劉倩琪 王學(xué)林

（廣東省深圳市農(nóng)業(yè)科技促進(jìn)中心，廣東 深圳 518000）

bar基因來(lái)源于土壤吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus），具有良好的抗草丁膦除草劑的性能，多用作轉(zhuǎn)基因植物的選擇標(biāo)記。據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（ISAAA）公布，油菜、棉花、菊苣、玉米、水稻、大豆等6種植物58個(gè)品系以bar作為篩選標(biāo)記基因。

我國(guó)在轉(zhuǎn)基因植物研發(fā)、選育、鑒定過(guò)程中，常把bar基因作為轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的重要靶標(biāo)元件。

研發(fā)機(jī)構(gòu)因研究材料差異而選擇不同的bar基因或者改造bar基因作為分子標(biāo)記，國(guó)標(biāo)、行標(biāo)中bar基因則規(guī)定檢測(cè)175 bp和262 bp兩個(gè)片段，顯然無(wú)法滿足bar基因多樣性的要求；檢測(cè)出與目的片段大小不一致的特異性電泳條帶，按照標(biāo)準(zhǔn)判定為陰性，可能會(huì)造成漏檢；普通的凝膠電泳分辨率較低，亦無(wú)法判斷待測(cè)樣外源基因序列是否與標(biāo)準(zhǔn)提供的序列一致，從而導(dǎo)致目的片段差異較小或序列內(nèi)部存在差異時(shí)，難以判定。

本文針對(duì)檢測(cè)工作中發(fā)現(xiàn)的水稻和小麥兩個(gè)待測(cè)樣中與目標(biāo)序列不同的特異性bar基因片段，采用PCR產(chǎn)物測(cè)序法進(jìn)行序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)水稻和小麥待測(cè)樣品的bar基因盡管上下游引物序列相同，內(nèi)部基因序列差異較大，相似度低，說(shuō)明測(cè)序技術(shù)能夠更精準(zhǔn)地判定待測(cè)樣陰陽(yáng)性，該研究轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)及其標(biāo)準(zhǔn)修訂具有重要的參考意義。

1.材料與方法

1.1 材料

水稻種子由上級(jí)主管部門(mén)的市場(chǎng)監(jiān)督抽查任務(wù)所獲得，小麥樣品為某品牌在售干面條；標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣品為檢測(cè)bar基因的MS1。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板制備

取100 g水稻樣品種子于粉碎機(jī)粉碎后取研磨杯杯壁細(xì)粉100 mg分裝至離心管備用；小麥樣品取100g樣品折碎后于粉碎機(jī)粉碎，同樣取研磨杯杯壁細(xì)粉100 mg分裝至離心管備用；標(biāo)準(zhǔn)樣品直接取樣100 mg分裝至離心管，采用DNeasy Plant Mini Kit試劑盒，按照其操作手冊(cè)，提取樣品DNA，經(jīng)超微量核酸蛋白分析儀測(cè)定DNA濃度及純度，后調(diào)整濃度至50 ng/μl，-20℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物及序列

根據(jù)現(xiàn)行《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)bar或pat基因定性PCR方法》（農(nóng)業(yè)部1782-6-2012號(hào)公告）公布的bar基因引物序列（bar-F:5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3’，bar-R:5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3'），分別合成bar基因的上下游引物。bar基因標(biāo)準(zhǔn)序列如下：

1.2.3 PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物檢測(cè)

DNA模板2μl、5μl Taq聚合酶、上下游引物各0.2μl，加水2.6μl定容至10μl反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)程序：94℃10s；94℃ 5s，60℃ 34s，35 cycles；10℃ ∞。PCR 產(chǎn)物用2% 濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.4 序列分析

待測(cè)樣和對(duì)照樣bar基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由華大基因公司進(jìn)行雙向測(cè)序，重復(fù)2次，測(cè)定的上下游序列采用MEGA3.1 軟件進(jìn)行分析和拼接。

2.結(jié)果與分析

2.1 瓊脂糖電泳凝膠結(jié)果分析

根據(jù)《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)bar或pat基因定性PCR方法》（農(nóng)業(yè)部1782-6-2012號(hào)公告）公布的bar基因目的片段大小為262 bp，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)（見(jiàn)圖2）。與參照樣品的PCR產(chǎn)物片段大小相比，待測(cè)樣1的目標(biāo)條帶偏小，約為240 bp；待測(cè)樣2的目標(biāo)條帶偏大，約為500 bp。由于凝膠電泳檢測(cè)法分辨率較低，只能檢測(cè)出bp值區(qū)間段而不能準(zhǔn)確識(shí)別具體bp值，為了確定準(zhǔn)確bp值，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行目標(biāo)序列測(cè)序。

注：M為DL-2000Marker,1為待測(cè)樣品1，2為待測(cè)樣品2，CK+為陽(yáng)性參照，CK-為空白對(duì)照

2.2 目標(biāo)序列測(cè)序結(jié)果

利用MEGA 3.1軟件對(duì)上下游測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。下游序列反轉(zhuǎn)后，與上游序列比對(duì)，剔除序列兩端不可靠堿基位點(diǎn)，搜尋出上下游引物位置及中間重疊區(qū)域，將序列拼接完整。測(cè)序結(jié)果顯示目標(biāo)序列的個(gè)別位點(diǎn)存在套峰現(xiàn)象（見(jiàn)圖2），待測(cè)樣1在bar基因上游序列的第113個(gè)堿基存在G堿基中嵌套A堿基，下游序列反轉(zhuǎn)后確定該處堿基為G；待測(cè)樣2在多個(gè)位點(diǎn)存在套峰，不影響峰圖判定。

