謝蘇夢(mèng)，季巧遇，呂 尚，張 堯，鄒瀚霖，汪 弟，饒 毅, ，魏惠珍, *

不同產(chǎn)地野菊花HPLC指紋圖譜建立及化學(xué)模式識(shí)別研究

謝蘇夢(mèng)1，季巧遇2，呂 尚1，張 堯3，鄒瀚霖1，汪 弟1，饒 毅1, 3，魏惠珍1, 3*

1. 江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004 2. 華潤(rùn)江中藥業(yè)技術(shù)中心，江西 南昌 330004 3. 中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，江西 南昌 330006

建立野菊花藥材HPLC指紋圖譜，并進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別。采用Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)334 nm；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL，建立野菊花藥材HPLC指紋圖譜，結(jié)合相似度評(píng)價(jià)、聚類分析、主成分分析和正交偏最小二乘-判別分析等模式識(shí)別方法，對(duì)不同產(chǎn)地野菊花藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。建立的指紋圖譜方法符合方法學(xué)要求，29批野菊花藥材HPLC指紋圖譜有10個(gè)共有峰，相似度均在0.91以上；通過(guò)聚類分析將樣品按不同產(chǎn)地分為2大類；主成分分析與聚類分析結(jié)果一致；最后采用正交偏最小二乘-判別分析篩選出了不同批次野菊花藥材的6個(gè)差異標(biāo)志物，通過(guò)對(duì)照品指認(rèn)，確定了10號(hào)峰為蒙花苷、5號(hào)峰為3,4-二咖啡?？鼘幩帷?號(hào)峰為木犀草苷、1號(hào)峰為綠原酸。建立的指紋圖譜方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好；結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別可用于野菊花藥材的質(zhì)量品質(zhì)評(píng)價(jià)。

野菊花；HPLC指紋圖譜；化學(xué)模式識(shí)別；聚類分析；主成分分析；正交偏最小二乘-判別分析；蒙花苷；3,4-二咖啡酰奎寧酸；犀草苷；綠原酸

野菊花為菊科植物野菊L.的干燥頭狀花序[1]。性微寒，味苦，歸心、肝經(jīng)，廣泛分布于我國(guó)東北、華北、華中、華東及西南地區(qū)，是臨床常用的清熱瀉火藥，具有疏散風(fēng)熱、消腫解毒的功效[2]。野菊花主要活性成分為黃酮類和酚酸類[3]，《中國(guó)藥典》2020年版的指標(biāo)成分為單一成分蒙花苷，而《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》第8期的指標(biāo)成分是綠原酸、3,5-二咖啡?？鼘幩?、4,5-二咖啡?？鼘幩?、木犀草苷。文獻(xiàn)報(bào)道[4-5]不同產(chǎn)地野菊花藥材中黃酮類、酚酸類成分含量差異較大。目前對(duì)野菊花質(zhì)量控制研究主要集中在指標(biāo)成分含量測(cè)定[5]、指紋圖譜分析中[6-7]，但多數(shù)是從方法學(xué)角度考察色譜條件，未能較直觀地反映出不同批次野菊花藥材的差異標(biāo)志物。

中藥指紋圖譜能系統(tǒng)反映出中藥各組分信息，廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制領(lǐng)域，但其數(shù)據(jù)量大，需要借助多種中藥指紋圖譜數(shù)據(jù)處理方法進(jìn)行深度、科學(xué)地分析[8]。目前多使用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件對(duì)獲得中藥色譜指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行快速匹配和識(shí)別，但該軟件不能多方面反映出藥材整體質(zhì)量，無(wú)法直觀反映出不同批次藥材的差異標(biāo)志物[9]。而化學(xué)模式識(shí)別方法通過(guò)分析實(shí)驗(yàn)獲得的大量數(shù)據(jù)，最大限度地提取有效化學(xué)信息，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析。在中藥指紋圖譜數(shù)據(jù)分析中應(yīng)用較多的化學(xué)模式識(shí)別方法包括聚類分析法、主成分分析法和偏最小二乘法[10]。采用指紋圖譜和化學(xué)模式識(shí)別相結(jié)合的方法，可以更加全面、科學(xué)、客觀地評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量，目前也越來(lái)越多地應(yīng)用于中藥材質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)領(lǐng)域[11-13]。因此，本研究采用HPLC法建立野菊花藥材指紋圖譜，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別方法對(duì)指紋圖譜進(jìn)行綜合分析，為野菊花藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SHIMADZU LC-20AT高效液相色譜儀；AB-104N萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；AUW-220D十萬(wàn)分之一電子分析天平（日本SHIMADZU公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q超純水器（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 材料

