鐘代彬，張海濤，王 瑾，朱子岳

（1.北京奶牛中心，北京 100192；2.奶牛遺傳育種與繁殖北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100192；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶牛遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100192；4.北京市延慶區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102100）

遺傳因素、飼養(yǎng)管理、營(yíng)養(yǎng)水平及環(huán)境因素等均會(huì)對(duì)公牛精液品質(zhì)產(chǎn)生影響，其中環(huán)境熱應(yīng)激對(duì)健康及精液品質(zhì)的影響較大。熱應(yīng)激是指機(jī)體受到超過(guò)自身體溫調(diào)節(jié)能力的過(guò)高溫度刺激時(shí)產(chǎn)生的非特異性應(yīng)答反應(yīng)的總和，可由溫度、相對(duì)濕度、太陽(yáng)輻射和空氣流動(dòng)等多種環(huán)境因素引起。隨著全球性氣溫升高和畜牧業(yè)規(guī)?；?、集約化發(fā)展，熱應(yīng)激對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的影響越來(lái)越受到重視。夏季熱應(yīng)激可導(dǎo)致種公畜精液質(zhì)量下降，繁殖性能降低[1-2]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)熱應(yīng)激開展了較多研究，并用溫濕度指數(shù)（Temperature-Humidity Index，THI）來(lái)衡量畜禽受環(huán)境溫濕度影響的熱應(yīng)激程度[3]。童津津等[4]研究發(fā)現(xiàn)在熱應(yīng)激期間THI 與乳脂率、乳蛋白率存在極顯著負(fù)相關(guān)。Llamas-Luce?o 等[5]研究發(fā)現(xiàn)THI 偏高時(shí)，乳用公牛精子活力降低，囊胚發(fā)育減少。劉深賀等[6]探討了THI 對(duì)不同品種水牛直腸溫度和呼吸頻率的影響。目前，有關(guān)環(huán)境溫濕度變化對(duì)種公牛繁殖性能持續(xù)影響的報(bào)道較少。本研究連續(xù)觀測(cè)記錄一年圈舍溫濕度、公牛發(fā)病及精液質(zhì)量變化，分析溫濕度變化對(duì)種公牛健康狀況及繁殖性能的影響，以期優(yōu)化熱應(yīng)激期間種公牛飼養(yǎng)管理和凍精生產(chǎn)流程。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 選擇年齡2～6 歲，健康狀況良好的荷斯坦公牛96 頭，正常采精。期間飼養(yǎng)管理水平恒定。

1.2 儀器設(shè)備 試驗(yàn)儀器包括分析天平（型號(hào)為PB203-N，瑞士Metterler-Toledo 公司）、精子密度儀（型號(hào)為AccuCell，法國(guó)卡蘇公司）、稀釋儀（型號(hào)為Microlab 500，瑞士Hamilton 公司）、相差顯微鏡（型號(hào)為BX43 F，日本Olympus 公司）、電視顯微顯示系統(tǒng)（型號(hào)為ZEISS-Axiostar，德國(guó)ZEISS 公司）。

1.3 飼養(yǎng)環(huán)境 半開放式圈舍，長(zhǎng)寬為110 m×11 m，長(zhǎng)軸為東西走向，墻體為磚混結(jié)構(gòu)，屋頂為拱形鋼架構(gòu)彩鋼保溫夾芯板。北墻上有窗戶，下設(shè)通風(fēng)道，夏季開窗通風(fēng)、冬季關(guān)閉。圈舍直接與運(yùn)動(dòng)場(chǎng)相通。牛只單欄飼養(yǎng)，活動(dòng)面積為80 m2。夏季采用風(fēng)扇加噴淋進(jìn)行降溫。風(fēng)扇和噴淋設(shè)施位于牛只后上方。

1.4 觀測(cè)記錄 環(huán)境溫度、濕度記錄時(shí)間為2020 年1—12 月，每日08:00、14:00 及20:00 進(jìn)行觀測(cè)記錄。測(cè)定位點(diǎn)為飼養(yǎng)通道離地面1.5 m 高度處，每個(gè)圈舍設(shè)置6 個(gè)不同的測(cè)量位置（圖1）。連續(xù)對(duì)牛群健康狀況、發(fā)病情況進(jìn)行詳細(xì)記錄。

圖1 圈舍平面圖及測(cè)量位點(diǎn)

