劉 倩，谷振軍，符 潮，2，楊春霞

（1.江西省林業(yè)科學院，江西 南昌 330032；2.中南林業(yè)科技大學，湖南 長沙 410004）

梔子Gardenia jasminoides是茜草科Rubiaceae植物中的一種傳統(tǒng)中藥，具有鎮(zhèn)痛止血、護肝利膽、消炎消腫等作用，主要產(chǎn)自江西、湖南、四川、重慶等地，種植面積廣，產(chǎn)量高[1-2]。梔子果實中的活性成分之一西紅花苷是一種能夠抗氧化、炎癥以及腫瘤的脫輔基類胡蘿卜素類化合物[3-4]，包括西紅花苷I、II、III、IV、V，主要成分為西紅花苷I，存在于鳶尾科Iridaceae植物番紅花Crocus sativus的柱頭和梔子果實中。由于番紅花柱頭產(chǎn)量極低且價格昂貴，而種植面積廣且產(chǎn)量高的梔子果實中的西紅花苷含量僅次于番紅花柱頭，因此，梔子果實有望替代番紅花成為生產(chǎn)西紅花苷的主要來源。

近年來，梔子西紅花苷生物合成途徑中的關(guān)鍵基因的克隆與表達模式分析成為熱門研究，尤其梔子染色體水平基因組的破譯為西紅花苷合成生物學研究及梔子分子輔助育種等提供理論支撐。西紅花苷在生物體內(nèi)合成復雜，由多種酶共同催化生成。西紅花苷合成的骨架物質(zhì)為異戊二烯焦磷酸（isopentenyl diphosphate,IPP），而IPP合成則來自質(zhì)體內(nèi)的甲基赤蘚糖磷酸MEP 途徑（Rodríguez-Concepción,2004），1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶 （DXS）是MEP 途徑中的限速酶[5-6]。目前在梔子中已發(fā)現(xiàn)一些參與西紅花苷合成的相關(guān)基因，并研究了乙烯反應(yīng)元件因子基因（ERF）、八氫番茄紅素合成酶基因（PSY）、八氫番茄紅素脫飽和酶基因（PDS）、類胡蘿卜素剪切雙加氧酶基因（CCD4）等關(guān)鍵基因的克隆與表達分析[7-11]。

UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶家族基因（UGT）編碼一種葡萄糖醛酸化途徑的UDP 葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，負責將尿苷5′-二磷酸葡萄醛酸轉(zhuǎn)移至形成β-d 葡萄糖醛酸的有效底物上[12-13]，參與花色苷的生物合成以及調(diào)節(jié)有機體的生物活性[14-15]。在西紅花苷合成途徑中，糖基轉(zhuǎn)移酶催化最后一步的合成，即將非親水性西紅花酸催化生成水溶性的西紅花苷[16]。有研究表明在梔子果實中發(fā)現(xiàn)了兩個糖基轉(zhuǎn)移酶 UGT75L6 和UGT94E5 在西紅花苷合成中催化糖基化反應(yīng)[17-18]。最新研究完整解析了西紅花苷生物合成途徑中GjUGT74F8 和GjUGT94E13共同催化西紅花酸合成西紅花苷[19]，并在此基礎(chǔ)上將梔子來源的UGT 整合至大腸桿菌中高效合成西紅花苷[20]，但對該家族基因的克隆表達及分析卻鮮有報道。因此，本研究基于梔子轉(zhuǎn)錄組功能注釋結(jié)果，在梔子中發(fā)現(xiàn)UGT家族基因87 個，主要包括GT1、GT3、UGT74F8、UGT94E5-1、UGT94E5-2、UGT709C2、UGT86A1和UGT85A2等基因，從中挑選出2 個差異表達的基因UGT86A1與UGT85A2進行克隆，對其蛋白理化性質(zhì)、信號肽和亞細胞定位預測、跨膜結(jié)構(gòu)、基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)以及不同物種中同源性對比進行分析，同時對兩個基因進行組織表達特異性分析和西紅花苷-1 含量測定，為闡明梔子中西紅花苷的合成調(diào)控機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

梔子葉、花、7月果（果皮綠色，果肉白色）、8月果（果皮綠色，果肉淺黃色）、9月果（果皮淺黃色，果肉橘色）以及11月果（果皮紅色，果肉橘紅色）均采自江西省共青城（29°11′24″N,115°46′48″E），所有材料75%酒精消毒后剪下立即放入液氮中速凍，-80℃保存。