綠原酸（批號(hào)110753-201314）、咖啡酸（批號(hào)111720-201703）、木犀草苷（批號(hào)111720-201307）、3,5-二咖啡酰奎寧酸（批號(hào)111782-201807）、4,5-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)111894-201102）、蒙花苷（批號(hào)111528-201710），以上對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；3,4-二咖啡?？鼘幩釋?duì)照品（批號(hào)15101132）購(gòu)自成都康邦生物科技有限公司；所有對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。乙腈為色譜純（美國(guó)Anaqua安可化學(xué)）；水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水；其余試劑均為分析純。本實(shí)驗(yàn)搜集了湖北麻城、棗陽(yáng)、羅田；安徽金寨、廬江、桐城、霍山共7產(chǎn)地29批次的野菊花藥材，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)羅曉健教授鑒定為菊科植物野菊L.的干燥頭狀花序，樣品信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～5 min，85% B；5～25 min，85%～80% B；25～40 min，80%～70% B；40～50 min，70%～35% B；50～60 min，35% B）；檢測(cè)波長(zhǎng)：334 nm；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積10 μL。

表1 野菊花藥材樣品信息

2.2 供試品溶液的制備

取野菊花樣品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.5 g。精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、3,4-二咖啡酰奎寧酸、3,5-二咖啡?？鼘幩?、4,5-二咖啡?？鼘幩?、蒙花苷對(duì)照品適量，于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，制得各對(duì)照品母液；再精密吸取7種對(duì)照品母液適量，加50%甲醇稀釋，制得綠原酸為25.89 μg/mL、咖啡酸為20.14 μg/mL、木犀草苷為3.828 μg/mL、3,4-二咖啡?？鼘幩釣?1.32 μg/mL、3,5-二咖啡?？鼘幩釣?9.73 μg/mL、4,5-二咖啡?？鼘幩釣?.682 μg/mL、蒙花苷為24.66 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)下方法制備1份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以3.5-二咖啡酰奎寧酸（6號(hào)峰）為參照峰（S），計(jì)算10個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%[14]。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以3,5-二咖啡?？鼘幩幔?號(hào)峰）為參照峰（S），計(jì)算10個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%[14]，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h時(shí)進(jìn)樣，以3,5-二咖啡酰奎寧酸（6號(hào)峰）為參照峰（S），計(jì)算10個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%[14]。

2.5 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

將29批野菊花藥材按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，將29批色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.1版本）”軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)，設(shè)定S1樣品的圖譜為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.1，采用平均數(shù)法結(jié)合多點(diǎn)校正生成對(duì)照?qǐng)D譜，并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，29批野菊花藥材HPLC指紋圖譜及對(duì)照指紋圖譜見圖1、2。共標(biāo)定了10個(gè)共有峰，通過(guò)與對(duì)照品圖譜比對(duì)，指認(rèn)了其中7個(gè)色譜峰，見圖3，即峰1為綠原酸、峰2為咖啡酸、峰3為木犀草苷、峰5為3,4-二咖啡?？鼘幩?、峰6為3,5-二咖啡?？鼘幩?、峰8為4,5-二咖啡酰奎寧酸、峰10為蒙花苷。峰6出峰時(shí)間居中、峰面積較大且分離度良好，故選擇3.5-二咖啡?？鼘幩幔?號(hào)峰）為參照峰（S），計(jì)算樣品指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.50%，表明這29批樣品中10個(gè)共有峰保留時(shí)間較穩(wěn)定；但共有峰相對(duì)峰面積RSD為24.50%～89.08%，相差較大，表明各批次間這10個(gè)共有峰所代表化合物的含量存在較大差異。以對(duì)照指紋圖譜為對(duì)照，計(jì)算各批次樣品相似度，結(jié)果見表2，29批樣品相似度均大于0.91。

