齊·阿拉達爾，胡建偉，李蒙蒙，高雪麗，鄭文祥，姚新奎,3

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾自治區(qū)地方國營伊犁種馬場，新疆昭蘇縣 835612;3.新疆馬繁育與運動生理重點實驗室，新疆烏魯木齊 830052）

環(huán)境和訓練是影響馬速度能力的重要因素，近年的研究也揭示了遺傳因素對馬運動能力的影響。英純血（Thoroughbred）也稱為純血馬，起源于英國，是專門為速度賽而培育的馬品種，經(jīng)歷了三百多年的封閉式人工選育，目前每200 米奔跑用時達10～12 s，可稱為世界上速度最快的馬品種。美國的夸特馬（Quarter horse）、標準品種（Standardbred）以及歐洲的一些溫血馬品種的培育過程中都有純血馬血統(tǒng)導入。研究表明，純血馬的短距離爆發(fā)力和最適比賽距離與馬的抑肌素基因（MSTN）有一定的相關性[1-3]。MSTN基因第一內(nèi)含子中的g.66493737 T＞C 突變可以判斷純血馬最適比賽距離，攜帶CC 型純合突變的馬更適合短距離爆發(fā)力的比賽，而攜帶TT 型的純合子個體更容易在中長距離比賽中獲勝[4]。因此，MSTN基因的g.66493737 T＞C 突變被認為是“速度基因”標記[5]。最近研究發(fā)現(xiàn)，在純血馬MSTN啟動子上的一個227 bp 的短散在核原件（Short Interspersed Nuclear Elements，SINE）的插入影響了MSTN基因的轉(zhuǎn)錄效率和肌纖維組成，是真正引起“速度基因”效應的變異[5-6]。在純血馬群體中SINE 插入與C 變異呈高度連鎖，但在一些非速度型品種中C 突變頻率不高，也并不與SINE插入連鎖[11]。

伊犁馬分布于新疆伊犁州直屬的昭蘇、特克斯、尼勒克、新源、鞏留等縣境內(nèi)，是從20 世紀初開始以哈薩克馬為母本，與引進的前蘇聯(lián)的奧爾洛夫、頓河、布瓊尼、阿哈爾捷金馬等輕型種公馬進行雜交改良而培育的騎乘型馬品種[7]。隨著近年新疆馬產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型發(fā)展，人們再次嘗試用不同形式的雜交改良和選育將伊犁馬向速度型、速步型、耐力型、乳用型、肉用型和騎乘型等多個方向培育。21 世紀初，新疆伊犁種馬場采取了伊犁母馬與英純血種公馬雜交的形式，將伊犁馬的培育方向定位為速度方向的培育，群體目前以級進雜交二代為主。伊犁種馬場的速度型伊犁馬經(jīng)過二十年的培育，體尺和速度能力都得到了進一步改善。本研究旨在通過比較原始伊犁馬群體和培育的速度型伊犁馬群體中“速度基因”標記——MSTNg.66493737T＞C 突變和SINE 插入突變的分布頻率和連鎖關系，為速度型伊犁馬的進一步選育工作提供分子遺傳學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本實驗研究的兩組群體分別是原始伊犁馬和速度型伊犁馬。原始伊犁馬是指上個世紀以哈薩克馬為母本，與引進的前蘇聯(lián)馬品種進行雜交并經(jīng)過橫交固定的伊犁馬品種。速度型伊犁馬是指伊犁母馬與英純血公馬的雜交群體，在本研究中稱為英純-伊犁馬。原始伊犁馬血樣30 份，采集于2011 年的伊犁自治州昭蘇縣喀拉蘇鄉(xiāng)牧民家。英純-伊犁馬血樣76 份，來自新疆維吾爾族自治區(qū)地方國營伊犁種馬場。

1.2 基因組DNA 提取 部分馬血液樣品的DNA 提取使用常規(guī)酚-氯仿抽提法[8]，部分樣品使用全式金EasyPure?Blood Genomic DNA Kit（EE121-02）進 行提取。2 種方法對后續(xù)實驗結(jié)果無影響。將基因組DNA溶解于TE 緩沖液，在-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。?.5%的瓊脂糖凝膠電泳對基因組DNA 進行質(zhì)量檢測。

1.3 PCR 擴增和測序 本實驗對MSTN第一內(nèi)含子區(qū)域（含SNP g.66493737T＞C）和MSTN啟動子附近227 bp的SINE 插入?yún)^(qū)域進行PCR 擴增和電泳檢測。PCR 擴增體系為25 μL：2×Master Mix Buffer 12.5 μL，l0 μM 正向和反向引物分別0.5 μL，DNA（50 ng/μL）模板0.5 μL，加ddH2O 至25 μL。為了保證得到特異性產(chǎn)物，MSTN第一內(nèi)含子片段擴增使用Touchdown 擴增方法：60℃退火2 個循環(huán)，59℃退火2 個循環(huán)，最后58℃退火28 個循環(huán)，每循環(huán)的延伸時間為45 s，其他步驟按Taq PCR Master Mix 說明書要求設置。SINE 插入PCR 反應使用59℃退火溫度，延伸時間為90 s，進行30 個循環(huán)，其他步驟根據(jù)Taq PCR Master Mix 說明書要求設置。擴增試劑為Taq PCR Master Mix（生工生物工程（上海）股份有限公司，B639295）及相關產(chǎn)品。引物設計分別參考Dall'Olio[9]和Rooney[5]（表1），引物合成和PCR 產(chǎn)物擴增由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

