薛才華，武 強，王夢杰，劉嘉華，張龍飛，張家瑋，吳 華

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016）

炎癥是指機體受到外界刺激后，通過系統(tǒng)本身的活體組織對外界致炎因子產(chǎn)生的一種防御作用。巨噬細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的重要組成成分，參與機體的特異性免疫與非特異性免疫，在炎癥反應(yīng)及疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[1]。TLR4/NF-κB 信號通路是細(xì)胞識別病原激活免疫反應(yīng)的一條經(jīng)典信號通路，也是多種藥物治療炎癥、免疫相關(guān)疾病的作用靶位[2-3]。細(xì)胞自噬是真核生物進(jìn)行自我保護(hù)的一種機制，主要是通過溶酶體對細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器進(jìn)行融合降解從而達(dá)到細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[4]。其中mTOR 信號通路是最常見的自噬調(diào)節(jié)通路之一，mTOR 介導(dǎo)的信號通路是調(diào)控細(xì)胞能量和營養(yǎng)代謝的重要樞紐。

黑枸杞花青素是從黑枸杞中分離提取出來的一種紫紅色素，屬于類黃酮類物質(zhì)。黑枸杞花青素在細(xì)胞免疫上，具有增強淋巴細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能[5]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的信號通路之間并非各自獨立、單一地執(zhí)行某種功能，而是存在著許多“對話”，并相互交匯形成復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)[6-7]，對細(xì)胞的各項生命活動進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控。細(xì)胞自噬參與眾多固有免疫信號的調(diào)控，本文基于自噬調(diào)控通路mTOR 通路來研究黑枸杞花青素對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 TLR4/NF-κB 通路的影響，為黑枸杞資源的深度開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7 購買于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；黑枸杞花青素購于青海金麥杞生物科技有限公司（花青素61%、灰分0.6%、蛋白質(zhì)6%、糖1.32%、氨基酸3.56%）[8]；DMEM 干粉和胎牛血清購自于Gibco 公司；PBS 購自Hfart 公司；胰蛋白酶溶液和BCA 蛋白定量試劑盒購自Solarbio 公司；雷帕霉素（RAPA）購自MedChemExpress 公司；TRNzol Universal 總RNA 提取試劑盒、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SuperReal 彩色熒光定量預(yù)混試劑盒均購自天根生化科技有限公司；山羊抗IgG 購自Abcam 公司；NF-κBp65抗體和p-NF-κBp65 抗體購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；p-mTOR 購自SAB 公司；Ant-GAPDH 購自Immunoway 公司。

1.2 試驗儀器 超凈工作臺（江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國NUAIRE 公司）；高速低溫離心機（英國Dynamica 公司）；PCR 儀及熒光定量系統(tǒng)（BIO-RAD）；Western blot 轉(zhuǎn)膜儀，Western blot 電泳儀及Western blot 電源（北京六一生物科技公司）；搖床（美國SCILOGEX 公司）；化學(xué)發(fā)光成像儀（北京賽智科技有限公司）。

1.3 試劑配制 花青素溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.01 g 花青素溶于10 mL DMEM 培養(yǎng)基中，配成1 mg/mL 的花青素母液，-20℃保存，使用前稀釋成相應(yīng)濃度。

LPS 溶液的配制：將1 mg LPS 粉末溶解于10 mL的PBS 溶液中，配制成100 μg/mL 的LPS 母液，分裝后保存于-80℃冰箱，使用前稀釋成相應(yīng)濃度。

雷帕霉素抑制劑的配制：精確稱取0.0914 g 雷帕霉素粉末加入1 mL 的PBS 溶液，配制成濃度為100 mmol/L的母液稀釋使用，置于-20℃冰箱保存，試驗中雷帕霉素的最終濃度為100 nmol/L。

BAY11-7082 抑制劑的配制：精稱量0.0207 g BAY11-7082 溶入到1 mL PBS 中配制成100 mmol/L 的BAY11-7082溶液，取1μL 的BAY11-7082溶液加入到999 μL PBS 中，配制成100 μmol/L 的BAY11-7082 母液，然后將所有濃度的BAY11-7082 溶液置于-20℃冰箱保存。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用含10%胎牛血清和1% 雙抗的DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，每24 h換1 次液，待細(xì)胞生長70%～80%融合時將其傳代，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于試驗細(xì)胞分為對照組、花青素組（25 μg/mL）、脂多糖組（1 μg/mL）、花青素（25 μg/mL）+脂多糖（1 μg/mL）組、脂多糖（1 μg/mL）+雷帕霉素（100 nmol/L）組、花青素（25 μg/mL）+脂多糖（1 μg/mL）+雷帕霉素（100 nmol/L）組、脂多糖（25 μg/mL）+BAY11-7082（20 μmol/L）組、花青素（25 μg/mL）+脂多糖（1 μg/mL）+BAY11-7082（20 μmol/L）組。