圖1 29批野菊花藥材的HPLC指紋圖譜

圖2 野菊花藥材的對(duì)照指紋圖譜

1-綠原酸 2-咖啡酸 3-木犀草苷 5-3,4-二咖啡?？鼘幩?6-3,5-二咖啡?？鼘幩?8-4,5-二咖啡?？鼘幩?10-蒙花苷

表2 29批野菊花藥材相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.6 化學(xué)模式識(shí)別分析

2.6.1 聚類分析（clustering analysis，CA） 利用SPSS 22.0軟件，以野菊花HPLC指紋圖譜的10個(gè)共有峰的峰面積為變量，采用組間聯(lián)接的聚類方法，以平方歐式距離為樣品間距離進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4，各批次野菊花樣品主要分為2大類、6小類：S1～S5、S21-S23、S11～S15、聚為一大類（I組），產(chǎn)地均為湖北, 其中S1～S5聚為一小類（Ia組）產(chǎn)地為湖北麻城、S21～23聚為一小類（Ib組）產(chǎn)地為湖北羅田、S11～S15聚為一小類（Ic組）產(chǎn)地為湖北棗陽(yáng)；S24～S26、S16-S20、S6～S10、S27～S29聚為一大類（II組），產(chǎn)地均為安徽，其中S24～S26聚為一小類（IIa組）產(chǎn)地為安徽桐城、S16-20聚為一小類（IIb組）產(chǎn)地為安徽廬江、S6～S10、S27～S29聚為一小類（IIc組）產(chǎn)地為安徽金寨和安徽霍山，考慮這2個(gè)產(chǎn)地均為安徽省六安市，野菊花藥材差異較小，故分為一類。

圖4 29批野菊花藥材聚類分析樹狀圖

2.6.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 用SPSS 22.0軟件對(duì)各共有峰峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，對(duì)29批野菊花藥材指紋圖譜所得的10個(gè)共有峰進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見表3，以特征值＞1為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到2個(gè)主成分（1、2），其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為85.769%，可代表野菊花指紋圖譜共有峰的大部分信息。旋轉(zhuǎn)后的主成分載荷矩陣反映了各變量對(duì)主成分的貢獻(xiàn)大小和方向，載荷的絕對(duì)值越大，對(duì)主成分的貢獻(xiàn)越大[15]，主成分載荷矩陣見圖5，較直觀反映出各變量對(duì)主成分的貢獻(xiàn)率：10個(gè)共有峰對(duì)第1主成分多成正相關(guān)，共有峰4、10、9、5、3對(duì)第1主成分貢獻(xiàn)較大；共有峰6、8、1、9對(duì)第2主成分貢獻(xiàn)較大，共有峰2、3、7對(duì)第2主成分成負(fù)相關(guān)。再根據(jù)主成分載荷矩陣，計(jì)算主成分得分，2個(gè)主成分得分表達(dá)式：1＝0.3021＋0.2672＋0.3523＋0.4224＋0.3645－0.0126＋0.2897＋0.2328－0.3509－0.37910；2＝0.3791－0.1512－0.1223＋0.1384＋0.3055＋0.5186－0.3497＋0.4198＋0.2929＋0.23310。通過(guò)將各特征向量標(biāo)準(zhǔn)化后，代入主成分得分表達(dá)式中計(jì)算29批樣品的主成分得分。再根據(jù)各主成分的貢獻(xiàn)率，計(jì)算出綜合得分，其公式為綜＝0.4931＋0.3642，主成分得分和綜合得分結(jié)果見表4，可反映S1～S5、S21～S23、S11～S15批次樣品綜合得分幾乎均為正值，將該13批湖北樣品聚為一類；S24～S26、S16～S20、S6～S10、S27～S29批次樣品綜合得分均為負(fù)值，因此將該16批安徽樣品聚為一類，這與聚類分析結(jié)果完全一致。根據(jù)綜合得分＝相應(yīng)的因子得分×相應(yīng)主成分的特征值的平方根，綜合得分越高，表明峰面積相對(duì)越大，藥材含量相對(duì)越高[16]，可知：S1～S5、S21～S23、S11～S15批次樣品綜合得分排名靠前，S24～S26、S16～S20、S6～S10、S27～S29批次樣品排名靠后，從主成分分析及綜合得分角度來(lái)看，本研究中湖北產(chǎn)地野菊花藥材含量相對(duì)優(yōu)于安徽產(chǎn)地。