表1 MSTN 基因和SINE 插入引物序列和產(chǎn)物長度

1.4 數(shù)據(jù)分析 計算基因雜合度（Heterozygosity，He）使用公式、有效等位基因數(shù)（Effective Number of Alleles，Ne）和多態(tài)信息含量（Polymorphism Information Content，PIC）分別見公式（1）、（2）、（3）。

式中，n=等位基因數(shù)量，Pi=第i 個等位基因頻率，Pj=第j 個等位基因頻率。

連鎖不平衡（LD）的r2值使用PLINK（v1.07，http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/）軟件的ld命令計算，其中ped 文件中個體的父母本和性別信息全部設為0。

2 結(jié)果與分析

2.1 伊犁馬中MSTNg.66493737T＞C SNP 多態(tài)性 對原始伊犁馬和英純-伊犁馬MSTN第一內(nèi)含子區(qū)域進行擴增，產(chǎn)物長度為480 bp（圖1）。在MSTN基因g.2115位點處存在A 和G 多態(tài)性（圖1）。由于本研究測得的序列與文獻中的速度基因多態(tài)位點SNP g.66493737 T＞C 為互補關系[10]，因此G 突變即代表C 突變，按照文獻慣例將本文中測得的G 突變稱為C 突變。結(jié)果顯示，原始伊犁馬群體MSTN基因T/C 突變的有效等位基因數(shù)Ne 為1.142，主要以T 等位基因形式存在，C 等位基因頻率只占0.07。原始伊犁馬中沒有CC 型純合個體，CT 型雜合個體占13%。而在英純-伊犁馬中，C 等位基因頻率為0.47，有效等位基因數(shù)Ne 為1.994，說明C 和T 2 個等位基因都是有效等位基因。在英純-伊犁馬中CC 型純合個體占13%、CT 型雜合個體占68%、TT 型純合個體占18%，基因雜合度He 為0.499，說明群體中的C 基因主要以雜合形式存在。

圖1 MSTN 第一內(nèi)含子PCR 擴增產(chǎn)物條帶及多態(tài)位點基因型

表2 伊犁馬中MSTN 的g.66493737C＞T 基因型分布

2.2 伊犁馬中SINE 插入多態(tài)性 通過PCR 產(chǎn)物等位基因多態(tài)性分析，對MSTN中有無SINE 插入進行檢測。PCR 產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果顯示，3 種類型的帶型分別命名為II 型（2 條同源染色體都發(fā)生插入，雙插入）、IN 型（一條同源染色體有插入而另一條沒有，單插入）和NN 型（2條同源染色體都沒有插入，無插入）（圖2）。為了得到精確的產(chǎn)物長度和序列信息，將II 型和NN 型PCR產(chǎn)物連接至克隆載體后進行測序，得出有插入的片段長度為827 bp，無插入的片段長度為600 bp，插入序列長度為227 bp，與Rooney 等[5]報道的純血馬SINE 插入序列和長度都相一致。

圖2 SINE 插入PCR 產(chǎn)物電泳圖

在原始伊犁馬中未檢測到SINE 插入多態(tài)性，均為NN 型個體。英純-伊犁馬中檢測到SINE 插入（I），頻率為0.43，有效等位基因數(shù)Ne 為1.959，說明2 個等位基因I（有插入）和N（無插入）均為有效等位基因。群體中II 型純合個體占7%，IN 型雜合個體占72%，NN 型純合個體占21%，基因雜合度He 為0.490，說明I 等位基因主要以雜合型分布。

表3 伊犁馬中MSTN 的SINE 插入基因型分布

2.3 伊犁馬中C 突變與SINE 插入的連鎖關系分析 C突變與I 突變組合在一起理論上會存在4 種單倍型：I-C、N-C、I-T 和N-T（圖3）。在原始伊犁馬中，C 突變頻率為0.07，沒有I 突變。個體的基因型只有NNCT（4）和NNTT（26）2 種形式，群體中只有N-C 和N-T 2 種單倍型，N-C 頻率僅為0.07（圖3）。英純-伊犁馬中檢測到IICC（5）、INCC（5）、INCT（50）、NNCT（2）和NNTT（14）5 種基因型。群體中有N-T（0.53）、I-C（0.43）和N-C（0.05）3 種單倍型，無I-T（圖3）。根據(jù)PLINK（v1.07）軟件的LD 分析，在雜交群體中SINE 插入與C 突變呈現(xiàn)較高連鎖（r2=0.83）。

