周 羽，劉 媛，汪序忠，周曉龍，楊松柏，段 星，宋 丹*，李向臣

（1.浙江農(nóng)林大學動物科技學院動物醫(yī)學院，浙江杭州 311300；2.浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應用技術(shù)研究重點實驗室，浙江杭州 311300；3.浙江省安吉振望農(nóng)牧科技有限公司，浙江湖州 313300）

雙酚A（BPA）是環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，也是一種重要的有機化工原料，已大量應用于生活塑料制品制造以及食品金屬包裝表面涂層等。BPA 的大量生產(chǎn)和廣泛應用也使得BPA 在環(huán)境中普遍存在。BPA 能夠通過消化道、呼吸道和皮膚吸收進入生物體體內(nèi)[1]，通過與雌激素受體、雄激素受體、甲狀腺素受體等多種生物受體相互作用，進而干擾生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、代謝功能，以及對后代的生長和發(fā)育造成健康危害[2]。已有研究證明BPA 有毒和嚴重的不確定副作用，可能是發(fā)展成乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌等癌癥的危險因素[3]。研究報道，環(huán)境中所含的BPA 能夠降低雄鼠的精子數(shù)量、活力，造成精子DNA 損傷[4]。子宮長期暴露于低劑量的BPA（1 μg/kg/day）會引起雌鼠成年時期輸卵管病變[5]，高劑量的BPA（100mg/kg/day）會導致胚胎發(fā)育遲緩，發(fā)育不全[6]。美國食品和藥物管理局（FDA）確定5 mg/kg BPA 為未觀察到全身毒性副作用的適當水平。已證明，50 mg/kg 的BPA 是造成大鼠腎臟功能中度損傷的最低劑量，并且用于模擬職業(yè)工人所暴露的BPA 量[7]。此外，流行病學研究表明，在成年人和兒童尿液中高水平的BPA 與低度蛋白尿風險有關(guān)，這也提醒人們注意日常生活中暴露于BPA 可能對腎臟產(chǎn)生不利影響，并可能導致終身累進性腎臟損傷[8]。

目前對于BPA 的研究大部分集中在對動物和人體生殖系統(tǒng)的影響，對腎臟功能的研究較少，特別是對于豬腎臟損傷的研究尚未見報道。因此，本試驗以豬腎細胞（PK15）為試驗材料，檢測BPA 對細胞活力、凋亡、炎性因子表達以及ROS 含量的影響，探討B(tài)PA 在豬腎細胞的毒性作用，并揭示其引起腎損傷的可能作用機理，不僅為進一步了解BPA 暴露的毒性作用機理提供科學依據(jù)，而且為評估和預防BPA 對豬機體的毒性作用提供參考，進而促進畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 雙酚A：純度＞99.8%，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國Hyclone 公司；胎牛血清購自德國PAN-Biotech 公司；青鏈霉素雙抗購自北京CellMax 細胞技術(shù)有限公司；胰蛋白酶購自美國Gibco公司；DL2000 Plus DNA Marker 購自南京Vazyme 生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（DMSO），多聚甲醛購自北京索萊寶科技有限公司；ROS 試劑盒購自美國Sigma 公司；Hoechst33258 細胞凋亡染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒購自TaKaRa 公司。

1.2 主要儀器 試驗儀器主要包括CO2細胞培養(yǎng)箱、全波長酶標儀、梯度PCR 熱循環(huán)儀、熒光定量 PCR 儀（Thermo Electron Corporation）、激光共聚焦熒光顯微鏡（Nikon）、超凈工作臺（青島海爾特種電器有限公司）、微量核酸蛋白濃度測定儀（杭州奧盛儀器有限公司）、臺式高速離心機（香港力康發(fā)展有限公司）、倒置相差顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限責任公司）。

1.3 細胞培養(yǎng) PK15 細胞在補充有10% 胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基，37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞長滿時，將細胞培養(yǎng)于6 孔細胞培養(yǎng)板中，根據(jù)試驗設計進行BPA處理。