2.3 序列拼接結(jié)果

經(jīng)MEGA3.1 軟件分析，上游序列末端比對(duì)出下游引物序列bar-R: bar-R:5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3'（見(jiàn)圖3），下游序列反轉(zhuǎn)后，在起始端比對(duì)出上游引物序列bar-F:5’-GAAGGCACGCAACGCC-3’，上下游序列拼接結(jié)果發(fā)現(xiàn)待測(cè)樣1的bar基因序列為236 bp（見(jiàn)圖3 ），比檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中的提供的標(biāo)準(zhǔn)序列小26 bp；待測(cè)樣2的bar基因序列為486 bp（見(jiàn)圖4），比標(biāo)準(zhǔn)中的序列片段大224 bp。

圖3 bar基因PCR產(chǎn)物上下游序列（圖示部分序列）

圖4 水稻待測(cè)樣1 bar序列拼接結(jié)果（陰影示上下游引物位置）

2.4 序列比對(duì)分析

經(jīng)過(guò)序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，待測(cè)樣1和2的bar基因序列與標(biāo)準(zhǔn)提供的序列盡管上下游引物序列相同，但內(nèi)部序列與標(biāo)準(zhǔn)序列均不同（見(jiàn)圖5）。待測(cè)樣1的bar基因序列在第37、42～45、102、110～ 113、131～ 132、159～169、216、228～231等26個(gè)位點(diǎn)發(fā)生堿基缺失，內(nèi)部序列存在103個(gè)堿基不同，僅133個(gè)堿基相同，序列相似度僅為50.76%。

圖5 小麥待測(cè)樣2 bar序列拼接結(jié)果（陰影示上下游引物位置）

農(nóng)業(yè)部1782-6-2012號(hào)公告提供的262 bp的bar基因序列與美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)的序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該序列在已知的轉(zhuǎn)基因玉米Bt176品系、克隆載體pbar-35S和pSAT1A-ocsAocsP-bar-ocsT均存在100%的同源序列。待測(cè)樣1的bar序列有129個(gè)堿基與土壤中的鞘氨醇胞菌BN140058亞種存在73%相似度，但上下游引物均不匹配。待測(cè)樣2的bar序列有254個(gè)堿基與野生二粒小麥在LOC119283572存在71%非典型相似度，且上下游引物均不匹配（見(jiàn)圖7）。測(cè)序結(jié)果表明待測(cè)樣1和2可能分別來(lái)源于鞘氨醇胞菌和野生小麥，盡管PCR擴(kuò)增出特異性片段，片段大小與目的序列不一致，測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列差異較大，與現(xiàn)有已知序列相似度低，故不能判定2個(gè)待測(cè)樣的bar基因?yàn)檗D(zhuǎn)基因陽(yáng)性。

圖6 水稻待測(cè)樣1與bar基因標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)結(jié)果（★示堿基位點(diǎn)相同）

圖7 小麥待測(cè)樣2 bar 序列與NCBI網(wǎng)站序列比對(duì)結(jié)果

3.結(jié)論與討論

農(nóng)業(yè)部1782-6-2012號(hào)公告提供的序列為262 bp，國(guó)標(biāo)GB/T 19495.4-2018提供的bar基因片段大小為175 bp，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中存在多個(gè)同源序列。待測(cè)樣水稻中的 bar基因序列比已知序列小26 bp，可能來(lái)源于土壤中的鞘氨醇胞菌；待測(cè)樣小麥中的 bar基因序列比已知序列大223 bp，可能來(lái)源于野生小麥；待測(cè)樣水稻中的 bar基因序列與已知序列同源性僅50.76%，待測(cè)樣小麥中的 bar基因序列與標(biāo)準(zhǔn)序列幾乎無(wú)同源性，該兩個(gè)樣品的bar基因檢測(cè)結(jié)果應(yīng)判定為陰性。

標(biāo)準(zhǔn)選擇的175 bp和262 bp是bar基因的骨干序列，但bar基因的完整需要遠(yuǎn)大于262 bp。我國(guó)2008年啟動(dòng)轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)以來(lái)，已經(jīng)十多年，國(guó)內(nèi)研究轉(zhuǎn)基因水稻、小麥、油菜等作物的科研機(jī)構(gòu)較多。bar基因是常用的植物轉(zhuǎn)基因的選擇標(biāo)記，各研發(fā)單位采用的bar基因偏差段大小從100多bp到500 多bp都有，因此該基因序列極有可能是存在經(jīng)過(guò)基因改造的新的外源片段，在檢測(cè)工作中應(yīng)予以重視，必要時(shí)應(yīng)輔助其它外源基因或測(cè)序加以判定。在轉(zhuǎn)基因成分鑒定的標(biāo)準(zhǔn)修訂時(shí)，應(yīng)針對(duì)與目標(biāo)片段大小不一致的特異性電泳條帶，考慮采用測(cè)序、酶切等方法加以佐證，以防漏檢或誤檢。