彭 輝，周紅敏，張弓喬，王宏翔

（1.鳳陽山管理處，浙江 龍泉 323700；2.龍泉市林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 龍泉 323700；3.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)研究所，國(guó)家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；4.廣西大學(xué) 林學(xué)院，廣西 南寧 530000）

微生物分布廣泛，在任何生境中幾乎都可以生存，是地球上生物多樣性最多的生命形式[1-2]。土壤真菌是分解者中的先鋒物種，在森林生態(tài)系統(tǒng)中參與物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)等[3-5]。真菌群落的結(jié)構(gòu)變化是生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)的重要指標(biāo)[6]。相關(guān)研究表明，土壤中真菌群落的變化跟土壤中的氮磷等營(yíng)養(yǎng)元素[7]和pH 值[8]等理化性質(zhì)有關(guān),且真菌對(duì)土壤環(huán)境的變化比細(xì)菌更為靈敏[9]。

紅豆樹Ormosia hosiei是我國(guó)特有種，為國(guó)家Ⅱ級(jí)瀕危重點(diǎn)保護(hù)物種[10]。紅豆樹樹形優(yōu)美，木材光滑堅(jiān)硬、紋理美麗，具有極高的材用、景觀和森林文化價(jià)值。目前，對(duì)紅豆樹的研究主要為遺傳多樣性研究[11-12]、容器苗規(guī)格和施肥量[13]等方面的研究。劉燕等[14]對(duì)紅豆樹根圍深色有隔內(nèi)生真菌的分離、鑒定及接種效應(yīng)進(jìn)行了報(bào)道，但不同林齡紅豆樹土壤中真菌群落組成尚未揭示。本研究以不同林齡的紅豆樹為研究對(duì)象，通過Illumina Miseq 測(cè)序技術(shù)，分析研究不同林齡紅豆樹土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，以期為紅豆樹的培育和保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)研究地位于浙江省龍泉市林科院基地內(nèi)，地理坐標(biāo)為28°01′58″N，119°05′33″E，海拔252 m，該研究樣地屬于中亞熱帶季風(fēng)氣候，年均氣溫17.7℃，年均降水量1 646.9 mm，年均相對(duì)濕度79%。年均無霜期261.2 d；年均溫17.7℃，極端最高溫41.5℃，極端最低溫為-8.5℃。該區(qū)分布有杉木Cunninghamia lanceolata、紅豆樹和木荷Schima superba等森林資源。

2 研究方法

2.1 樣地設(shè)置和樣品采集

采集土樣的時(shí)間為2020年5月，采用空間替代的方法，按照S 形取樣在紅豆樹幼齡林（7 a）、中齡林（20 a）和成熟林（45 a）林分內(nèi)分別設(shè)置3 個(gè)20 m×20 m 的標(biāo)準(zhǔn)樣地，幼齡林、中齡林和成熟林分別標(biāo)記為記為A、B、C，3 個(gè)林齡的紅豆樹林地勢(shì)均較為平坦，土壤為紅壤，林下植被均為草本，幼齡林的草本以多為蕨類，中齡林和成熟林的草本以麥冬居多。3 個(gè)林齡的坡向均為東南方向，中齡林的地勢(shì)相對(duì)緩和，幼齡林和成熟林坡度在31°～35°，幼齡林、中齡林和成熟林的平均樹高分別為4.9、8.1 和14.5 m。平均胸徑分別為7.8、12.1、29.7 cm。每個(gè)樣地內(nèi)土壤取樣采用5 點(diǎn)取樣法，除去地表枯落物，采集0～20 cm處土樣，將5 個(gè)取樣點(diǎn)的土樣等量混合，每個(gè)林齡作為1 個(gè)處理，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。將土樣分為兩份，一份放入無菌自封袋后及時(shí)保存在-80℃冰箱，用于土壤細(xì)菌群落高通量測(cè)定；另一份風(fēng)干后（過2 mm 篩）用于土壤理化性質(zhì)測(cè)定。