1.2 試驗試劑

RNA 提取試劑盒（0416-50 GK 型）購自華越洋生物有限公司，大腸桿菌（trans5α）感受態(tài)（CD201）、pEASY?-Blunt Zero Cloning Kit（CB501-01）載體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR420A）、膠回收試劑盒（9762）以及熒光定量PCR試劑盒（RR036A）購自TaKaRa 公司，西紅花苷I 對照品（B21337，純度≥98%)購自西上海源葉生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 UGT86A1 和UGT85A2 基因克隆

采用華越洋RNA 提取試劑盒提取梔子成熟果實的RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)成cDNA?；跅d子轉(zhuǎn)錄組功能注釋結(jié)果，利用GENSCAN、Pfam 和SMART 得到候選的具有全長開放閱讀框（ORF）的UGT86A1與UGT85A2序列，利用Oligo 7 設(shè)計出UGT86A1、UGT85A2的ORF克隆引物（表1）進行聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增，PCR反應(yīng)體系為：模板cDNA 50 ng，Primer STAR Max DNA polymerase（2×）25 μL，正向和反向引物（10 μmol/L）各1.0 μL，加滅菌的Milli-Q 水補充至50 μL。PCR 的擴增程序為：98℃10 s，55℃ 5 s，72℃ 10 s，35 個循環(huán)；72℃3 min。PCR 擴增產(chǎn)物通過回收純化后與pEASY?-Blunt Zero Cloning Vector 進行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（trans5α）感受態(tài)細胞中，挑取陽性單克隆細胞進行擴繁，經(jīng)驗證后進行測序分析。引物合成由金斯瑞生物科技有限公司完成，序列測定由TaKaRa 公司完成。

1.3.2 生物信息學分析

利用在線工具ExPasy ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析梔子UGT86A1 與UGT85A2 蛋白分子質(zhì)量、氨基酸組成以及等電點等蛋白理化性質(zhì)。運用SignalP 5.0（ http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測UGT86A1 和UGT85A2 蛋白的信號肽，TMHMM Server v.2.0（ http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測蛋白質(zhì)跨膜區(qū)，Cell-PLoc 2.0（ http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）預測亞細胞定位。使用在線軟件SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預測UGT86A1 和UGT85A2 蛋白的二級結(jié)構(gòu)，通過Pfam 數(shù)據(jù)庫（ http://pfam.xfam.org/）預測蛋白的結(jié)構(gòu)域。采用ClustalX 2.0 軟件對UGT86A1、UGT85A2 蛋白進行多重序列對比，隨后用MEGA 7.0 軟件進行系統(tǒng)進化樹的分析?？臻g結(jié)構(gòu)預測使用SWISS-PDB 在線軟件（https://swissmodel.expasy.org/）進行分析。

1.3.3 UGT86A1 和UGT85A2 基因組序列測定

梔子果實DNA 按照CTAB 法進行提取[21]，用ORF 框正反引物擴增基因UGT86A1、UGT85A2在梔子基因組上的序列。擴增正確的目的片段經(jīng)切膠回收、連接T 載體后，在大腸桿菌trans5α中轉(zhuǎn)化，PCR 菌液檢測陽性菌落后送測。引物合成由金斯瑞生物科技有限公司完成，序列測定由TaKaRa 公司完成。

1.3.4 熒光定量PCR

分別以梔子的不同組織葉、花、7月果、8月果、9月果以及11月果的cDNA 為模板，對梔子UGT86A1、UGT85A2基因進行實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應(yīng)（qRT PCR）檢測。用Primer Premier 5 軟件設(shè)計18S、UGT86A1和UGT85A2的熒光定量引物（表1）。qRT-PCR 使用TB Green?Premix Ex TaqTM試劑盒在CFX96 Real-Time PCR Detection System 儀器上進行測定，每個樣品進行3 次重復。反應(yīng)體系為：TB Green Premix Ex Taq（2×）12.5 μL，正向和反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA 模板2 μL，加滅菌的Milli-Q 水補充至25 μL。反應(yīng)程序為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃30 s，40 個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后通過溶解曲線檢測引物的特異性。以18S基因作為內(nèi)參基因，運用2-△△CT計算基因相對表達量。

表1 梔子克隆和熒光定量引物序列Table 1 Gardenia jasminoides cloning and fluorescent quantitative primer sequence

1.3.5 西紅花苷含量測定

采用高效液相色譜法（HPLC）測定梔子不同部位及不同發(fā)育階段果實的西紅花苷-I 含量。取梔子藥材粉末約0.35 g，精密稱定，分別置100 mL容量瓶中，用50%乙醇定容，超聲提取30 min，放冷，經(jīng)0.45 mm 微孔濾膜，濾液即為供試品溶液。色譜條件：島津LC-20AT HPLC，島津ODS 柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)：1%乙酸水(B)梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長440 nm，進樣量20 μL，柱溫30℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 梔子UGT86A1、UGT85A2 基因克隆及序列分析

