趙烜影，劉振民，雍靖怡，王國驕，李 楠

（乳業(yè)生物技術國家重點實驗室，上海乳業(yè)生物工程技術研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海 200436）

牛乳行業(yè)是全球最多樣化和發(fā)展最密集的乳制品行業(yè)，導致針對不同年齡人群的目標乳制品配方多樣化，以滿足特定的營養(yǎng)需求[1]。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織的數(shù)據(jù)，2020年全球乳產(chǎn)量達到8.6 億t，其中牛乳占總產(chǎn)量的85.37%，其次是水牛乳（11.06%）、山羊乳（2.07%）、綿羊乳（1.36%）和駱駝乳（0.20%）[2]。牛乳被認為是重要的能量來源，并且含有必需的營養(yǎng)素，是蛋白質(zhì)、碳水化合物（乳糖）、脂質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素、低聚糖、內(nèi)在免疫因子、免疫球蛋白、激素、酶和轉化生長因子β等的來源[1,3]。作為人類飲食中重要的蛋白質(zhì)來源，牛乳提供約32 g/L的蛋白質(zhì)[4]，在人體內(nèi)不同的功能機制中發(fā)揮著重要作用，如調(diào)節(jié)心血管疾病、免疫調(diào)節(jié)、代謝和神經(jīng)元生長以及腸道微生物組的建立和穩(wěn)定[5-7]。 由于蛋白質(zhì)含量高，牛乳被視為潛在生物活性肽的良好來源[3]。目前已知的乳源生物活性肽是由牛乳中的2 種主要蛋白質(zhì)酪蛋白（主要包括α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白）和乳清蛋白（主要包括α-乳白蛋白和β-乳球蛋白）分解而來[8]。盡管其他動物蛋白和植物蛋白都含有潛在的生物活性序列，但乳蛋白仍是目前一系列生物活性肽的主要來源[9]。在過去的70 年里，已經(jīng)對乳蛋白氨基酸序列中存在的生物活性肽進行了許多研究[10]。早在1950年，Mellander[11]發(fā)現(xiàn)來源于酪蛋白的磷酸化肽的攝入可改善兒童的VD非依賴性鈣化。

生物活性肽被定義為對身體功能或狀況有積極影響并最終影響健康的特定蛋白質(zhì)片段[12]，最初它們在體內(nèi)保持無活性乳蛋白的結構，可通過蛋白水解釋放[13]，釋放的生物活性肽通常很小，包含2～50 個氨基酸殘基[14]。食物來源的生物活性肽具有有益健康的成分，除了正常的基本營養(yǎng)作用外，還可以在人體中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能[15]。生物活性肽被認為是藥物的更好替代品，它們主要來源于天然食品并且沒有嚴重的副作用，因此成為治療長期慢性疾病的最佳方法之一[16]。乳蛋白衍生的生物活性肽的產(chǎn)生和性質(zhì)已在許多文章中進行了綜述，許多在牛乳中發(fā)現(xiàn)的肽已被證明會影響心血管、神經(jīng)、消化、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)[3,16]，同時顯示出抗微生物、抗血栓形成、抗高血壓、抗動脈粥樣硬化、抗氧化等功能特性和免疫調(diào)節(jié)活性[17-19]。

目前國際市場上已經(jīng)出現(xiàn)了含有乳源生物活性肽的產(chǎn)品。本文綜述近年來乳源生物活性肽的來源、生產(chǎn)方式及生物活性的相關研究進展，概述乳源生物活性肽的應用潛力。

