張二敬，李玉靜，李紫然，趙 麗，劉靜靜，張 靜，趙寶華,，李春生,

（1.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024；2.河北交通職業(yè)技術(shù)學(xué)院紀(jì)檢監(jiān)察處，河北 石家莊 050035；3.河北省科學(xué)院生物研究所，河北 石家莊 050081）

隨著生活品質(zhì)的提升，多種乳制品已經(jīng)出現(xiàn)在日常飲食中，我國(guó)對(duì)于乳制品的農(nóng)藥殘留檢測(cè)也越來(lái)越重視。氟蟲腈是牛乳中的一種農(nóng)藥殘留，它是一種苯基吡唑類新型高活性殺蟲劑[1]，作用原理是阻礙昆蟲γ-氨基丁酸控制的氯化物代謝[2]。通過此作用原理氟蟲腈不但可以殺死鱗翅目、直翅目害蟲和土壤中鞘翅目害蟲的幼蟲，也可以用于殺滅對(duì)菊酯類氨基甲酸類和環(huán)戊二烯類產(chǎn)生抗性的害蟲[3]，而且效果極佳[4]。氟蟲腈通過飼料進(jìn)入牛體內(nèi)，牛產(chǎn)乳后進(jìn)而殘留于牛乳中。長(zhǎng)期攝入氟蟲腈對(duì)人體的肝臟帶來(lái)嚴(yán)重不良影響[5]。氟蟲腈經(jīng)過水解及光解作用產(chǎn)生代謝產(chǎn)物氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜和氟甲腈[6]。目前乳制品中氟蟲腈的檢測(cè)方法有氣相色譜法[7-10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11-12]、液相色譜法[13]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-16]。 這些方法由于樣品處理復(fù)雜、操作繁瑣，在檢測(cè)上有一定的弊端。免疫分析技術(shù)已成功應(yīng)用于多種農(nóng)藥及其代謝物的殘留分析[17-21]，它以抗原和抗體之間的特異性識(shí)別、可逆性結(jié)合為原理，因具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作相對(duì)簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、成本低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)而備受矚目，因此氟蟲腈人工抗原的合成及其單克隆抗體的制備對(duì)于免疫反應(yīng)顯得尤為重要。具有高特異性抗體的制備依賴于半抗原分子的合成[22]。本研究利用氟蟲腈分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行一系列反應(yīng)，將氟蟲腈連接到大分子蛋白上，從而合成人工完全抗原，然后利用合成的人工完全抗原制備單克隆抗體，合成的單克隆抗體用于牛乳中氟蟲腈的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳 蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，氟蟲腈 上海市農(nóng)藥研究所；牛血清蛋白（bovine serum albumen，BSA）、卵清蛋白（ovalbumin，OVA） 北京索萊寶科技有限公司；HAT培養(yǎng)基添加劑（50×）Hybri-MaxTM、HT培養(yǎng)基添加劑（50×）Hybri-MaxTM、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、碳化二亞胺（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC）、 免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）亞型檢測(cè)試劑盒 美國(guó)Sigma公司；胎牛血清 上海生物工程有限公司；辛酸、硫酸銨 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；BALB/c小鼠 河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；SP2/0細(xì)胞由本研究室保存。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；Multiskom GO酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Tek公司；MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱 日本三洋公司；ND-2000超微量分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo公司；恒溫干燥箱、HH-M4電熱恒溫水浴鍋 上海精宏設(shè)備有限公司；漩渦混合器 上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；倒置顯微鏡 日本Olympus公司；D-37520高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 人工完全抗原的合成

氟蟲腈-BSA（F-BSA）、氟蟲腈-OVA（F-OVA）人工完全抗原的制備：采用戊二醛法[23]，稱取氟蟲腈標(biāo)準(zhǔn)品20 mg溶解到3 mLN,N-二甲基甲酰胺（N,Ndimethylformamide，DMF）中，加入90 μL體積分?jǐn)?shù)10%的戊二醛溶液，室溫下攪拌10 min，稱為溶液A；分別稱取BSA、OVA各50 mg，用10 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溶解后加入10 mL硼酸鹽緩沖液（pH 8.6），稱為溶液B；冰浴條件下逐滴將溶液A滴加到溶液B中，攪拌過夜；次日透析即得F-BSA、F-OVA人工完全抗原。