表3 特征值及累積方差貢獻(xiàn)率

圖5 10個(gè)共有峰2個(gè)主成分的排序坐標(biāo)圖

用變量統(tǒng)計(jì)分析軟件（SIMAC14.1）對(duì)29批野菊花樣品進(jìn)行主成分分析，變量為指紋圖譜中所得到的共有峰的相對(duì)峰面積，以此構(gòu)建29×10的原始數(shù)據(jù)矩陣，Par作為標(biāo)度化方式，繪制出主成分分析圖，見圖6-A，原點(diǎn)左側(cè)為安徽產(chǎn)地，右側(cè)為湖北產(chǎn)地，不同批次的野菊花樣品呈現(xiàn)較明顯的分類，與聚類分析的結(jié)果一致。

表4 主成分得分和綜合得分

2.6.3 正交偏最小二乘-判別分析（partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA） 為了進(jìn)一步尋找不同批次野菊花的差異標(biāo)志物，采用SIMAC 14.1軟件對(duì)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA分析，將29批樣品的10個(gè)共有峰導(dǎo)入SIMAC 14.1軟件中，建立OPLS-DA模型，模型得分圖見圖6-B，湖北與安徽產(chǎn)地野菊花分布在中線兩側(cè)，表明29批野菊花樣品被較好地分為2類，由模型分析驗(yàn)證參數(shù)可知，結(jié)實(shí)率參數(shù)2為1，區(qū)分參數(shù)2為0.96，預(yù)測(cè)參數(shù)2為0.903，均大于0.5且接近于1，說(shuō)明模型穩(wěn)定且具有良好的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。為防止該模型過(guò)擬合造成假陽(yáng)性結(jié)果，設(shè)置分類矩陣變量隨機(jī)排列200次做置換檢驗(yàn)，得置換檢驗(yàn)圖7-A，2回歸線在軸截距為0.27、2回歸線在軸截距為?0.943，說(shuō)明所建立的模型沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)擬合現(xiàn)象，可用于判別分析29批樣品的組間差異。OPLS-DA模型中變量重要性投影值（variable Importance for the projection，VIP值）可直觀反映出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異標(biāo)志物，結(jié)果見圖7-B，在95%置信區(qū)間內(nèi)，篩選出VIP＞1.0的色譜峰為差異標(biāo)志物，并通過(guò)對(duì)照品指認(rèn)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的6個(gè)差異標(biāo)志物的影響程度依次為4號(hào)峰＞10號(hào)峰（蒙花苷）＞5號(hào)峰（3,4-二咖啡?？鼘幩幔?號(hào)峰（木犀草苷）＞9號(hào)峰＞1號(hào)峰（綠原酸）。計(jì)算差異標(biāo)志物峰面積占共有峰峰面積占比，可知29批樣品的差異標(biāo)志物中蒙花苷平均占比最高，為32.37%，綠原酸占比其次，為13.03%，且這些成分RSD均大于21.27%，表明這些成分在各批次間含量差異較大。

圖6 PCA(A)和OPLS-DA (B) 得分散點(diǎn)圖

圖7 OPLS-DA置換檢驗(yàn)圖(A) 和29批樣品各成分VIP圖(B)

根據(jù)以下文獻(xiàn)可知，以上這些成分同樣是野菊花的活性成分。張金杰等[17]采用微量肉湯稀釋法發(fā)現(xiàn)野菊花總黃酮及蒙花苷單體對(duì)葡萄牙假絲酵母的體外抗菌活性較好。許韓婷等[18]發(fā)現(xiàn)蒙花苷可通過(guò)抑制NF-κB及其相關(guān)信號(hào)通路的活化來(lái)減少炎性黏附和炎性因子分泌，從而緩解脂多糖引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷，發(fā)揮抗炎藥理活性。戴勝[19]采用HSC細(xì)胞對(duì)化合物進(jìn)行四甲基偶氮唑鹽比色法保肝活性篩選，發(fā)現(xiàn)3,4-二咖啡?？鼘幩峄钚暂^為突出。趙晶晶[20]應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽比色法和細(xì)胞病變法2種方法對(duì)木犀草苷等黃酮類化合物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)木犀草苷具有體外抗巨細(xì)胞病毒體作用，Shan等[21]發(fā)現(xiàn)綠原酸通過(guò)減弱核因子κB和JNK/AP-1信號(hào)通路活化來(lái)抑制脂多糖誘導(dǎo)的環(huán)氧化酶-2表達(dá)，抑制前列腺素E2的生成來(lái)起到抗炎作用。