2.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤理化性質(zhì)分析采用《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[15]。全氮采用AA3-連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定；全磷采用UV2450-紫外分光光度計(jì)測(cè)定；全鉀采用FP6410-火焰光度計(jì)測(cè)定；有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀外加熱法測(cè)定；有效磷采用UV2450-紫外分光光度計(jì)測(cè)定，堿解氮采用堿解-擴(kuò)散法測(cè)定；pH值由（德國(guó)）賽多利斯-pb-10-pH 計(jì)測(cè)定。

2.3 土樣DNA 測(cè)序和PCR 擴(kuò)增測(cè)序

土壤總DNA 進(jìn)行抽提采用Omega Bio-Tek 公 司 的E.Z.N.A.? Soil DNA Kit 試劑盒，從0.5 g 的土樣中用1%瓊脂糖凝脂電泳進(jìn)行DNA 的完整性檢驗(yàn)。DNA 的純度和濃度采用NanoDrop2000 進(jìn)行檢測(cè)。真菌引物為SSU0817F（5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′） 和1196R（5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′）對(duì)真菌V5-V7 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增[16]。包括：各4 μL 5×FastPfu 緩沖液和FastPfu 緩沖液，2 μLdNTPs（2.5 mmo/L），各0.8 μL 上下游引物，DNA 模板10 ng。ddH2O 20 μL。PCR 擴(kuò)增條件為：95℃3 min 預(yù)變性，然后95℃ 30 s 變性，55℃ 30 s，72℃ 45 s，9 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。由Miseq 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

2.4 數(shù)據(jù)分析

原始測(cè)序序列采用fastp[17]進(jìn)行質(zhì)控，優(yōu)化序列通過使用UCHIME 軟件剔除嵌合體得到[18]。樣品多樣性指數(shù)（Shannon 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Chao1指數(shù)等）使用Mothur（1.30.2）軟件進(jìn)行分析，采用SPSS 19.0 軟件對(duì)不同處理的差異顯著性進(jìn)行分析。門和綱水平的真菌群落豐度采用Excel 2010 軟件進(jìn)行繪圖，土壤理化性質(zhì)與土壤真菌群落相關(guān)性采用冗余分析（Redundancy analysis，RDA）。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同林齡土壤理化性質(zhì)

由表1可知，有機(jī)質(zhì)、全磷和pH 值在3 個(gè)林齡間不存在顯著差異（P＞0.05）。中齡林土壤中全氮、堿解氮的含量最高，幼齡林和成熟林土壤全氮的含量分別是成熟林的33.89%、63.33%，幼齡林和成熟林土壤堿解氮含量分別是中齡林的42.09%、71.86%。成熟林土壤有效磷的含量顯著高于其它2 個(gè)林齡，為4.24 mg/kg，幼齡林和中齡林土壤的有效磷含量分別是成熟林的0.08%和63.92%。幼齡林土壤中全鉀的含量最高，為10.39 g/kg，全鉀含量和其它2 個(gè)林齡的土壤全鉀含量存在顯著差異（P＜0.05）。成熟林土壤中的速效鉀含量最高，幼齡林和中齡林土壤中速效鉀含量分別是成熟林的75%和92.11%。

表1 不同林齡土壤理化性質(zhì)?Table 1 Soil physicochemical properties of different stand ages

3.2 真菌高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析

從3 個(gè)不同林齡的紅豆樹土壤中獲得有效序列條數(shù)為461 505 條，平均長(zhǎng)度為381 bp。3 個(gè)林齡土壤樣品的覆蓋度均在99.9%以上，從圖1可知，紅豆樹3 個(gè)不同林齡的稀釋曲線隨著測(cè)序數(shù)量的增加漸趨于平坦，說明本次實(shí)驗(yàn)獲取了土壤樣品的大部分信息，測(cè)序結(jié)果真實(shí)地反映了真菌群落的情況。