以UGT86A1、UGT85A2基因的ORF 框特異性引物，以梔子成熟果實cDNA 為模板，PCR擴增分別獲得987、1 446 bp 的目的基因片段，推導其編碼的氨基酸數(shù)目分別為328 和481 個。UGT86A1 蛋白中含量最高的氨基酸為絲氨酸（Ser），占總氨基酸的9.8%，帶負電殘基總數(shù)，即天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）數(shù)量之和為39 個，帶正電荷的殘基總數(shù)，即精氨酸（Arg）和賴氨酸（Lys）數(shù)量之和為30 個；而UGT85A2蛋白中含量最高的氨基酸為異亮氨酸，占總氨基酸的12.5%，帶負電殘基總數(shù)為60 個，帶正電荷的殘基總數(shù)為43 個。通過分析預測UGT86A1 和UGT85A2 蛋白分子質(zhì)量（MW）分別約為36.6和53.5 kD，理論等電點（pI）分別為5.23 和5.06，脂溶指數(shù)（Aliphatic index）分別為99.48和91.23。UGT86A1 和UGT85A2 蛋白的原子組成均有C、H、N、O、S，UGT86A1 蛋白的原子總數(shù)是5 156，為C1648H2578N432O485S13；UGT85A2蛋白的原子總數(shù)是7 518，為C2411H3758N614O712S23。UGT86A1 不穩(wěn)定性指數(shù)（II）為35.65，據(jù)此將該蛋白歸類為穩(wěn)定蛋白；UGT85A2 蛋白不穩(wěn)定性指數(shù)（II）為45.22，據(jù)此將該蛋白歸類為不穩(wěn)定蛋白。UGT86A1 和UGT85A2 蛋白總平均親水性（GRAVY）分別為0.047 和-0.130，預測UGT86A1 蛋白為疏水性蛋白，UGT85A2 蛋白為親水性蛋白。

SignalP 5.0 預測梔子UGT85A2 蛋白無信號肽，UGT86A1 氨基酸序列的N 端具有信號肽酶切位點，切割位點位于18 和19 位氨基酸之間（圖1）。TMHMM Server v.2.0 預測UGT86A1 與UGT85A2 均無跨膜結(jié)構(gòu)。根據(jù)Cell-PLoc 2.0 預測顯示，UGT86A1 與UGT85A2 蛋白均為葉綠體蛋白。使用SOPMA 在線軟件預測UDPG14 蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示UGT86A1與UGT85A2α 螺旋（Alpha helix）結(jié)構(gòu)分別占41.77%和43.04%，延伸鏈（Extended strand）結(jié)構(gòu)分別占13.11%和15.59%，β 轉(zhuǎn)角（Beta turn）結(jié)構(gòu)分別占7.01%和7.07%，無規(guī)則卷曲（Random coil）結(jié)構(gòu)分別占38.11%和34.30%。使用SWISS-PDB 在線軟件預測梔子UGT86A1、UGT85A2 蛋白空間結(jié)構(gòu)（圖2），UGT86A1 建模蛋白與模板序列相似度為32.52，而UGT85A2 建模蛋白與模板序列相似度為58.53，推測UGT85A2 蛋白同源建模更具參考意義。

圖1 UGT86A1 蛋白信號肽預測Fig.1 Prediction of signal peptide of UGT86A1 protein

圖2 梔子UGT86A1、UGT85A2 蛋白空間結(jié)構(gòu)預測Fig.2 Prediction of spatial structure of UGT86A1 and UGT85A2 proteins in Gardenia jasminoides