THI 根據(jù)平均溫度和平均相對(duì)濕度計(jì)算而得。本試驗(yàn)采用Ingraham[7]建立的公式：

THI（%）=（1.8×溫度+32）-（0.55-0.55×相對(duì)濕度）×（1.8×溫度-26）

1.5 季節(jié)劃分 按氣象劃分法，春季為3—5 月、夏季為6—8 月、秋季為9—11 月、冬季為12 月、1—2 月）。

1.6 采精及質(zhì)量檢測(cè) 采用假陰道采精法采集精液，每周采精2 d，每天2 次，兩次采精間隔1 h。按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《牛冷凍精液》（GB 4143-2008）對(duì)精液劑量、活力、密度、畸形率等進(jìn)行檢測(cè)，常規(guī)方法制作凍精并檢查凍后活力。

1.6.1 劑量 精液量采用稱重法獲取。電子天平稱重獲得精液質(zhì)量（g），精子比重設(shè)定為1.040，質(zhì)量除以比重即為精液體積（mL）。

1.6.2 活力 采用目測(cè)法，取原精8 μL 于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于38℃有恒溫板的相差顯微鏡及電視顯微可視系統(tǒng)上，觀察直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)占總精子數(shù)的百分率。

1.6.3 密度 取40 μL 原精，加3 960 μL 稀釋液，稀釋后采用全自動(dòng)密度儀測(cè)定密度。

1.6.4 畸形率 精子畸形率采用濕片檢查法，每個(gè)樣品制作2 個(gè)抹片，通過(guò)相差顯微鏡及電視顯微可視系統(tǒng)檢查。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，采用Excel 2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、計(jì)算，并針對(duì)每個(gè)季節(jié)的發(fā)病情況作卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)，繁殖性能和環(huán)境指標(biāo)之間的關(guān)系采用SAS 9.2 進(jìn)行簡(jiǎn)單相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 圈舍平均溫度、相對(duì)濕度與THI 的變化 結(jié)果顯示，全年圈舍平均氣溫11.2℃，單日最低氣溫出現(xiàn)在1 月，為-18.3℃，當(dāng)月平均氣溫為-3.6℃，隨后逐月升高；單日最高氣溫在8 月，為33℃，當(dāng)月平均氣溫24.6℃，隨后逐月降低。6—9 月，環(huán)境最高氣溫超過(guò)25℃的天數(shù)分別有16、26、22、6 d。THI 從1 月開始逐月上升，6 月接近70%，7、8 月分別高達(dá)73.37%和72.37%，當(dāng)氣溫33℃時(shí)THI 為81.11%，隨后開始逐月下降（圖2）。

圖2 1—12 月圈舍溫度、相對(duì)濕度及THI 變化趨勢(shì)

2.2 5—9 月早、中、晚圈舍THI 由圖3 可見(jiàn)，中午THI 偏高，早晚相對(duì)較低；6—8 月14:00 及7 月20:00的THI 均超過(guò)72，處于熱應(yīng)激狀態(tài)。

圖3 5—9 月早、中、晚溫度、相對(duì)濕度及THI

2.3 環(huán)境溫濕度與種公牛健康的關(guān)系 由圖4 可見(jiàn)，秋季的肢蹄?。≒＜0.05）、腹瀉（P＜0.01）高于其他季節(jié)；而食欲不振、寄生蟲病在各季節(jié)間發(fā)病差異不顯著，但寄生蟲病在春、冬兩季發(fā)病率較高。

圖4 不同季節(jié)種公牛疾病發(fā)生情況

2.4 不同季節(jié)對(duì)精液品質(zhì)的影響 從表1 可見(jiàn)，季節(jié)對(duì)平均采精量、精子密度影響不顯著，其中精子密度在6 月達(dá)到最高值（12.23 億/mL）后逐漸下降，9 月最低9.43 億/mL，下降22.9%，但各季節(jié)間差異不顯著。原精活力從5 月以后呈下降趨勢(shì)，9 月降到最低后回升，下降趨勢(shì)與環(huán)境溫濕度5 月開始逐漸升高相符，夏季與春、冬季相比下降顯著；夏季畸形率最高，顯著高于冬季；凍精活力與原精活力變化趨勢(shì)一致，夏季最低、冬季最高，夏季極顯著低于春、冬季。

