驚厥；由中毒性腦病、全身代謝紊亂、急性中毒或遺傳代謝性疾病導(dǎo)致的驚厥發(fā)作。選擇同期性別和年齡匹配的完成健康體檢的漢族兒童108名，既往無FS史，設(shè)為健康對照(NC)組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核和批準(批件號:2020R118-E01)，所有受試者入組前親屬均簽署知情同意書。

1.2 實驗方法與觀察指標(biāo)

1.2.1 一般資料 收集納入患兒與健康兒童的年齡、性別、FS家族史、發(fā)生FS時的體溫、驚厥類型、持續(xù)時間、血常規(guī)、血氣分析和血電解質(zhì)分析等臨床資料。

1.2.2 DNA提取與基因型分型 FS組患兒抽搐后1 h內(nèi)采集其靜脈血2.0 mL，NC組留取體檢時采集的血液樣本2.0 mL。兩組血液樣本均置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，應(yīng)用全血基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，DP304-03)，按其產(chǎn)品說明書步驟提取樣本全血DNA。提取的DNA分裝于潔凈EP管中，保存于-80 ℃冰箱。采用高分辨率熔解曲線分析(HRM)法對TNFα-238基因位點多態(tài)性進行基因分型。應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件進行多態(tài)性位點的引物設(shè)計，基因引物由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。TNFα-238引物序列：5’-CAC ACA AAT CAG TCA GTG GC-3’(正向序列)，5’-GGA CAC ACA AGC ATC AAG GA-3’(反向序列)。HRM 10 μL反應(yīng)體系：2×緩沖液1 μL，DNA 1 μL，脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)0.5 μL, 牛血清白蛋白(BSA) 1 μL, LC Grean熒光染料1 μL, 正向和反向引物序列(10 mmol/L)各0.5 μL,TaKaRa LATaq聚合酶0.1 μL, 剩余體積用三蒸水補足。HRM反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性90 s；95 ℃ 1 s，55 ℃ 1 s，72 ℃ 5 s, 共循環(huán)40次；72 ℃延伸90 s。TNFα-238 G/A的測序結(jié)果應(yīng)用美國國立生物技術(shù)信息中心的BLAST軟件與數(shù)據(jù)庫中已知序列進行同源性分析，以驗證基因多態(tài)性結(jié)果的正確性。

2 結(jié) 果

2.1 FS組患兒的臨床特征 FS組患兒伴隨的基礎(chǔ)疾病包括：上呼吸道感染77例(71.3%)，支氣管炎19例(17.6%)，胃腸道感染12例(11.1%)。SFS亞組患兒發(fā)作時體溫顯著高于CFS亞組(Z=-2.064，P=0.039)，發(fā)作后的血糖水平顯著高于CFS組(Z=-1.895，P=0.048)；兩組間其余實驗室指標(biāo)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)。見表1。

表1 SFS與CFS亞組患兒的臨床特征及實驗室結(jié)果比較

2.2 SFS亞組、CFS亞組和NC組TNFα-238位點基因型及等位基因頻率的分布 3組TNFα-238多態(tài)性的基因型頻率分布均符合 Hardy-Weinberg 平衡(P值均>0.05)。本組研究群體中未檢測到TNFα-238位點的AA基因型，3組間其他各基因型、等位基因頻率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)。見表2。

表2 SFS亞組、CFS亞組和NC組TNFα-238位點的基因型及等位基因分布比較 [n(%)]

3 討 論

FS是兒科驚厥發(fā)作最常見的原因。本組研究對象的臨床資料顯示：FS伴發(fā)的疾病以上呼吸道感染(71.3%)最為常見，在性別分布上無顯著差異。本研究結(jié)果顯示，SFS亞組發(fā)作時體溫顯著高于CFS亞組，發(fā)作后血糖水平亦顯著高于CFS亞組。分析其原因：SFS組抽搐時的體溫更高，高熱導(dǎo)致機體處于高度應(yīng)激狀態(tài),交感神經(jīng)興奮,使得兒茶酚胺、腎上腺皮質(zhì)激素和胰高血糖素等分泌顯著增加,抑制胰島素分泌和釋放，最終導(dǎo)致血糖水平升高。因此，對FS患兒尤其是SFS患兒建議監(jiān)測其血糖水平，避免后續(xù)的含糖補液治療或部分存在糖耐量異常兒童的高血糖癥狀加劇，從而損傷腦組織及其他重要臟器。多數(shù)SFS患兒驚厥持續(xù)時間較短，且能自行緩解，故預(yù)后大多良好。長時間、頻繁的驚厥發(fā)作可引起不同程度的腦損傷，導(dǎo)致大腦海馬組織硬化萎縮及神經(jīng)元變性壞死，與顳葉癲癇、情感行為發(fā)育障礙、學(xué)習(xí)困難、智力發(fā)育落后等相關(guān)[1]，故對CFS患兒建議進行定期隨訪，必要時完善腦電圖及頭顱CT或MRI等檢查。