氟蟲腈類似物（FH）-BSA（FH-BSA）、FH-OVA人工完全抗原的制備：稱取氟蟲腈標(biāo)準(zhǔn)品0.3 g，用10 mL丙酮溶解，然后用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值到12，室溫下攪拌2 h，用電磁爐水浴加熱4～5 h，室溫冷卻，取上清液用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至5、有淡黃色沉淀析出，5 000 r/min離心20 min，棄上清收集沉淀，用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl洗滌2 次，淡黃色沉淀即為FH[23]。以FH為半抗原，采用EDC法[23-25]合成人工完全抗原：稱取EDC 0.012 g，溶于500 μL DMF中，冰浴中加入0.05 g FH攪拌4～6 h，稱為C液；分別取1 mL 5 mg/mL BSA和1 mL 5 mg/mL OVA稱為D液，冰浴條件下將C液逐滴加入到D液中，攪拌過夜；次日透析即得FH-BSA、FH-OVA人工完全抗原。

1.3.2 人工完全抗原的鑒定

1.3.2.1 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis， SDS-PAGE）

依次將FH-OVA、F-OVA、OVA、蛋白Maker（10～180 kDa）、BSA、F-BSA、FH-BSA稀釋至 1 mg/mL上樣，Maker上樣量5 μL，其余樣品上樣量15 μL，使用12%分離膠、3%濃縮膠，30 V電壓電泳30 min后調(diào)至100 V電泳4 h。

1.3.2.2 紫外光譜掃描

使用紫外-可見分光光度計(jì)掃描，設(shè)置波長(zhǎng)為250～400 nm，鑒定F-BSA、F-OVA的合成情況。

1.3.3 單克隆抗體的制備

選取3 只6～8 周齡的正常雌性BALB/c小鼠，每只小鼠用F-BSA人工完全抗原免疫，免疫劑量40 μg，每隔2 周免疫1 次，共免疫3 次，7 d后加強(qiáng)免疫1 次。小鼠眼球取血，用間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)，選取最佳免疫小鼠，使用聚乙二醇法進(jìn)行融合，經(jīng)過3 次亞克隆稀釋，篩選得到最佳的雜交瘤細(xì)胞株，腹腔注射小鼠，取腹水采用辛酸-硫酸銨沉淀的方法純化IgG，-20 ℃保存。

1.3.4 單克隆抗體的檢測(cè)

1.3.4.1 單克隆抗體質(zhì)量濃度及效價(jià)測(cè)定

使用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)抗體質(zhì)量濃度，采用間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)。包被0.05 μg/mL F-OVA人工完全抗原，4 ℃過夜，依次加入制備的單克隆抗體，第1個(gè)孔稀釋200 倍，后面依次在前一個(gè)孔的基礎(chǔ)上稀釋2 倍，酶標(biāo)二抗1∶5 000稀釋，37 ℃反應(yīng)45 min，顯色終止后在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度（A450nm）。以下涉及間接ELISA方法步驟均與本節(jié)相同。

1.3.4.2 單克隆抗體亞型測(cè)定

使用免疫球蛋白亞型檢測(cè)試劑盒測(cè)定單克隆抗體的亞型。

1.3.4.3 單克隆抗體親和常數(shù)（Ka）測(cè)定

采用間接ELISA法測(cè)定抗體的Ka，以抗體質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以A450nm為縱坐標(biāo)，繪制S型曲線，計(jì)算單克隆抗體的Ka[26]。