1 乳源生物活性肽來源

乳源生物活性肽衍生自乳蛋白。在牛乳、綿羊乳、山羊乳和水牛乳中約80%的乳蛋白是酪蛋白。酪蛋白作為一種磷酸化蛋白質(zhì)，以蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)磷酸鈣的復雜膠束形式存在于乳中，αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白是主要的酪蛋白組分[20]。β-酪蛋白經(jīng)纖溶酶酶解產(chǎn)生的γ-酪蛋白也可以形成生物活性肽[21]。在乳中，乳清蛋白含量約占20%，由β-乳球蛋白（50%）、α-乳白蛋白（20%）、血清白蛋白（10%）及乳鐵蛋白4 種主要蛋白質(zhì)和其他蛋白質(zhì)（免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）， 10%，主要為IgG1，IgG2、IgA和IgM含量較少）組成[22]。 乳中常見的多肽如表1所示。

表1 常見乳源生物活性肽[10]Table 1 Common milk-derived bioactive peptides[10]

2 乳源生物活性肽產(chǎn)生方式

乳中的生物活性肽可通過酶促水解或發(fā)酵過程獲 得[23-26]。除了通過常規(guī)蛋白酶酶解從天然蛋白來源生產(chǎn)生物活性肽以外，重組DNA技術已成功用于大腸桿菌中生產(chǎn)特定的肽或其前體[19,27-28]。

2.1 酶解

產(chǎn)生生物活性肽的最常見方式是通過酶水解蛋白質(zhì)。大量研究表明，消化酶水解乳蛋白可以產(chǎn)生具有生物活性的肽[29]。乳蛋白在體內(nèi)胃腸消化過程中通過消化酶可以分解出一系列生物活性肽，如乳清蛋白經(jīng)腸道內(nèi)的胰蛋白酶消化可產(chǎn)生具有ACE抑制活性的乳激肽Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg（ALPMHIR）[29]。ACE抑制肽是現(xiàn)階段關注度較高的生物活性肽，一些研究發(fā)現(xiàn)，酪蛋白酶解產(chǎn)物比乳清蛋白酶解產(chǎn)物具有更高的ACE抑制活性[19]。體外消化通常使用不同pH值的緩沖液，以獲得最佳的水解酶活性[30]。目前最常用到的蛋白酶有胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶，通過單獨或組合使用水解酪蛋白或乳清蛋白等乳蛋白，從而產(chǎn)生生物活性肽[31-33]。有時為了模擬胃腸道消化，還會采用堿性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶等蛋白酶與胃蛋白酶和胰蛋白酶一起進行連續(xù)處理來釋放各種生物活性肽，包括環(huán)瓜氨酸肽、ACE抑制肽、抗菌肽、抗氧化肽、免疫調(diào)節(jié)肽和阿片樣物質(zhì)[19]。Mizuno等[34]測定用9 種不同的市售蛋白酶處理酪蛋白后水解物的ACE抑制活性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)源自米曲霉的蛋白酶處理后酪蛋白水解物的ACE抑制活性最高。

2.2 發(fā)酵

除了酶解消化外，另一種生產(chǎn)生物活性肽的方式是利用微生物的蛋白水解系統(tǒng)進行發(fā)酵[35]。部分微生物可以將乳蛋白水解成肽和氨基酸，作為其生長所需的氮源，水解釋放的肽可以通過超濾或分子篩分離純化，生物活性肽的氨基酸序列可以通過色譜方法鑒定[27,36-37]。許多乳制品發(fā)酵劑都可以高度水解乳蛋白，因此在發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)過程中可以預期形成生物活性肽[27]。通過微生物水解牛乳蛋白，釋放出不同的生物活性肽，已有許多文獻報道[38]。瑞士乳桿菌菌株能夠釋放抗高血壓肽，其中最著名的是ACE抑制性三肽Leu-Pro-Pro（LPP）、Val-Pro-Pro（VPP）和Ile-Pro-Pro（IPP），這些肽的抗高血壓能力已在一些大鼠模型和人體研究中得到證實[19,39]。用糞腸球菌發(fā)酵牛乳可產(chǎn)生抗高血壓的酪蛋白衍生肽LHLPLP和HLPLP[40]。酸乳中的細菌、干酪發(fā)酵劑和市售益生菌也被證明在發(fā)酵過程中會在牛乳中產(chǎn)生不同的生物活性肽[19,39]。