FS的發(fā)病機制尚未完全明確，多數(shù)學(xué)者認為其與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不完善，以及腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)和免疫、遺傳等因素有關(guān)[2]。FS發(fā)生在高體溫或體溫快速升高過程中，提示參與炎癥和介導(dǎo)體溫升高的細胞因子可能在FS的發(fā)病機制中扮演重要角色[8-9]。TNFα為一種典型的促炎性細胞因子和內(nèi)源性致熱原，可激活免疫細胞(如巨噬細胞、單核細胞等)促進血小板活化因子、細胞間黏附分子、血栓素A2、前列腺素E2等炎癥因子分泌，參與機體對炎癥及體溫的調(diào)控過程[10]。既往研究認為，根據(jù)TNFα水平、靶細胞類型、暴露持續(xù)時間及特定的受體亞型的不同，TNFα可產(chǎn)生雙向效應(yīng)。在驚厥模型鼠腦內(nèi)注射TNFα可誘發(fā)驚厥發(fā)作，在海馬內(nèi)微注射TNFα則能提高驚厥發(fā)作的閾值[11]；而在轉(zhuǎn)基因小鼠的星形膠質(zhì)細胞中過表達TNFα可誘導(dǎo)自發(fā)性驚厥發(fā)作。TNFα已被證實可增加海馬區(qū)神經(jīng)元興奮性突觸后傳遞時間而抑制γ-氨基丁酸(GABA)介導(dǎo)的抑制性突觸傳遞，從而導(dǎo)致驚厥易感性增加[12]。Choi等[13]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)S反復(fù)發(fā)作的患兒血清TNFα水平較首次驚厥發(fā)作患兒顯著升高。與驚厥持續(xù)時間較短的全身性癲癇伴FS附加癥的患兒相比，呈無熱癲癇持續(xù)狀態(tài)的難治型癲癇患兒的血清TNFα水平較高，提示TNFα持續(xù)性表達可改變驚厥易感性。

TNFα基因定位于6p21.4，有4個外顯子和3個內(nèi)含子，位于啟動子區(qū)的238位點，存在單核苷酸多態(tài)性，被認為可調(diào)節(jié)TNFα的轉(zhuǎn)錄水平，且與多種疾病的易感性相關(guān)[14-16]。目前已有的研究顯示，TNFα基因多態(tài)性與FS的相關(guān)性結(jié)果尚存在爭議。Zare-shahabadi等[17]在伊朗兒童的FS組與正常對照組的對比研究中發(fā)現(xiàn)，TNFα-238、-308 GG基因型在FS組中的分布顯著高于對照組，提示TNFα-238、-308基因多態(tài)性在FS發(fā)病機制中起著重要作用。Khoshdel等[18]在研究伊朗兒童TNFα-308、-850基因多態(tài)性與FS的相關(guān)性時發(fā)現(xiàn)，TNFα-308、-850基因多態(tài)性與SFS無顯著相關(guān)性，TNFα-308基因多態(tài)性與CFS具有相關(guān)性。Chou等[19]研究了中國臺灣省兒童細胞因子IL-1β、IL-1Rα、IL-6、IL-8、IL-10、TNFα基因多態(tài)性與FS的相關(guān)性，結(jié)果顯示，F(xiàn)S組與對照組IL-1Rα基因多態(tài)性分布的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，而未發(fā)現(xiàn)TNFα與FS具有相關(guān)性。目前鮮見TNFα-238基因多態(tài)性與FS的相關(guān)性研究。本研究采用HRM法檢測FS組、NC組、SFS亞組和CFS亞組中TNFα-238基因多態(tài)性的分布。在本研究群體中，TNFα-238位點多態(tài)性僅存在GG、GA基因型,未檢測到AA基因型，該位點各基因型及等位基因頻率在上述各分組中分布的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

TNFα-238基因多態(tài)性與FS相關(guān)性研究的結(jié)論存在不一致性，考慮其原因是散發(fā)的FS患者遺傳機制較為復(fù)雜，可能是遺傳與環(huán)境因素(免疫、神經(jīng)遞質(zhì)等)共同作用所致，尚不能夠通過單一基因型和等位基因頻率的差異來闡明FS的發(fā)病機制。此外，F(xiàn)S可能是由多個基因多態(tài)性位點通過連鎖作用對氨基酸編碼剪切、轉(zhuǎn)錄表達和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等各個環(huán)節(jié)發(fā)生影響，進而調(diào)節(jié)基因功能。研究單個基因的單一基因多態(tài)性可能會割裂多個基因多態(tài)性之間的相互影響[20]。

綜上所述，SFS患兒發(fā)作時體溫和發(fā)作后血糖水平顯著高于CFS患兒，這與SFS高熱導(dǎo)致機體應(yīng)激狀態(tài)相關(guān)。應(yīng)注意監(jiān)測FS特別是SFS患兒的血糖水平，以預(yù)防高血糖所致的相關(guān)損害。在本研究群體中尚未發(fā)現(xiàn)TNFα-238基因多態(tài)性與中國漢族兒童SFS和CFS發(fā)生的相關(guān)性，后續(xù)應(yīng)進一步完善大樣本量、包含更大家系的研究來驗證上述結(jié)論。