2.2 UGT86A1、UGT85A2 序列對比及進化樹構(gòu)建

通過BlastP 檢索發(fā)現(xiàn)，梔子UGT86A1 蛋白與同為茜草科的中粒咖啡Coffea canephora（CDP18343.1）、小粒咖啡Coffea arabica（XP_027107200.1）序列相似度高達92%～93%，與同源UGT75L6 和UGT74F8 序列相似性在85%左右，與不同科屬的藍果樹Nyssa sinensis（KAA8518730.1）、林煙草Nicotiana sylvestris（XP_009802698.1）、野生煙草Nicotiana attenuata（XP_019250687.1）、絨毛狀煙草Nicotiana tomentosiformis（XP_009610181.1） 的序列相似度也在75%以上，與同源UGT94E13相似度為74%； 梔子UGT85A2 蛋白與同源UGT75L6、UGT74F8 序列相似度高達97%，與UGT94E13、UGT94E5 序列相似度為92%，與茜草科的歐基尼奧伊德斯種咖啡Coffea eugenioides（XP_027149647）、小?？Х菴offea arabica（XP_027094782.1）、中粒咖啡Coffea canephora（CDP01076.1）的相似度高達90%以上，與茄科的寧夏枸杞Lycium barbarum（BAG80542.1）、野生煙草Nicotiana attenuata（XP_019225689.1）、夾竹桃科的長春花Catharanthus roseus（F8WLS6.1）等物種相似度也在74%以上。采用ClustalX 2.0 軟件對這些物種的氨基酸序列進行多重序列對比分析，發(fā)現(xiàn)UGT86A1 蛋白在91～286 位氨基酸區(qū)域和UGT85A2 蛋白在207～448 位氨基酸區(qū)域均存在一個保守UDPGT 結(jié)構(gòu)域，且UDPGT 蛋白在這些物種中高度保守（圖3）。

圖3 梔子UGT86A1 和UGT85A2 蛋白的氨基酸序列分析Fig.3 Amino acid sequence analysis of UGT86A1 and UGT85A2 protein from Gardenia jasminoides

續(xù)圖3Continuation of Fig.3

利用MEGA 7.0 軟件的鄰接法（Neighbor joining，NJ）對這些氨基酸序列進行系統(tǒng)進化樹分析（圖4），發(fā)現(xiàn)這些植物的UDPGT 蛋白具有共同的進化源，由兩個大的進化枝組成，UGT94E13和UGT94E5 組成第一個進化枝。第二個大進化枝由兩個小分支構(gòu)成，UGT75L6 和UGT74F8 構(gòu)成一個小分支，在另一個小分支中，梔子UGT86A1蛋白與中?？Х?、小?？Х?、藍果樹、林煙草、野生煙草、絨毛狀煙草屬于同一分支，梔子UGT85A2 蛋白與歐基尼奧伊德斯種咖啡、小?？Х取⒅辛？Х取幭蔫坭?、野生煙草和長春花屬于另一分支。在親緣關(guān)系上，梔子UGT86A1 蛋白與中?？Х?、小?？Х汝P(guān)系最近；UGT85A2 蛋白也與同屬茜草科的歐基尼奧伊德斯種咖啡、小?？Х纫约爸辛？Х汝P(guān)系最近。

圖4 UDPGT 在不同物種中的系統(tǒng)進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of UDPGT in different species

2.3 UGT86A1、UGT85A2 基因結(jié)構(gòu)分析

以梔子成熟果實DNA 為模板，PCR 擴增分別獲得987 和1 657 bp 的目的基因片段。通過將UGT86A1、UGT85A2ORF 框cDNA 序列與基因組序列進行Blast 序列對比，顯示UGT86A1基因不含內(nèi)含子（圖5A），而UGT85A2基因含有兩個外顯子一個內(nèi)含子（圖5B）。

2.4 UGT86A1、UGT85A2 基因的qRT-PCR 表達分析

運用qRT-PCR 技術(shù)對UGT86A1與UGT85A2基因在梔子不同部位及不同發(fā)育階段果實的表達情況進行定量分析（圖6）。結(jié)果表明：UGT86A1與UGT85A2在梔子葉和花中均有表達，且在葉中表達量較高；UGT86A1在梔子發(fā)育的不同階段大致呈現(xiàn)遞減式表達，即UGT86A1基因的表達量隨著梔子果實不斷發(fā)育成熟而降低，而UGT85A2在梔子果實不同發(fā)育階段則呈遞增式表達，即梔子果實的UGT85A2表達量隨著果實的不斷成熟而增加，并且11月果的表達量遠高于其他階段果實的表達量。

圖6 梔子不同發(fā)育階段的UGT86A1 和UGT85A2 表達量Fig.6 Expression of UGT86A1 and UGT85A2 in Gardenia jasminoides at different developmental stages