2.3 重組DNA技術

目前采用重組DNA大規(guī)模生產(chǎn)生物活性肽的技術還處在探索階段，研究重點在于長鏈肽的合成[41-42]。DNA重組技術在制備長鏈肽方面具有高產(chǎn)的優(yōu)勢，抑制對宿主有害產(chǎn)物的表達是該技術目前最大的挑戰(zhàn)[43-44]。此外，抗菌肽對表達載體具有很強的抗菌活性，并且對蛋白酶的活性比較敏感[45]。通過融合蛋白或串聯(lián)基因的形式表達這些生物活性肽可能會克服部分限制，這可能抵消其固有的毒性并提高其表達水平[27]。

3 乳源生物活性肽的生物活性

3.1 對消化系統(tǒng)的影響

牛乳在體內(nèi)胃腸道消化過程中會產(chǎn)生酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPP）[46]。Meisel等[47]在回腸造口術廢液中發(fā)現(xiàn)了CPP，證明這些肽產(chǎn)生于胃腸道消化過程，且能夠到達回腸遠端。CPP因能夠促進人體對鈣、鐵、鋅等礦物營養(yǎng)素的吸收和利用而受到學者們的關注[46]。 現(xiàn)階段對于CPP的研究主要集中在早期齲齒預防[48]， 研究發(fā)現(xiàn)，CPP有助于牙釉質(zhì)齲損體的再礦化作用[49]。此外，有學者發(fā)現(xiàn)CPP可以增加大鼠骨密度，促進神經(jīng)肽Y的表達，利于大鼠骨骼的發(fā)育[50]。

酪蛋白巨肽（caseinmacropeptide，CMP）是κ-酪蛋白經(jīng)凝乳酶降解產(chǎn)生的一類多肽，具有生物活性功能和獨特的營養(yǎng)特性[51]。CMP化學結構中磷酸基團的 不同修飾作用產(chǎn)生的不同序列片段可支持不同的生物學功能[52]。CMP已被證明可以直接作為神經(jīng)遞質(zhì)，或刺激相關激素的釋放，調(diào)節(jié)胃腸道分泌，它可以抑制胃酸的分泌，通過釋放膽囊收縮素刺激胰腺分泌[53]。CMP還能通過刺激產(chǎn)生短期食欲的胃腸激素（如膽囊收縮素、胰高血糖素樣肽-1、肽YY）及長期作用的激素（如瘦素和胰島素）兩類外周食欲調(diào)控信號的釋放，進而發(fā)揮對機體食欲的調(diào)節(jié)作用[52]。

糖巨肽（glycomacropeptide，GMP）是一種含有唾液酸的活性糖基磷酸肽，由κ-酪蛋白被凝乳酶特異性水解其中的苯丙氨酸-蛋氨酸間的酰胺鍵得到，GMP肽鏈上糖基和磷酸基團的不同造就了其多樣化的生物功能活性[51]。GMP可以通過下調(diào)脂多糖誘導的Toll樣受體4炎癥途徑以及阻止腫瘤壞死因子-α誘導的共培養(yǎng)單層滲透性增強腸道的抗炎和屏障功能[54]。酪蛋白GMP中支鏈氨基酸含量較高，且?guī)缀醪缓奖彼?、色氨酸等芳香族氨基酸，被視為苯丙酮酸尿癥患者的理想膳食[55]。此外，GMP被證明可以促進乳酸桿菌和雙歧桿菌的生長，并增強腸道內(nèi)微生物多樣性，GMP的肽骨架對益生元活性也至關重要[56-57]。