圖3 MSTN 基因g.66493737T＞C 和SINE 插入組合模式圖及單倍型分布頻率

純血馬以及有純血馬血統(tǒng)的夸特馬中C 突變和SINE 插入呈現(xiàn)較高關聯(lián)，而在其他的步態(tài)品種或地方品種，如美洲的密蘇里狐快步馬、田納西走馬，歐洲的比利時馬、夏特蘭馬，亞洲的蒙古馬中，C 等位基因分布較低或無，且與SINE 插入并無連鎖關系[11]（表4）。

表4 不同馬群體中MSTN C 等位基因和SINE 插入頻率

3 討 論

馬屬動物不同物種以及家馬不同品種的MSTN基因比較研究發(fā)現(xiàn)，g.66493737T＞C SNP 位點的T 突變?yōu)橐吧屯蛔?，且現(xiàn)在的大部分家馬品種中都以野生型形式存在[11]。被稱為“速度基因”[5,12-13]的C 突變在18 世紀至19 世紀的純血馬中還是很稀少的。大約從20世紀開始，人們對賽馬的興趣從耐力轉(zhuǎn)向速度，之后便對純血馬的速度能力有了選擇，因而MSTN的C 突變逐漸在群體中積累。C 突變的來源可被追溯到上世紀50 年代的一匹純血種公馬Nearctic，并由它的一匹優(yōu)秀的種公馬后代北方舞者（Northern Dancer）得以廣泛傳播[14]。新近研究表明，在MSTN上游啟動子位置的一個SINE插入（I 突變）是真正引起“速度效應”的變異[5-6]。SINE 插入是廣泛存在于高等真核生物基因組內(nèi)的中等重復序列，占據(jù)了基因組的很大一部分，如在人類基因組中約占13.6%[15]。馬的基因組中也分布著SINE 插入，其長度為227 bp[16]。由于SINE 插入發(fā)生在MSTN基因的轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)域，導致MSTN基因表達水平顯著下降，使純血馬肌肉中快肌纖維比例增加[5,11,16]。

本研究分析發(fā)現(xiàn)，原始伊犁馬群體主要攜帶T 等位基因，C 等位基因分布頻率較低，且均為N-C 單倍型，表明原始伊犁馬的培育過程中沒有I-C 單倍型滲入，與其當時的培育目標和引入的種公馬品種有關。而在英純-伊犁馬群體中C 等位基因頻率為0.47，SINE 插入頻率為0.43，I-C 單倍型呈高度連鎖（r2=0.83），與純血馬的研究結(jié)果（SINE 插入0.48，C 突變0.50）較為接近[11]。根據(jù)品種間的對比分析，多個攜帶C 突變的騎乘馬品種中，并沒有SINE 插入，只有在純血馬和夸特馬2 個速度群體中發(fā)現(xiàn)了C 與I 的連鎖。這一現(xiàn)象似乎說明與C突變相比，SINE 插入突變可能更適合作為速度基因標記。

多態(tài)信息含量是評估群體遺傳多樣性和衡量等位基因片段多態(tài)性的理想指標，多態(tài)信息含量越大，該位點的多態(tài)性就越豐富，群體內(nèi)基因的變異性越高，選擇潛力就越大[17]。當PIC＞0.50 時，表示具有高度多態(tài)性；當0.25＜PIC＜0.50 時，表示具有中度多態(tài)性；當PIC＜0.25 時，表示具有低度多態(tài)性[18]。本研究的英純-伊犁馬MSTN基因SINE 插入的多態(tài)信息含量：PIC=0.370，屬于中度多態(tài)性，表明SINE 插入在英純-伊犁馬群體中的遺傳性很穩(wěn)定，群體內(nèi)基因的變異程度為中等，發(fā)生遺傳變異的可能性相對較小，具有較大的選擇遺傳潛力。

研究雖然已經(jīng)證明了MSTN基因與純血馬最佳比賽距離的關聯(lián)性，且目前已經(jīng)廣泛應用于預測純血馬的最適比賽距離[12-13]。但在英純-伊犁馬中，MSTN基因的C 突變和SINE 插入對速度能力的貢獻，以及在肌纖維組成和蛋白表達層面的作用還有待于進一步深入研究。

4 結(jié) 論

以攜帶第一內(nèi)含子C 突變?yōu)闃擞浀腗STN速度基因，在英純-伊犁馬雜交群體中的分布頻率達到47%，并與代表MSTN基因功能性變異的SINE 插入呈較高連鎖，r2=0.83；而在伊犁馬原始群體中C 突變頻率僅為7%，且與SINE 插入為0 連鎖。伊犁馬中速度基因頻率的提高為速度型伊犁馬選育打下了良好的遺傳多樣性基礎。