2.5 UGT86A1、UGT85A2 基因表達量與西紅花苷I 含量的相關(guān)性分析

運用HPLC 法對梔子中不同部位及不同發(fā)育階段果實的西紅花苷Ⅰ含量進行分析測定（圖7A），并運用SPSS 分別對西紅花苷含量與UGT86A1和UGT85A2表達相關(guān)性進行分析（圖7B）。結(jié)果表明，在梔子葉和花中檢測不到西紅花苷Ⅰ，而在梔子不同發(fā)育階段中西紅花苷含量則隨著果實不斷發(fā)育成熟而增加，在采摘期（11月初）含量達到最高。相關(guān)性結(jié)果分析表明梔子果實中西紅花苷含量的增加趨勢與UGT85A2基因表達呈現(xiàn)不顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.128），表明UGT85A2對西紅花苷合成可能具有促進作用，但不關(guān)鍵，提示下一步應(yīng)該從候選基因中進一步篩選關(guān)鍵正調(diào)控基因。西紅花苷含量與UGT86A1基因的表達量呈顯著負相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為-0.69），表明UGT86A1對西紅花苷合成可能具有負調(diào)控作用，下一步將通過遺傳轉(zhuǎn)化體系進行功能驗證。

圖7 UGT86A1、UGT85A2 基因表達與西紅花苷含量的相關(guān)性分析Fig.7 Correlation analysis of UGT86A1,UGT85A2 gene expression and crocin content

3 結(jié)論與討論

西紅花苷是梔子的有效活性成分之一，其含量的差異性是衡量梔子是否能夠作為地道中藥材的關(guān)鍵性評價指標。西紅花苷合成關(guān)鍵基因及通路的研究是梔子進一步深入研究的關(guān)注點。眾多相關(guān)研究認為UGT基因家族是控制梔子西紅花苷合成的重要基因家族之一。因此，本研究對UGT基因家族中UGT86A1與UGT85A2的克隆表達模式進行分析，并對其所控制合成的蛋白結(jié)構(gòu)及親源性關(guān)系進行預測，結(jié)果表明UGT86A1與UGT85A2基因編碼的蛋白均與同為茜草科植物的中粒咖啡、小?？Х扔H緣關(guān)系最近，這一點基本與茜草科植物遺傳背景與進化關(guān)系保持一致。

其次，UGT是膜結(jié)合酶超家族，其糖基化調(diào)控機制在植物激素平衡、脅迫防御反應(yīng)及次生代謝產(chǎn)物修飾等方面發(fā)揮重要作用[13]。大部分的植物激素及植物花果中類黃酮、類胡蘿卜素等物質(zhì)的合成與積累均需要糖基轉(zhuǎn)移酶的參與[22]。如最常見的類黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（3GT)能夠催化葡萄糖糖基化取代花色素3-OH 基團，使花色素合成為各種花色苷[13]；也有相關(guān)研究表明UGT73B6，UGT72B14等UGT基因家族通過控制合成尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，在紅景天苷合成途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。UGT基因的表達存在正負調(diào)控作用，相關(guān)研究表明，sgUDPG1基因?qū)α_漢果甜苷的合成具有正調(diào)控作用[24]，海蓀鳶尾在鎘脅迫下部分UGT基因會出現(xiàn)負調(diào)控作用[13]。西紅花苷作為植物次生代謝物中的一種類胡蘿卜素，其合成積累同樣需要糖基轉(zhuǎn)移酶的參與。Dufresne 等[25]與Cote 等[26]研究發(fā)現(xiàn)并證實番紅花中兩個糖基轉(zhuǎn)移酶GTase1 和GTase2 能夠催化西紅花酸生成西紅花苷。梔子基因組完整解析了GjUGT74F8 和GjUGT94E13 共同催化西紅花酸合成西紅花苷[19]，進一步證實了UGT基因家族在西紅花苷合成途徑中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

梔子基因組的破譯為梔子西紅花苷合成關(guān)鍵基因的挖掘與合成通路的研究提供了基礎(chǔ)，但UGT基因家族中眾多基因的作用與西紅花苷合成的關(guān)聯(lián)性亟需進一步分析驗證。相關(guān)研究表明，在梔子果實中有兩個糖基轉(zhuǎn)移酶UGT75L6 和UGT94E5 在西紅花苷合成中催化糖基化反應(yīng)，但結(jié)果表明其基因的表達與西紅花苷積累并無相關(guān)性[17-18]。而本研究結(jié)果表明梔子UGT85A2 的表達西紅花苷含量積累無顯著相關(guān)，而UGT86A1 的表達與梔子果實中西紅花苷的積累具有顯著負相關(guān)性。因此，推測UGT86A1在梔子西紅花苷合成中發(fā)揮負向調(diào)控作用。這一點為解析UGT基因家族參與調(diào)控西紅花苷合成的相關(guān)研究提供了新的思路與證據(jù)。由于梔子本體遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建具有局限性，下一步將研究這兩個基因在煙草、擬南芥中的遺傳表達及其亞細胞定位分析等，最終闡明其在梔子中的生物學功能及其調(diào)控機制。