3.2 對免疫系統(tǒng)的影響

3.2.1 抗菌作用

抗菌肽又稱宿主防御肽，是生物界中廣泛存在的一類生物活性肽，它是機體先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，一般由20～60 個氨基酸殘基組成，結構多樣，具有抗細菌、真菌、病毒等多種生物學功能[46]。乳源生物活性抗菌肽因具有識別受感染的靶細胞、廣譜殺菌及天然安全性等優(yōu)勢受到關注，這些活性肽能夠破壞細菌的膜通透性[58]，抑制許多革蘭氏陽性和革蘭氏陰性病原體，如大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌和葡萄球菌[59]。從乳鐵蛋白中分離出的乳鐵素可以抑制葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌[60]。

3.2.2 抗氧化作用

乳蛋白經(jīng)消化后可以產(chǎn)生具有抗氧化活性的多肽，這些肽由5～11 個氨基酸組成，包含疏水性氨基酸、脯氨酸、組氨酸、酪氨酸或色氨酸[61]。乳源抗氧化肽能通過多種途徑抑制脂質(zhì)氧化，包括使活性氧失活、清除自由基、螯合金屬離子、減少氫過氧化物和改變食品體系的物理性質(zhì)等，調(diào)整及改善機體生理功能，從而促進人體健康[62]。Suetsuna等[63]發(fā)現(xiàn)，酪蛋白水解得到的Tyr-Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu（YFYPEL）乳源活性肽對超氧陰離子、羥自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基具有清除活性，這表明酪蛋白衍生的Glu-Leu序列對于上述自由基清除很重要。乳清蛋白的水解產(chǎn)物已被證明具有抗氧化活性，用堿性蛋白酶消化5 h能夠產(chǎn)生具有強還原能力的水解產(chǎn)物[64]。Barac等[65]發(fā)現(xiàn)，干酪成熟過程中會產(chǎn)生具有抗氧化作用的α-酪蛋白衍生肽和β-酪蛋白衍生肽。

3.2.3 免疫調(diào)節(jié)作用

免疫系統(tǒng)在保護個體免受細菌、病毒、寄生蟲或真菌感染和癌癥的侵害中起著核心作用[46]。生物活性肽對個體的免疫系統(tǒng)也具有積極的刺激作用[66]。酪蛋白產(chǎn)生的細胞調(diào)節(jié)肽可通過刺激負責免疫系統(tǒng)的細胞抑制喉癌細胞的生長，可用于肺癌的治療[67-69]。免疫調(diào)節(jié)肽PGPIPN是源于牛乳β-酪蛋白63～68位氨基酸殘基的六肽，通過泛素-蛋白酶體途徑降低卵巢癌細胞對抗癌藥順鉑的耐藥性[70]。由乳清水解得到的免疫調(diào)節(jié)肽HWP可顯著降低肝移植后菌血癥的發(fā)病率[71]。

3.3 對心血管系統(tǒng)的影響

3.3.1 抗血栓作用

具有抗血栓形成功能的生物活性肽具有減少或預防血凝塊形成的能力。纖維蛋白原在血液凝結中起重要作用，CMP可以抑制纖維蛋白原與血小板表面的糖蛋白受體結合，進而防止血小板聚集[72]。Tu Maolin等[73]通過胰蛋白酶水解酪蛋白得到對凝血酶抑制率為76.25%的多肽，其中序列為HQGLPQEVLNENENLLR、FFVAPFPEVFGK、DEVPSER、YLGYLEQLLR的4 種肽來自于αs1-酪蛋白，序列為NMAINPSK、NAVPITPTLIVR、FALPQYLY的3 種肽來自于αs2-酪蛋白，序列為VLPVPQK、AVPYPQR、GPFPIIV的3 種肽來自于β-酪蛋白。