表1 不同季節(jié)對(duì)種公牛精液品質(zhì)的影響

2.5 溫濕度、THI 與精液品質(zhì)相關(guān)性 為了進(jìn)一步分析溫濕度、THI 與精液品質(zhì)的相關(guān)關(guān)系，包括延遲影響，作了相關(guān)系數(shù)條形圖（圖5—7）。

環(huán)境溫度對(duì)精液品質(zhì)的影響見(jiàn)圖5，其中采精量與采精前1—2 月的環(huán)境溫度有顯著的相關(guān)關(guān)系（P＜0.05，R=0.452）；原精活力、精子密度與環(huán)境溫度呈負(fù)相關(guān)，但不顯著；平均畸形率與采精當(dāng)月和采精前1 個(gè)月的環(huán)境溫度有極顯著相關(guān)關(guān)系（P＜0.01，R=0.886），與采精前2 個(gè)月的環(huán)境溫度關(guān)系顯著（P＜0.05，R=0.467）；凍精活力與采精當(dāng)月和采精前1 個(gè)月的環(huán)境溫度有極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.01，R=-0.875；P＜0.01，R=-0.862），與采精前2 個(gè)月的環(huán)境溫度顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05，R=-0.438）。

圖5 精液品質(zhì)各指標(biāo)與環(huán)境溫度相關(guān)系數(shù)條形圖

由圖6 可見(jiàn)，相對(duì)濕度對(duì)精液品質(zhì)有一定的延遲影響，采精量與采精前1—2 月的相對(duì)濕度有顯著的相關(guān)關(guān)系（P＜0.05，R=0.469）；原精活力與相對(duì)濕度相關(guān)性不顯著；精子密度與采精前2 個(gè)月的相對(duì)濕度有顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05，R=-0.420）；平均畸形率與采精當(dāng)月的相對(duì)濕度有顯著相關(guān)關(guān)系（P＜0.05，R=0.426）；凍精活力與采精當(dāng)月、采精前1 個(gè)月相對(duì)濕度分別有顯著、極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05，R=-0.458；P＜0.01，R=-0.836）。

圖6 精液品質(zhì)各指標(biāo)與環(huán)境相對(duì)濕度相關(guān)系數(shù)條形圖

由圖7 可看出，THI 對(duì)精液品質(zhì)有一定的延遲影響，其結(jié)果與環(huán)境溫度一致。

圖7 精液品質(zhì)各指標(biāo)與THI 相關(guān)系數(shù)條形圖

3 討 論

THI 作為溫?zé)岘h(huán)境的綜合指標(biāo),被廣泛用于評(píng)估動(dòng)物熱應(yīng)激風(fēng)險(xiǎn)的程度，其計(jì)算公式有多種，本試驗(yàn)記錄的濕度為相對(duì)濕度，因此采用了Ingraham 建立的公式。通常條件下圈舍內(nèi)空氣中的水汽含量大于舍外大氣的水汽含量。夏季高溫加上圈舍潮濕的環(huán)境極易造成熱應(yīng)激。一般認(rèn)為種公牛最適宜的溫度為8～16℃，公牛對(duì)高溫高濕環(huán)境較為敏感，當(dāng)圈舍溫度過(guò)高超過(guò)其體溫調(diào)節(jié)能力時(shí)會(huì)發(fā)生熱應(yīng)激，公牛食欲減退，呼吸頻率增加，機(jī)體新陳代謝加快，免疫力下降，易引發(fā)各種疾病。本研究發(fā)現(xiàn)，秋季肢蹄病、腹瀉發(fā)病率高于其他季節(jié)，可能與季節(jié)交替，晝夜溫度、濕度變化大，機(jī)體易受外界環(huán)境刺激有關(guān)，而春冬兩季寄生蟲病發(fā)病率較高，可能與氣溫低，圈舍鋪墊褥草有關(guān)。

