劉騰飛，章延嘉，李大力，齊亞磊，韓紅輝，馬雪云

（華東師范大學(xué)生命醫(yī)學(xué)研究所，上海 201100）

隨著生命科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的應(yīng)用越來越廣泛[1-4]。小鼠作為生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中使用最廣泛的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，基因工程小鼠也隨之增多，為了長期保存重要基因型小鼠，需要長期飼養(yǎng)，不僅占用大量的空間、人力和經(jīng)費(fèi)，還容易造成基因污染和漂移最終導(dǎo)致基因丟失，而將小鼠精子進(jìn)行冷凍，不僅可以將重要基因型進(jìn)行長期儲(chǔ)存，還可以避免由于長期飼養(yǎng)所引起的活體動(dòng)物間疾病傳播，同時(shí)方便長距離運(yùn)輸和國際間基因資源的交流。

谷氨酰胺（Gln）在動(dòng)物體內(nèi)含量非常豐富，約占總游離氨基酸的25%，是合成氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸和多種生物活性物質(zhì)的前體。有研究表明，Gln 具有抗氧化、抗炎、提供能量、提高免疫等作用[5-7]。除以上功能外，Gln 會(huì)參與谷胱甘肽（GSH）的合成，參與GSH清除體內(nèi)過氧化物的反應(yīng)。為提高小鼠精子冷凍復(fù)蘇后的存活率，提高冷凍精子的體外受精率，本研究在小鼠精子凍存液（CPA）中添加不同濃度的Gln，探討其在小鼠精子冷凍保護(hù)中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 14 周齡野生型SPF 級(jí)C57BL/6 雄鼠10只，4 周齡野生型SPF 級(jí)C57BL/6 雌鼠40 只，由華東師范大學(xué)閔行校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證編號(hào)為[SCXK（滬）2016-0004]，使用許可證編號(hào)為[SYXK（滬）2015-0011]，屏障環(huán)境溫度為21～25℃，濕度為40%～60%，光照周期為12 h:12 h，小鼠生存期間自由飲水和采食。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理批準(zhǔn)編號(hào)為（m202002015）。

1.2 試劑與儀器 脫脂奶粉、Gln（Beyotime，ST083)、D（+）-棉子糖五水合物（aladdin，R111688）、凍精復(fù)蘇液和體外受精液（HTF）均為本實(shí)驗(yàn)室自行配制。注射用孕馬血清激素（PMSG）、注射用人絨毛膜促性腺激素（HCG）均為寧波第二激素廠生產(chǎn)。邁朗精子分析儀購自南寧松景天倫生物科技有限公司，儀器型號(hào)為ML-16011826。

1.3 精子參數(shù) 精子分析儀所測的主要參數(shù)包括平均曲線速度（VCL）、直線速度（VSL）、平均路徑速度（VAP）、側(cè)擺幅度（ALH）。其中，VCL 是精子頭沿其實(shí)際曲線路徑運(yùn)動(dòng)的軌跡長度/所花費(fèi)的時(shí)間。VSL 是精子在受檢時(shí)間范圍內(nèi)所走直線距離/時(shí)間的平均值。VAP 是精子沿其空間平均移動(dòng)軌跡運(yùn)動(dòng)時(shí)，所走路程/時(shí)間的平均值。ALH 是精子在運(yùn)動(dòng)過程中，實(shí)際軌跡相對(duì)其平均移動(dòng)軌跡的偏離幅度。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 CPA 配制 分別配制含 0、50、100、150 mmol/L Gln 的CPA 液，以 上 試 劑12 000 r/min 離 心10 min，取上清液，0.22 μm 濾器過濾，分裝到EP 管中于-20℃冷凍保存。

1.4.2 精子采集 脫頸椎處死雄鼠，取出兩側(cè)附睪，將附睪放入不同濃度的CPA 液中，將附睪剪碎，然后將含有附睪的CPA 液放入培養(yǎng)箱孵育3 min，使精子充分游離出來。

1.4.3 精子凍存 取出麥管，將含有精子的凍存液分裝入麥管，加熱密封麥管兩頭，然后將麥管放在液氮蒸汽中10 min 之后投入液氮，保存1 個(gè)月。

1.4.4 精子復(fù)蘇 將麥管從液氮中取出，在空氣中靜置30 s，然后將麥管迅速投入37℃水中，晃動(dòng)麥管加速凍存液溶解，將含有精子的凍存液吹入精子解凍液中，2 500 r/min 離心3 min，棄去上清液，加入適量HTF重懸成精子懸液，然后進(jìn)行精子動(dòng)力學(xué)檢測。