1.4 細胞活力測定 細胞約以 1×105個/mL 濃度接入96孔板，待細胞融合度達到70%～80%，設置不同濃度的BPA (0、1、10、100、200、500 和1 000 μmol/L) 處理，然后設置不同時間梯度（0、2、4、6 h）處理，加入CCK-8 試劑孵育2 h，使用酶標儀讀取450 nm 吸光度，以測定細胞活力并確定最適BPA 處理濃度和處理時間。

1.5 RNA 的提取、引物鑒定和qRT-PCR 分析 使用Trizol 試劑提取PK15 細胞中總RNA，使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。以所得cDNA為模板，利用內(nèi)參基因GAPDH 作為對照，進行PCR 擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA 質(zhì)量。使用10×EasyTaqPCR SuperMix 進行 PCR 反應，瓊脂糖凝膠電泳驗證炎性和凋亡相關(guān)基因的引物擴增條帶大小和特異性。所有引物退火溫度均調(diào)整為61℃，PCR 擴增條件為 95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，61 ℃ 5 s，72 ℃ 15 s，40 個循環(huán)；72℃ 5 min。根據(jù)TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量PCR 試劑盒說明書混合反應體系，在熒光定量PCR 儀上進行基因表達分析。各基因引物序列見表1。

表1 定量引物序列

1.6 ROS 染色檢測 以2'，7' -二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）來評估ROS 含量。DCFH-DA 是一種細胞通透性非熒光探針，它在細胞內(nèi)去酯化，被ROS氧化后轉(zhuǎn)化為高度熒光的2'，7'-二氯熒光素。PK15 細胞置于六孔板內(nèi)培養(yǎng)，200 μmol/L 的BPA 處理6 h，10 μmol/L DCFH-DA 37℃暗箱孵育30 min，孵育后用PBS 反復清洗去除多余的染色液即可置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。

1.7 Hoechst33258 染色 細胞以 1×105個/mL 濃度接入放有細胞爬片的6 孔板。當細胞融合度達到70%～80%時，用200 μmol/L BPA 處理試驗組6 h，對照組不做處理。處理后，用4%多聚甲醛室溫固定細胞10 min，去除固定液，PBS 反復清洗后加入0.5 mL Hoechst 染色液，染色5 min。去除染色液，PBS 反復清洗，加抗熒光淬滅封片液于載玻片上，封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤表示。根據(jù)具體試驗，數(shù)據(jù)分析采用單因素方差（ANOVA）分析不同組間差異或?qū)W生t檢驗分析兩組之間的差異。使用Graphpad Prism 軟件繪制圖表。P＜0.05 代表差異顯著，有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BPA 對PK15 細胞活力的影響 用不同濃度的BPA處理PK15 細胞，CCK-8 檢測細胞活力如圖1-A 所示，隨著BPA 濃度的增加，細胞活力呈劑量依賴性降低。與對照組相比，當BPA 濃度大于等于200 μmol/L 時，PK15 細胞的活力下降（P＜0.001）。然后設置不同的時間梯度），選用200 μmol/L BPA 處理PK15 細胞，結(jié)果如圖1-B 所示，隨著處理時間的延長，細胞活力越低，且在處理6 h 時降低（P＜0.001）。

圖1 BPA 對PK15 細胞活力的影響

2.2 RNA 的提取及cDNA 的制備 使用Trizol 溶液提取PK15 細胞總RNA，利用微量核酸蛋白濃度測定儀測定RNA 濃度后進行瓊脂糖凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)28S，18S 和5S 條帶均較清晰，且28S 最亮，5S 最淺（圖2-A）。隨后，將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以獲得的cDNA 為模板利用內(nèi)參基因GAPDH進行PCR 擴增，結(jié)果顯示擴增條帶單一，且大小符合預期（圖2-B）。

圖2 RNA 和cDNA 的瓊脂糖凝膠電泳

2.3 普通PCR 驗證引物特異性 如圖3 所示，炎性相關(guān)因子基因的引物擴增條帶中總有一條大小符合預期，且條帶清晰而單一（圖3-A），凋亡相關(guān)基因的引物擴增條帶也符合預期（圖3-B）。