環(huán)境溫濕度除了影響種公牛健康外，對(duì)精液品質(zhì)也有較大的影響。公牛睪丸和陰囊有其自身調(diào)節(jié)機(jī)制以保護(hù)精子的正常發(fā)育，但夏季環(huán)境持續(xù)高溫時(shí)，陰囊皮溫及睪丸溫度隨之升高，致其失去熱調(diào)節(jié)能力，睪丸溫度高于36℃時(shí)可引起生殖上皮細(xì)胞變性，生精機(jī)能受損，生殖激素分泌異常，甚至造成不育。Wiersma 等[8]認(rèn)為，當(dāng)THI 高于72 時(shí)開始表現(xiàn)出熱應(yīng)激癥狀。Maurya 等及Rao 等證實(shí)[9-10]高溫可抑制下丘腦-垂體-性腺軸影響生殖激素分泌。由于下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素（GnRH）降低，導(dǎo)致垂體減少促卵泡素（FSH）和促黃體素（LH）的分泌，使睪丸間質(zhì)的Leydig 細(xì)胞分泌的雄性激素睪酮下降，影響精子生成和成熟，造成精子畸形和死精數(shù)量增加，精液品質(zhì)下降[11]。夏季活精子比例最低，春季和夏季有顯著差異，春季精子細(xì)胞膜完整性高，DNA 斷裂指數(shù)低[12]。Garcia-Oliveros 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，公牛發(fā)生熱應(yīng)激后7 d 精子畸形率增加，14 d后精子脂質(zhì)過(guò)氧化增加，線粒體膜功能、精子活力和質(zhì)膜完整性降低，21 d 后仍可觀察到熱應(yīng)激效應(yīng)，28 d 后觀察到精子DNA 碎片增加。認(rèn)為精液發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而改變了線粒體功能、精子活力和質(zhì)膜完整性。精子受到熱應(yīng)激的損傷不可逆轉(zhuǎn)。有關(guān)熱應(yīng)激影響動(dòng)物繁殖機(jī)能的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

不同品種和年齡對(duì)熱應(yīng)激的敏感度不一樣。張瑩等[14]研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激可造成西門塔爾種公牛精液品質(zhì)顯著下降，精子活力在夏季顯著低于秋季，極顯著低于春季和冬季；精液密度夏季與秋、冬兩季差異顯著，極顯著低于春季，夏季頂體完整率和畸形率顯著高于其他季節(jié)。Felton 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，春、冬季原精和凍精活力達(dá)標(biāo)率高，且存在品種差異，肉牛品種的精液品質(zhì)優(yōu)于奶牛品種。安格斯公牛和荷斯坦公牛比印度牛品種更能抵抗熱應(yīng)激的影響。Lamas-Luce?o 等[16]認(rèn)為氣候條件不僅影響精液質(zhì)量，還影響種公牛的繁殖性能，精子發(fā)生過(guò)程中THI 升高可降低精子對(duì)低溫的耐受性；秋季在精子生成時(shí)THI 升高，凍精解凍后3 h 精子活力顯著下降（14%～18%）；與采精相比，成年公牛在精子生成過(guò)程中對(duì)THI 更為敏感，對(duì)凍精質(zhì)量的負(fù)影響高出3.8 倍。

本試驗(yàn)表明，種公牛對(duì)低溫不敏感但對(duì)高溫敏感，夏季熱應(yīng)激對(duì)繁殖性能影響較大，但試驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)道不完全相同，可能與公牛品種、年齡不同有關(guān)，另外試驗(yàn)公牛飼養(yǎng)地夏季相對(duì)涼爽，且采取了通風(fēng)、噴淋等防暑降溫措施，一定程度上降低了熱應(yīng)激的影響。本研究還發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激不僅影響當(dāng)月的精液品質(zhì)，而且具有一定的延后影響，與公牛生精周期45～60 d 基本一致。因此，夏季需要采取更有力的措施，通過(guò)精細(xì)化飼養(yǎng)管理，飼喂抗熱應(yīng)激添加劑，加強(qiáng)機(jī)械通風(fēng)和淋浴等措施，以提高牛只舒適度，降低熱應(yīng)激對(duì)種公牛健康及繁殖性能的影響。

4 結(jié) 論

春季和冬季THI 最低，春、冬兩季種公牛的精液品質(zhì)最佳，原精活力、凍精活力最高，畸形率最低。夏季THI 最高，其中6 月中午，7—8 月中午及晚上THI均超過(guò)72，種公牛處于熱應(yīng)激狀態(tài)。熱應(yīng)激使種公牛繁殖性能下降，且對(duì)精液品質(zhì)的影響具有1—2 月的延遲作用。秋季肢蹄病、腹瀉病多發(fā)，春冬兩季寄生蟲發(fā)病率較高。