3.3.2 降壓作用

高血壓可引起中風、心力衰竭、缺血性心臟病和腎臟疾病，腎素血管緊張素被認為是重要的血壓調(diào)節(jié)劑，因此抑制腎素作用于血管緊張素原的ACE被廣泛用于治療高血壓[8]。目前已從牛乳、羊乳、駱駝乳和馬乳中鑒定出多種ACE抑制肽[26,74]。緩激肽分解后產(chǎn)物會與血管緊張素II產(chǎn)生協(xié)同作用，ACE抑制肽還可以防止緩激肽的分解，從而通過增加動脈血管舒張作用來降低血壓[75]。當用瑞士乳桿菌或釀酒酵母發(fā)酵牛乳時，β-酪蛋白會釋放出IPP、VPP和LPP 3 種三肽[39]。在臨床實驗中，急性攝入高劑量的三肽后，血壓正常志愿者的血漿緩激肽濃度增加，并且含三肽的乳制品可以降低輕度高血壓人群的血壓[39,76]。

3.4 對神經(jīng)系統(tǒng)的影響

參與活躍神經(jīng)系統(tǒng)、具有阿片樣活性的肽被稱為阿片肽，阿片肽同鴉片（嗎啡）有相似的藥理[77]。阿片肽是具有激動劑活性和拮抗活性的阿片樣物質(zhì)受體配體，牛乳中的阿片肽屬于外源性阿片肽[78]。α-酪蛋白和β-酪蛋白被認為是外源性阿片肽的良好來源，來源于β-酪蛋白的β-酪啡肽7是第1個被鑒定出的阿片肽（Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile）[79]。來源于β-酪蛋白的β-酪啡肽對大腦功能、鎮(zhèn)靜和嬰兒睡眠以及焦慮等行為的調(diào)節(jié)存在潛在影響[80]。還有研究顯示，β-乳球蛋白、免疫球蛋白、α-乳白蛋白、乳過氧化物酶、乳鐵蛋白等組成的乳清蛋白具有阿片樣活性[81]。

3.5 對骨骼健康的影響

乳源生物活性肽可以在體外誘導成骨細胞分化、成熟和基質(zhì)礦化，因此可能對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥具有有益作用[82]。用三肽IPP長期治療可提高人類前成骨細胞存活率，進而改善基質(zhì)礦化[83]。此外，水牛乳酪蛋白經(jīng)胃蛋白酶-胰蛋白酶水解可獲得具有抗氧化和成骨細胞增殖活性的生物活性肽，其中NAVPITPTL通過激活磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶信號通路顯著增加成骨細胞分化，VLPVPQK通過抑制去卵巢大鼠的氧化損傷和骨吸收細胞因子的產(chǎn)生，從而表現(xiàn)出抗骨質(zhì)疏松作用[84-85]。

4 結 語

生物活性肽作為促進健康的功能性食品受到研究人員的關注，但是該領域的發(fā)展受到缺乏創(chuàng)新技術、分離純化和臨床研究的限制。在后續(xù)的發(fā)展過程中應該以蛋白質(zhì)組學、重組DNA技術及微生物發(fā)酵等新技術為依據(jù)，將各種生物活性肽表現(xiàn)出的促健康作用標準化。并且要鼓勵研究機構加大對臨床實驗的投入，以測試其對人體的有效性。

乳源生物活性肽因其潛在的健康益處而成為商業(yè)功能性食品的熱點。迄今為止，對食源性生物活性肽降壓、礦物質(zhì)結合、抗齲肽的生理作用進行了較為深入的研究，但食源性生物活性肽在預防和治療慢性疾病中的作用尚缺乏深入研究。肥胖癥及相關慢性疾病的治療應關注對天然生物活性肽的研究，預計會有更多基于乳源生物活性肽的產(chǎn)品被用于干預各種代謝綜合征，例如影響高血壓、血脂水平、葡萄糖平衡和體重指數(shù)。乳源生物活性肽的新研究領域是與記憶有關的疾病和情緒控制，在這種趨勢下許多具有抗氧化和阿片樣物質(zhì)性質(zhì)的乳源生物活性肽值得進一步研究。