圖3 引物驗證的瓊脂糖凝膠電泳

2.4 BPA 對PK15 細胞中炎性相關(guān)基因表達的影響 如圖4 所示，與對照組相比，200 μmol/L BPA 處理PK15細胞6 h 后，炎性因子相關(guān)基因IL-8、IL-6、TNF-αmRNA 相對表達量升高（P＜0.05），IL-1βmRNA 呈現(xiàn)上升趨勢（P＞0.05）。

圖4 BPA 對PK15 細胞中炎性相關(guān)基因表達的影響

2.5 BPA 對PK15 細胞凋亡的影響 如圖5-A 所示，與對照組相比，BPA 處理后促凋亡基因Caspase3和BAXmRNA 相對表達量增加（P＜0.01），抗凋亡基因BCL-2mRNA 相對表達量下降（P＜0.01）。免疫熒光染色結(jié)果顯示，對照組中沒有明顯凋亡細胞，染色均勻，細胞呈現(xiàn)弱淡藍色熒光；而BPA 處理組中見具有凋亡特征的細胞，細胞核凝結(jié)，且呈現(xiàn)強藍色熒光（圖5-B）。

圖5 BPA 對PK15 細胞凋亡的影響

2.6 BPA 對PK15 細胞中ROS 水平的影響 如圖6 所示，與對照組相比，BPA 處理組的ROS 熒光強度增強（P＜0.001）。

圖6 BPA 對PK15 細胞中ROS 水平的影響

3 討 論

BPA 是公認的環(huán)境污染物，對人和動物機體的生殖系統(tǒng)、胚胎發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等多方面均具有不利影響，對肝、腎、脾和肺等器官有嚴重的毒性作用，如BPA 誘導人體肝臟脂質(zhì)積累，促進非酒精性脂肪肝的發(fā)展[9]。低劑量BPA（0.1 μg/mL）能夠加重小鼠肺炎癥反應，導致免疫功能異常[10]；高劑量BPA（400 mg/kg）大鼠脾臟組織中淋巴濾泡顯著減小，紅髓面積增大，白髓面積減小[11]。腎臟是動物機體重要的器官，維持整個機體的穩(wěn)態(tài)，其功能單位腎元通過三層結(jié)構(gòu)的毛細血管壁，由腎小球濾過將血液和尿液中的雜質(zhì)和有害物質(zhì)排出體外，并通過重吸收以維持體液的體積和含量。所以一旦腎臟出現(xiàn)問題，機體內(nèi)的有毒物質(zhì)排不出去，有很大安全隱患。本試驗結(jié)果表明，高濃度的BPA 能夠顯著降低PK15 細胞活力，增加凋亡的細胞數(shù)，促進炎性相關(guān)因子的表達以及增加細胞內(nèi)ROS 含量。這是關(guān)于BPA 對豬腎細胞損傷的首次報道，本研究提供了BPA 通過抑制細胞活力，增加細胞凋亡以及炎性反應來損害豬腎臟細胞的證據(jù)。

Wang 等[12]研究指出，人類尿中BPA 的最低濃度高達5.56 μg/L，相當于24.35 nmol/L ；Jiao 等[13]選用0.4 mmol/L BPA 作用于大鼠小腸上皮細胞6 h 來模擬急性損傷?？紤]到高水平BPA 可能對腎臟細胞產(chǎn)生的影響，本研究分別設置不同濃度和時間梯度的BPA 處理，通過CCK-8 檢測細胞活力發(fā)現(xiàn)，BPA 濃度越高，處理時間越長，細胞活力則越低，這與BPA 暴露對小鼠腔前卵泡顆粒細胞、神經(jīng)干細胞、結(jié)腸上皮細胞和小腸上皮細胞的研究結(jié)果一致[13-14]，即當BPA 暴露濃度超過100 μmol/L 時，細胞活力和增殖率顯著降低。因此本研究選用200 μmol/L BPA，處理6 h 用于后續(xù)試驗。