1.5 實時熒光定量PCR 按上述分組進(jìn)行試驗，以細(xì)胞濃度為1×106接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板后常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到70%～80% 融合時分組處理，每組3 個重復(fù)。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟，將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。之后使用熒光定量試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)，使用上海生物公司設(shè)計合成的引物，如表1 所示。采用2-ΔΔCt法計算各目的基因的相對表達(dá)量。

表1 相關(guān)因子引物序列

1.6 Western Blot 檢測相關(guān)因子蛋白表達(dá) 按上述分組進(jìn)行試驗，處理完各組細(xì)胞后，分別收集各組細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取總蛋白，利用BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白含量。用30 μL 5×上樣緩沖液與120 μL 蛋白樣本混合于200 μL 離心管中，于PCR 儀上變性后泳道上樣，經(jīng) SDS-PAGE 電泳后，半干轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，按比例配制 NF-κBp65 抗體、p-NF-κBp65 抗體、p-mTOR抗體及 GADPH 抗體，4℃封閉過夜，TBST 洗膜，室溫5×6 min 搖洗，加入山羊抗IgG 二抗，室溫1 h 后TBST 洗膜，室溫5×6 min 搖洗。將保鮮膜置于暗盒中，可以在其底部加水以固定薄膜，將PVDF 膜正面（蛋白附著面）朝上，放置于薄膜里。將發(fā)光液試劑盒中兩種液體按1:1 比例混合，搖勻。滴加到PVDF 膜上，反應(yīng)5 min。用鑷子夾起PVDF 膜一角，使發(fā)光液自然流下，曝光顯影觀察。

1.7 統(tǒng)計分析 采用Image J 對條帶量化，所有試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 軟件初步處理后，所有數(shù)據(jù)采用 SPSS25.0 One-Way ANOVA Duncan's 法進(jìn)行分析，計量資料采用平均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，P＞0.05 為差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 阻斷mTOR 通路后黑枸杞花青素對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 TLR4/NF-κB 通路的影響。

2.1.1 阻斷mTOR 通路后黑枸杞花青素對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 TLR4/NF-κB 通路相關(guān)因子mRNA 表達(dá)的影響 如圖1 所示，對照組相比，脂多糖組的TLR4、NFκB、TRAF6和MyD88的mRNA 表達(dá)均提高（P＜0.01）；當(dāng)mTOR 被抑制后，與脂多糖+雷帕霉素組對比，花青素+脂多糖+雷帕霉素組的TRAF6mRNA 表達(dá)水平減低（P＜0.05）。

圖1 阻斷mTOR 通路后黑枸杞花青素對TLR4、NF-κB、TRAF6、MyD88 mRNA 表達(dá)水平的影響

2.1.2 阻斷mTOR 通路后黑枸杞花青素對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 TLR4/NF-κB 通路關(guān)鍵因子蛋白表達(dá)的影響由圖2 可知，與對照組相比，脂多糖組的NF-κBp65 和p-NF-κBp65 的蛋白表達(dá)水平提高（P＜0.01）；當(dāng)mTOR被抑制后，與脂多糖+雷帕霉素組對比，花青素+脂多糖+雷帕霉素組的NF-κBp65 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.01）。

圖2 阻斷mTOR 通路后黑枸杞花青素對NF-κBp65 和p-NF-κBp65 蛋白表達(dá)的影響

2.2 抑制NF-κB 后黑枸杞花青素對mTOR 通路的影響

2.2.1 抑制NF-κB 后黑枸杞花青素對自噬相關(guān)因子mRNA 表達(dá)的影響 由圖3 可知，與對照組相比，脂多糖組Beclin1、LC3和ULK1的mRNA 表達(dá)提高（P＜0.01），mTORmRNA 表達(dá)降低（P＜0.05）；當(dāng)NF-κB 被抑制后，與脂多糖+BAY11-7082 組對比，花青素+脂多糖+BAY11-7082 組mTOR和ULK1的mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）。

圖3 抑制NF-κB 后黑枸杞花青素對自噬相關(guān)基因 mRNA 表達(dá)的影響

2.2.2 抑制NF-κB 后黑枸杞花青素對mTOR 通路關(guān)鍵因子蛋白表達(dá)的影響 由圖4 可知，與對照組相比，脂多糖組p-mTOR 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；當(dāng)NF-κB 被抑制后，與脂多糖+BAY11-7082 組對比，花青素+脂多糖+BAY11-7082 組的p-mTOR 的蛋白表達(dá)水平降低（P＞0.05）。