圖1 真菌群落稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve analysis of OTUS

3.3 土壤真菌群落的Alpha 多樣性

Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)常用來估算土壤樣品中微生物的Alpha 多樣性，ACE 指數(shù)和Chao1 指數(shù)是生態(tài)學(xué)中估計(jì)生物物種總數(shù)和菌群豐富度的常用指數(shù)。3 個(gè)林齡土壤真菌的Shannon 指數(shù)存在顯著差異（P＜0.05），幼齡林土壤真菌Shannon 指數(shù)最高。3 個(gè)林齡土壤真菌的ACE 指數(shù)、Chao1 指數(shù)為中齡林＞成熟林＞幼齡林，幼齡林的ACE 指數(shù)和Chao1 指數(shù)顯著低于中齡林和成熟林（P＜0.05），中齡林和成熟林間的真菌數(shù)量和相對(duì)豐度差異不顯著。成熟林的Simpson 指數(shù)顯著高于幼齡林和中齡林（P＜0.05），說明成熟林的真菌群落分布更集中。

3.4 真菌群落組成分析

3 個(gè)林齡土壤樣品中共檢測(cè)出真菌門26 個(gè)，其中共有真菌門20 個(gè)，占總量的76.9%。3 個(gè)林齡土壤中含有的真菌門數(shù)分別為22、25、23。3 個(gè)林齡的土樣中真菌門豐度超過1%的有5 個(gè)（圖3），按照豐度高低為子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、毛霉菌門（Mucoromycota）、unclassified_d__Eukaryota、unclassified_k__Fungi。3 個(gè)林齡的土壤樣品的優(yōu)勢(shì)菌門均在95%以上。通過對(duì)真菌優(yōu)勢(shì)菌門豐度的顯著差異分析，幼齡林土壤中擔(dān)子菌門豐度與和中齡林存在顯著差異（P＜0.05），與成熟林土壤擔(dān)子菌門豐度存在極顯著差異（P＜0.01），在成熟林土壤中擔(dān)子菌門豐度最大。幼齡林土壤中毛霉菌門的豐度最大，與成熟林土壤中毛霉菌門的豐度存在顯著差異（P＜0.05）。3 個(gè)林齡的紅豆樹樣品中共檢測(cè)出真菌綱67 個(gè)，真菌綱豐度在1%以上的有11 個(gè)，分別為銀耳綱（Tremellomycetes）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）、散囊菌綱（Eurotiomycetes）、傘菌綱（Agaricomycetes）、古菌根菌綱（Archaeorhizomycetes）、norank_p__Mucoromycota（未分類毛霉菌綱）、unclassified_d__Eukaryota、unclassified_k__Fungi、錘舌菌綱（Leotiomycetes）、座囊菌綱（Dothideomycetes）、unclassified_p__Ascomycota。幼齡林土壤中銀耳綱豐度與中齡林存在顯著差異（P＜0.05），與成熟林存在極顯著差異（P＜0.01），成熟林土壤中銀耳綱豐度最高。幼齡林土壤中糞殼菌綱和散囊菌綱豐度與其它2 個(gè)林齡存在顯著差異（P＜0.05），糞殼菌綱在中齡林土壤中豐度最大，散囊菌綱在幼齡林土壤中豐度最高。幼齡林土壤中古根菌綱豐度最高，且和其它2 個(gè)林齡存在極顯著差異（P＜0.01）。幼齡林土壤中傘菌綱豐度最大，且與成熟林存在顯著差異（P＜0.05）。norank_p__Mucoromycota、錘舌菌綱和座囊菌綱在3 個(gè)林齡中差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 門和綱水平下的真菌物種Venn 圖像Fig.2 Venn map of fungal community at phylum level (A) and class level (B)

圖3 門和綱水平下優(yōu)勢(shì)菌的相對(duì)豐度Fig.3 The relative abundance of dominant fungal at phylum and class level

表2 不同林齡土壤真菌多樣性分析Table 2 Analysis of fungal community diversity in the soil of different forest stand ages