在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，飼養(yǎng)管理不當、病理因素和環(huán)境因素都有可能損傷體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)，誘導氧化應激。在正常條件下，生物體內(nèi)ROS 的產(chǎn)生和清除維持著一種動態(tài)平衡，這種平衡在不利條件下會受到干擾。過量的ROS 會干擾生物體內(nèi)氧化還原狀態(tài)，引起氧化應激發(fā)生。研究表明，100 μmol/L BPA 暴露增加了胚泡內(nèi)ROS 含量，導致線粒體損傷，對豬胚胎發(fā)育具有不良影響[15]。BPA 可促進豬卵母細胞產(chǎn)生較高的ROS，抑制卵母細胞的減數(shù)分裂成熟，卵丘細胞擴張和功能障礙，以及卵母細胞凋亡[16]。本研究結(jié)果表明，BPA 顯著增強了ROS 染色熒光強度，即增加了ROS 產(chǎn)生，能夠誘導豬腎細胞發(fā)生氧化應激。

腎臟疾病的病理類型多樣，多種慢性腎臟疾病的發(fā)生與發(fā)展均與氧化應激有關(guān)，因此炎癥調(diào)節(jié)是腎臟疾病治療發(fā)展的關(guān)鍵之一[17]。ROS 升高被認為是炎性反應的標志，其通過誘導多種炎性介質(zhì)和促炎細胞因子的分泌來啟動炎性反應[18]。TNF-α、IL-6、IL-8 和IL-1β是最常見的炎癥檢測標志物。IL-6 是一種促炎細胞因子，具有支持機體多種慢性炎性反應、誘導急性期反應等功能。IL-6 刺激NK-κB 配體受體活化因子會導致骨吸收和骨質(zhì)疏松，誘導血管內(nèi)皮生長因子產(chǎn)生，導致血管生成和血管通透性增加，出現(xiàn)炎癥病變[19]。TNF-α是一種參與機體全身性炎癥反應的細胞信號蛋白，是炎癥反應的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[20]；IL-8 也是一種有效的促炎趨化因子，IL-8 和TNF-α水平的升高與各種疾病的成年患者的急性腎損傷有關(guān)[21]。BPA 暴露可干擾免疫功能，結(jié)合PK15 細胞中一些關(guān)鍵促炎因子IL-6、IL-8、TNF-αmRNA 相對表達量顯著上調(diào)，推斷BPA 可能通過細胞內(nèi)ROS 積累增加而誘導PK15 細胞發(fā)生炎性反應。

有證據(jù)表明，ROS 含量增加可能作為第二信使上調(diào)促凋亡基因的表達，激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（Caspase），誘導細胞凋亡[22]。線粒體外膜上的BAX 和BCL-2 二聚體的形成，引起線粒體外膜通透性的改變[23]。當線粒體受損時，Caspase 激活并參與隨后的水解反應，導致細胞凋亡。而且炎癥過度可能誤導細胞激活線粒體凋亡通路，導致細胞凋亡[24]。Yuan 等[25]使 用1、10、100、1 000 μmol/L 的BPA 處理恒河猴胚胎腎上皮細胞，發(fā)現(xiàn)BPA 引起ROS 水平上升，誘發(fā)氧化應激，進而參與細胞凋亡。一致地，本研究結(jié)果顯示，BPA 處理的細胞中促凋亡基因Caspase3和BAX表達顯著增加，抗凋亡基因BCL-2表達顯著降低。Hoechest33258 染色顯示BPA 顯著增加了凋亡細胞數(shù)量，充分證實BPA 可誘導細胞凋亡。綜上表明，BPA 誘導的PK15 細胞炎性因子表達上升以及細胞凋亡可能與ROS 含量上升導致的氧化應激增強有著密不可分的關(guān)系。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明，高濃度的BPA（200 μmol/L）顯著降低PK15 豬腎細胞活力，并且呈現(xiàn)一定濃度和時間依賴性，增加細胞內(nèi)ROS 含量，誘導細胞凋亡和炎性反應。