1.3.4.4 單克隆抗體特異性測(cè)定

以氟蟲腈作為對(duì)照，以氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈砜為競(jìng)爭(zhēng)抗原，測(cè)定交叉反應(yīng)率，用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)得氟蟲腈和其他3 種代謝物的半抑制質(zhì)量濃度（semiinhibitory concentration，IC50），交叉反應(yīng)率按下式計(jì)算。

1.3.4.5 單克隆抗體抑制曲線繪制

采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，單克隆抗體按1∶64 000稀釋，添加不同質(zhì)量濃度（2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 μg/L）氟蟲腈標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定A450nm。沒有加入氟蟲腈標(biāo)準(zhǔn)溶液的孔A450nm記為B0，添加不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的孔A450nm記為B，以不同標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為x軸，B/B0為y軸，建立抑制曲線。

1.3.5 加標(biāo)回收率與精密度測(cè)定

準(zhǔn)確量取1 mL牛乳，加入4 mL乙腈，漩渦混合2 min，4 000×g離心5 min，取上清液，重復(fù)提取1 次，將2 次上清液合并，用乙腈定容至10 mL；取2 mL 35 ℃水浴氮吹至干，然后加入2 mL 0.01 mol/L PBS復(fù)溶。牛乳中氟蟲腈加標(biāo)量分別設(shè)置為1、2、5 μg/L，每個(gè)加標(biāo)量設(shè)6 個(gè)平行，采用ELISA法測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率與精密度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

繪圖及數(shù)據(jù)處理軟件為Origin和Microsoft Excel 2010。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE結(jié)果

由圖1可知，根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果，F(xiàn)-BSA在BSA上方出現(xiàn)條帶，表明抗原合成成功。FH-BSA的條帶明顯比BSA條帶寬，表明抗原合成成功。F-OVA有明顯的條帶滯后于OVA，表明抗原合成成功，而FH-OVA條帶與OVA條帶接近，無(wú)法判斷合成結(jié)果。

圖1 人工合成抗原SDS-PAGE結(jié)果Fig. 1 SDS-PAGE patterns of synthetic antigens

選擇F-BSA和F-OVA，采用紫外光譜掃描進(jìn)一步鑒定二者的合成情況。

2.2 紫外光譜掃描結(jié)果

由圖2可知，氟蟲腈、BSA的最大吸收峰分別位于306.7、283.6 nm波長(zhǎng)處，而BSA與氟蟲腈偶聯(lián)形成的F-BSA的最大吸收峰位于289.1 nm波長(zhǎng)處，最大吸收峰發(fā)生偏移且介于二者之間，由此可知，合成抗原F-BSA偶聯(lián)成功。氟蟲腈、OVA的最大吸收峰分別位于306.7、285.2 nm波長(zhǎng)處，而OVA與氟蟲腈偶聯(lián)形成的F-OVA的最大吸收峰位于287.6 nm波長(zhǎng)處，由此可知，合成抗原F-OVA偶聯(lián)成功。

圖2 F-BSA和F-OVA紫外光譜掃描結(jié)果Fig. 2 UV absorption spectra of F-BSA and F-OVA

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，后期選用F-BSA免疫小鼠，制備單克隆抗體。

2.3 小鼠血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果

小鼠血清效價(jià)3 次平行測(cè)定結(jié)果分別為4.1×105、2.0×105、4.1×105。

2.4 單克隆抗體質(zhì)量濃度及效價(jià)測(cè)定結(jié)果

融合后篩選出分泌單克隆抗體的3F6雜交瘤細(xì)胞株，誘生的腹水經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法純化后即為單克隆抗體3F6，用超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)得單克隆抗體3F6質(zhì)量濃度為8.5 mg/mL，間接ELISA測(cè)得效價(jià)為2.0×106。

2.5 單克隆抗體3F6亞型測(cè)定結(jié)果

由圖3可知，雜交瘤細(xì)胞3F6分泌的單克隆抗體3F6與不同亞類的二抗顯色結(jié)果不同，與IgG1二抗的顯色度最高，與IgM的二抗有微弱的顯色，而與IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA的二抗幾乎不顯色，所以單克隆抗體3F6亞型為IgG1。