3.5 群落多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)關(guān)系

表3為土壤真菌多樣性指數(shù)與土壤理化因子的相關(guān)性分析。由表4可以看出，Shannon 指數(shù)與全鉀呈極顯著負(fù)相關(guān)，與pH 值呈顯著負(fù)相關(guān)。ACE 指數(shù)與有效磷呈顯著正相關(guān)，與全鉀呈極顯著負(fù)相關(guān)。Chao1 指數(shù)與有效磷和速效鉀均呈顯著負(fù)相關(guān)。Simpson 指數(shù)與有效磷和速效鉀均呈顯著正相關(guān)。

表3 土壤真菌多樣性指數(shù)與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)系數(shù)?Table 3 Correlation coefficients between soil fungal diversity index and soil physicochemical properties

3.6 環(huán)境因子對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

通過RDA 分析可知（圖4），第一和第二排序軸的解釋率為96.61%。通過各環(huán)境因子對(duì)第一排序軸和第二排序軸的投影分析，速效鉀對(duì)真菌群落的影響最大，其次為有效磷、再次為全鉀和pH 值，有機(jī)質(zhì)對(duì)真菌群落的影響最小。由表4可知，有效磷、速效鉀和全磷對(duì)毛霉菌門（Mucoromycota）呈顯著負(fù)相關(guān)。速效鉀對(duì)擔(dān)子菌門（Basidiomycota）呈極顯著正相關(guān)，有效磷對(duì)擔(dān)子菌門（Basidiomycota）呈顯著正相關(guān)。

表4 土壤優(yōu)勢(shì)真菌門相對(duì)豐度和土壤理化性質(zhì)相關(guān)關(guān)系Table 4 Correlation between soil physicochemical properties and dominant phyla in fungal community

圖4 土壤真菌與土壤理化性質(zhì)的冗余分析Fig.4 Representative difference analysis of the relationships between soil physicochemical properties and fungal communities

4 討 論

4.1 不同林齡對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)影響

本研究中子囊菌門和擔(dān)子菌門是占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的2 個(gè)菌門，在3 個(gè)林齡中兩者的豐度之和為84.2%～90.2%，與呼倫貝爾沙區(qū)4 種生境[19]中子囊菌門和擔(dān)子菌門是優(yōu)勢(shì)菌群的研究結(jié)果一致。子囊菌和擔(dān)子菌屬于高等真菌，均適生于透氣性好的酸性土壤。子囊菌大多數(shù)是腐生菌，可以將林分中較難降解的角質(zhì)素等進(jìn)行分解，對(duì)森林生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)具有重要作用[21]。在本研究中3 個(gè)林齡的紅豆樹林土壤均為酸性，中齡林的pH 值最低，其次為成熟林，最高的為幼齡林，子囊菌門在pH 值最高的幼齡林土壤中相對(duì)豐度最高，這與鄧嬌嬌等[20]子囊菌門在pH 值最低的油茶林分中相對(duì)豐度較高的研究結(jié)果不同。子囊菌門在3 個(gè)林齡土壤中的豐度表現(xiàn)為幼齡林＞中齡林＞成熟林，可能是因?yàn)橛g林的郁閉度較低，而子囊菌門的進(jìn)化速率優(yōu)于擔(dān)子菌門，具有較耐輻射等特性[22]，更適生于郁閉度低的環(huán)境。Chao1 指數(shù)和ACE 指數(shù)則表現(xiàn)出隨著pH 值的升高真菌數(shù)量和相對(duì)豐度下降的趨勢(shì)，這與楊立斌等[23]對(duì)大興安嶺興安落葉松的研究結(jié)果相似。成熟林的Shannon 指數(shù)最低，Simpson 指數(shù)最高，說明成熟林土壤中真菌多樣性低且分布比較集中，可能跟成熟林的根系較發(fā)達(dá)，對(duì)土壤的影響作用較大有關(guān)。