1.4.5 精子動(dòng)力學(xué)檢測 將精子懸液加入載玻片，用精子分析儀分析精子相關(guān)參數(shù)，每個(gè)精子樣本測試3 次。

1.4.6 體外受精 取4 周齡C57BL/6 雌鼠，腹腔注射PMSG 7.5 IU，48 h 后注射HCG 7.5 IU，14～16 h 后，頸椎脫臼處死雌鼠，無菌取出輸卵管，體視顯微鏡下找到膨大部，釋放卵團(tuán)，將卵團(tuán)挑入100 μL 已預(yù)熱的用礦物油覆蓋的HTF 中，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中，取復(fù)蘇后的精子液10 μL 加入含有卵團(tuán)的受精滴中，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，完成受精過程。

1.4.7 受精率 精卵結(jié)合6 h 后，將受精滴中的卵用預(yù)熱過的HTF 溶液清洗干凈，置于KSOM 培養(yǎng)液中，放于37℃體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，18 h 后計(jì)算受精率。

1.4.8 囊胚率 將上述體外受精獲得的2 細(xì)胞胚胎在KSOM 培養(yǎng)基中洗3 次，然后轉(zhuǎn)移至預(yù)熱好的KSOM培養(yǎng)液中，放入37℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至囊胚，計(jì)算囊胚形成率。

囊胚形成率=囊胚數(shù)/2 細(xì)胞胚胎數(shù)×100%

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS 23.0 軟件對(duì)分組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用單因素方差分析（ANVOA）進(jìn)行q 檢驗(yàn)，組間比較用方差分析，P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 精子動(dòng)力學(xué)分析 如表1 所示，與對(duì)照組相比，Gln 濃度達(dá)到 50 mmol/L 時(shí)即可觀察到精子參數(shù)VCL、VSL、VAP、ALH 值提高（P＜0.01)。當(dāng)Gln 濃度處于100 mmol/L 時(shí)，精子參數(shù)VCL、VSL、VAP、ALH 值提高（P＜0.01)，當(dāng)Gln 濃度高于150 mmol/L 時(shí)，精子參數(shù)VCL、VSL、VAP、ALH 值開始下降。

2.2 精子復(fù)蘇后對(duì)受精率和囊胚發(fā)育率的影響 如表2 所示，與對(duì)照組相比，Gln 濃度達(dá)到50 mmol/L 時(shí)精子體外受精率有提高（P＜0.01)。當(dāng)Gln 濃度達(dá)到100 mmol/L時(shí)，精子體外受精率最高（P＜0.01)。當(dāng)Gln 濃度高于150 mmol/L 時(shí)，精子體外受精率開始下降（P＜0.01）。各濃度下囊胚形成率無顯著變化。

3 討 論

Gln 是生物代謝的能源，是細(xì)胞快速增值的能量供體，與代謝旺盛的組織生長和修復(fù)密切相關(guān)[8]。同時(shí)Gln 是體內(nèi)多種抗氧化物質(zhì)的前體，在對(duì)抗體內(nèi)自由基、抗氧化損傷和維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面具有重要作用。與新鮮精子相比，反復(fù)凍融過的精子活性氧含量顯著增高，精液中過氧化物含量過高會(huì)降低精子質(zhì)量[9]。肖英平等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Gln 可抑制由H2O2誘導(dǎo)的HT-29 細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷和凋亡。李大鵬等[11]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)大鼠灌胃1 mL/100g 丙氨酰谷氨酰胺注射液，大鼠血液中過氧化氫酶活性有所提高。丙氨酰谷氨酰胺在血液中可迅速分解為丙氨酸和Gln。陳鵬等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Gln 可能通過抑制NCM460 細(xì)胞線粒體凋亡途徑來抑制由脂多糖誘導(dǎo)的NCM460 細(xì)胞凋亡。Sariozkan 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，CPA 中添加Gln 可以有效保護(hù)兔子精子抵抗冷藏引起的功能和結(jié)構(gòu)的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，50～150 mmol/L Gln 在小鼠精子凍存中可以減少精子損傷，提高復(fù)蘇精子體外受精率，這可能是因?yàn)镚ln 能提供能量以及具有抗氧化作用有關(guān)。安鐵洙等[14]研究也發(fā)現(xiàn)，在HTF 中添加1.0 mmol/L 的L-谷氨酰胺進(jìn)行ICR 小鼠體外授精，可將新鮮精子體外受精率由26% 提高到51%。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，在CPA 中添加50mmol/L Gln 可以顯著提高小鼠冷凍精子的體外受精率。隨著Gln 濃度增高，體外受精率隨之增高，當(dāng)Gln 濃度為100 mmol/L 時(shí)效果最好，超過100 mmol/L 后體外受精率隨著Gln 濃度增加而降低。以上結(jié)果說明，在CPA 中添加100 mmol/L Gln可以有效降低精子在冷凍過程中受到的氧化損傷程度，并提高解凍后精子的體外受精能力。