圖3 單克隆抗體3F6亞型Fig. 3 Subtype composition of monoclonal antibody 3F6

2.6 單克隆抗體3F6 Ka測(cè)定結(jié)果

由圖4可知，采用間接ELISA法測(cè)定單克隆抗體3F6的Ka，繪制S型曲線，根據(jù)Ka公式計(jì)算得Ka=4.6×1010L/mol。

圖4 單克隆抗體3F6的KaFig. 4 Ka of monoclonal antibody 3F6

2.7 單克隆抗體3F6特異性測(cè)定結(jié)果

以交叉反應(yīng)率來(lái)表征抗體的特異性。由圖5可知，以氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈砜為競(jìng)爭(zhēng)抗原，氟蟲腈作為對(duì)照，采用ELISA方法測(cè)定，其交叉反應(yīng)率分別為9.21%、21.46%、14.02%，說明制備的單克隆抗體3F6特異性良好。

圖5 交叉反應(yīng)率測(cè)定結(jié)果Fig. 5 Cross-reaction rates

2.8 單克隆抗體3F6抑制率測(cè)定結(jié)果

由圖6可知，在0.125～2.000 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（R2=0.994 1），單克隆抗體3F6的IC50為0.32 μg/L，對(duì)氟蟲腈具有較高的敏感性。

圖6 單克隆抗體3F6對(duì)氟蟲腈的抑制率Fig. 6 Inhibition rate of monoclonal antibody 3F6 on fipronil

2.9 加標(biāo)回收率與精密度

由表1可知，批內(nèi)與批間加標(biāo)回收率為87.00%～118.00%，變異系數(shù)在15%以內(nèi)，表明方法具有較高準(zhǔn)確度和精密度。

表1 樣品加標(biāo)回收率和變異系數(shù)（n=6）Table 1 Recoveries and coefficients of variation for spiked samples (n = 6)

3 結(jié) 論

根據(jù)氟蟲腈的分子結(jié)構(gòu)，用戊二醛法和EDC法合成氟蟲腈人工完全抗原，對(duì)抗原進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果表明，F(xiàn)-BSA、FH-BSA抗原合成成功，F(xiàn)-OVA有明顯的條帶在OVA條帶上方，表明抗原合成成功，而FH-OVA條帶與OVA條帶接近，無(wú)法判斷合成結(jié)果。對(duì)氟蟲腈人工完全抗原F-BSA、F-OVA進(jìn)行紫外光譜鑒定，結(jié)果顯示，BSA與氟蟲腈偶聯(lián)形成的F-BSA的最大吸收峰位于289.1 nm波長(zhǎng)處，OVA與氟蟲腈偶聯(lián)形成的F-OVA的最大吸收峰位于287.6 nm波長(zhǎng)處，抗原F-BSA、F-OVA偶聯(lián)成功。

運(yùn)用小鼠腹內(nèi)誘生腹水的方法得到氟蟲腈單克隆抗體3F6，其質(zhì)量濃度為8.5 mg/mL，間接ELISA法測(cè)得效價(jià)為2.0×106，亞型檢測(cè)試劑盒測(cè)得單克隆抗體3F6亞型為IgG1，間接ELISA法測(cè)得單克隆抗體3F6的Ka為4.6×1010L/mol，與氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈砜的交叉反應(yīng)率分別為9.21%、21.46%、14.02%。建立氟蟲腈的抑制曲線，結(jié)果顯示，在0.125～2.000 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（R2=0.994 1），IC50為0.32 μg/L，單克隆抗體3F6對(duì)氟蟲腈具有較高的敏感性。

牛乳中氟蟲腈加標(biāo)量分別為1、2、5 μg/L時(shí)，每個(gè)加標(biāo)量設(shè)6 個(gè)平行，批內(nèi)與批間回收率為87.00%～118.00%，變異系數(shù)在15%以內(nèi)，本研究方法具有較高準(zhǔn)確度和精密度。