4.2 土壤理化性質(zhì)對(duì)土壤真菌群落及多樣性的影響

土壤中氮和磷的含量和土壤微生物活性密切相關(guān)[24-25]。幼齡林土壤中子囊菌的豐度最高，本研究與鄧嬌嬌等[26]對(duì)遼東山區(qū)兩種針葉人工林中子囊菌門在高pH 值、低速效鉀的土壤中相對(duì)豐度較高的研究結(jié)果相一致。不同林齡紅豆樹土壤真菌多樣性差異顯著，研究表明，土壤微生物多樣性不僅和物種數(shù)相關(guān)，還與物種分布的均勻度有緊密聯(lián)系[27]。幼齡林的Shannon 指數(shù)顯著高于中齡林和成熟林，幼齡林土壤真菌多樣性最高，但ACE 指數(shù)、Chao1 指數(shù)又顯著低于其它2 個(gè)林齡，幼齡林的Simpson 指數(shù)最低，可能是因?yàn)橛g林中雖然物種數(shù)量較少，但土壤真菌的分布比較均勻有關(guān)。群落多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)關(guān)系和RDA 分析表明，對(duì)土壤真菌群落具有顯著影響的4 個(gè)因子為速效鉀、有效磷、全鉀和pH 值。速效鉀對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)特征的影響最大，其次為全鉀。優(yōu)勢(shì)真菌門相對(duì)豐度和土壤理化性質(zhì)相關(guān)關(guān)系表明，速效鉀和有效磷均與擔(dān)子菌門呈正相關(guān)，與毛霉菌門呈顯著負(fù)相關(guān)。與張沛健等[28]的研究結(jié)果相似，本研究的土壤中有機(jī)質(zhì)和全氮含量表現(xiàn)為中齡林＞成熟林＞幼齡林。中齡林的Chao1指數(shù)和ACE 指數(shù)最高，說明中齡林的真菌數(shù)量和相對(duì)豐度最大，與中齡林的土壤養(yǎng)分含量高有關(guān)，為真菌的生長(zhǎng)繁殖提供較優(yōu)的條件。本研究中得出的不同林齡紅豆樹真菌群落結(jié)構(gòu)特征，對(duì)評(píng)價(jià)紅豆樹人工林土壤質(zhì)量演替變化和土壤微生態(tài)系統(tǒng)具有重要意義。但3 個(gè)不同林齡紅豆樹林中還有部分真菌的序列未檢出，在接下去的研究中還需要進(jìn)行進(jìn)一步分析鑒定，以期為解決長(zhǎng)期種植紅豆樹導(dǎo)致的地力衰退提供理論依據(jù)。

5 結(jié) 論

1）幼齡林、中齡林和成熟林3 個(gè)林齡土壤真菌多樣性和相對(duì)豐度差異顯著，幼齡林土壤中真菌多樣性高且分布均勻；中齡林土壤真菌的數(shù)量和豐度最大。中齡林和成熟林土壤真菌群落間的差異較小，變化趨勢(shì)相對(duì)一致。

2）3 個(gè)林齡的土壤樣品中共檢測(cè)到真菌有26個(gè)門，67 個(gè)綱，101 個(gè)目，127 個(gè)科，145 個(gè)屬。子囊菌門和擔(dān)子菌門是占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的2 個(gè)菌門，2個(gè)豐度之和占真菌總量的74.2%～90.2%。3 個(gè)林齡土壤中前三的優(yōu)勢(shì)菌為銀耳綱、糞殼菌綱和散囊菌綱，其中幼齡林土壤中散囊菌綱的豐度最高，中齡林土壤中糞殼菌綱的豐度最高，成熟林土壤中銀耳綱豐度最高。中齡林的土壤理化性質(zhì)優(yōu)于幼齡林和成熟林，土壤真菌數(shù)據(jù)和相對(duì)豐度高于其它2 個(gè)林齡。土壤速效鉀、有效磷、全鉀和pH值是影響3 個(gè)林齡土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的主要因子。建議隨著紅豆樹種植年限的增加，在紅豆樹經(jīng)營(yíng)中，要適當(dāng)施用磷肥和鉀肥。研究結(jié)果為不同林齡紅豆樹土壤肥力和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)研究提供了理論支撐。