圖4 抑制NF-κB 后黑枸杞花青素對p-mTOR 蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

巨噬細(xì)胞是參與機體免疫應(yīng)答反應(yīng)的重要成分，在多種疾病中有效發(fā)揮其吞噬作用，是機體抵御細(xì)菌感染和癌癥的第一道防線。因此，巨噬細(xì)胞在啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答中扮演著重要的角色并參與自身免疫性疾病、感染和炎癥性疾病的發(fā)病機制[9]。LPS 為革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，能夠刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生過量的炎癥介質(zhì)（如NO 和TNF-α）以及炎性細(xì)胞因子（如IL-1β和IL-6），這些物質(zhì)通過與其他炎癥介質(zhì)的協(xié)同作用促進(jìn)過敏性哮喘等炎癥性疾病的發(fā)生與發(fā)展[10-12]。TLR4/NF-κB 通路是炎癥信號傳導(dǎo)途徑中的重要通路之一，TLR4 被激活后可經(jīng)MyD88 依賴性途徑和TRIF 依賴性途徑傳導(dǎo)信號激活NF-κB，從而誘導(dǎo)細(xì)胞因子等免疫相關(guān)分子的表達(dá)。NF-κB 是一種核轉(zhuǎn)錄因子，通常以p65和p50 2 個亞基形成異二聚體的形式普遍存在于真核細(xì)胞中，其中p65 亞基磷酸化是NF-κB 活化并啟動下游基因表達(dá)的必要條件[13]。NF-κB 可調(diào)控多種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和自噬等生命活動中發(fā)揮著重要作用。TLR4 是細(xì)胞自噬的一個感受器，自噬是TLR4 受體激活后產(chǎn)生的一個效應(yīng)機制。自噬是巨噬細(xì)胞吞噬和清除體內(nèi)病原微生物的重要調(diào)控機制，有研究[14]表明，巨噬細(xì)胞的自噬功能下降可以降低其對體內(nèi)凋亡細(xì)胞吞噬的效率。mTOR 是由高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成，它的主要作用是調(diào)控細(xì)胞的生長和新陳代謝[15-16]。當(dāng)細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏、新陳代謝紊亂、炎癥反應(yīng)及外界壓力的刺激下，細(xì)胞會產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)，mTOR 的活性會降低，同時激活細(xì)胞的自噬；當(dāng)細(xì)胞營養(yǎng)充足時，mTOR 活性又會被激活，從而抑制細(xì)胞自噬[17]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的信號通路之間并非是獨立的，而是相互交匯的，并且形成了復(fù)雜的信號網(wǎng)，細(xì)胞自噬參與眾多固有免疫信號的調(diào)控，在固有免疫的調(diào)控中，自噬mTOR 通路對TLR4/NF-κB 通路的調(diào)控起著重要作用[18]。Mojgan 等[19]研究發(fā)現(xiàn)NF-κB 的活化可抑制TNF-α 誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，這一作用與mTOR 調(diào)控信號分子有關(guān)。本試驗結(jié)果顯示，與對照組相比，脂多糖組上調(diào)了TLR4、NF-κB、TRAF6、MyD88、LC3、ULK1和Beclin1的mRNA 表達(dá)及NF-κBp65 和p-NF-κBp65 的蛋白表達(dá)，說明脂多糖在誘導(dǎo)小鼠RAW264.7 細(xì)胞發(fā)生自噬的同時也激活了TLR4/NF-κB 信號通路。當(dāng)mTOR 被抑制時，脂多糖對NF-κBp65 磷酸化水平較抑制前明顯降低，而在mTOR被抑制后黑枸杞花青素對NF-κBp65 磷酸化水平?jīng)]有明顯的影響；當(dāng)TLR4/NF-κB 通路被阻斷后，LPS 誘導(dǎo)的自噬水平較抑制前顯著降低，此時黑枸杞花青素下調(diào)LC3、ULK1、Beclin1和mTOR的mRNA 表達(dá)及p-mTOR的蛋白表達(dá)。這一結(jié)果說明黑枸杞花青素具有抑制巨噬細(xì)胞自噬的功能且LPS 對TLR4/NF-κB 的激活受到mTOR 的調(diào)控，mTOR 通路可能是自噬調(diào)節(jié)炎癥的免疫信號途徑。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果顯示，黑枸杞花青素對LPS 誘導(dǎo)的炎癥具有保護(hù)作用，且TLR4/NF-κB 通路的激活受mTOR的調(diào)控，mTOR 通路可能是自噬調(diào)節(jié)炎癥等免疫反應(yīng)的信號途徑。