綜上可知，結(jié)合OPLS-DA中VIP值篩選、對(duì)照品指認(rèn)及相關(guān)藥效學(xué)文獻(xiàn)，說(shuō)明蒙花苷、3，4-二咖啡?？鼘幩?、木犀草苷、綠原酸可作為野菊花藥材的差異標(biāo)志物。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法考察和色譜條件優(yōu)化

本研究考察了不同提取溶劑（30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇和乙醇）、不同提取方式（回流、超聲）、不同提取時(shí)間（20、30、40 min）對(duì)野菊花藥材指紋圖譜色譜圖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：50%甲醇提取的色譜峰較多，超聲和回流提取無(wú)明顯差異，不同提取時(shí)間也無(wú)明顯差異，故選擇50%甲醇超聲提取30 min為最優(yōu)提取方法。

通過(guò)考察甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相體系進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸作為流動(dòng)相，各色譜峰分離度較好，峰型較佳，基線較平穩(wěn)；通過(guò)在190～400 nm全波長(zhǎng)掃描，比較各波長(zhǎng)色譜圖，發(fā)現(xiàn)在334 nm處色譜峰響應(yīng)值最佳，故選擇334 nm作為野菊花藥材指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 共有峰確定

本研究建立的野菊花藥材HPLC指紋圖譜方法確定了10個(gè)共有峰，共有峰峰面積占比85%以上，能較好地代表野菊花整體質(zhì)量；通過(guò)對(duì)照品指認(rèn)，確定了7個(gè)化合物，分別綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、3,4-二咖啡?？鼘幩帷?,5-二咖啡?？鼘幩?、4,5-二咖啡?？鼘幩帷⒚苫ㄜ?，與陳寧等[6,22]研究結(jié)果基本一致。因此本研究所建立的指紋圖譜能較全面反映野菊花所包含的化學(xué)信息，為日后野菊花中該類成分定量研究奠定基礎(chǔ)，為其質(zhì)量控制提供參考。

3.3 野菊花分類及差異標(biāo)志物篩選

前期對(duì)指紋圖譜數(shù)據(jù)處理通常是采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件，而使用化學(xué)模式識(shí)別結(jié)合指紋圖譜的方法正越來(lái)越多地應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)領(lǐng)域[23-25]，可目前有關(guān)野菊花指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別的研究相對(duì)較少，本研究通過(guò)采用指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別方法，通過(guò)聚類分析、主成分分析、最小偏二乘-判別分析這三種主要的化學(xué)模式識(shí)別方法，對(duì)不同產(chǎn)地野菊花指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，研究顯示，聚類分析、主成分分析結(jié)果一致，都將不同產(chǎn)地樣品聚為一類，且根據(jù)綜合得分排序可知，本研究中湖北產(chǎn)地野菊花得分靠前，與韓正洲[4]結(jié)論一致；最后用SIMAC軟件進(jìn)行PCA分類，采用OPLS-DA模型中VIP值篩選出6個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異標(biāo)志物，并通過(guò)對(duì)照品指認(rèn)出影響較大的化學(xué)成分，其余未知色譜峰可通過(guò)液相-質(zhì)譜聯(lián)用等手段進(jìn)一步確定。通過(guò)比較差異標(biāo)志物峰面積占共有峰峰面積占比，可初步得知蒙花苷、3,4-二咖啡?？鼘幩?、木犀草苷、綠原酸等成分在各批次間含量差異較大，且《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》第8期中野菊花指標(biāo)成分為綠原酸、3,5-二咖啡?？鼘幩?、4,5-二咖啡?？鼘幩?、木犀草苷，表明在對(duì)野菊花的質(zhì)量控制研究中不能僅關(guān)注蒙花苷的質(zhì)量變化，還應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注上述其他成分的質(zhì)量變化。

綜上，本實(shí)驗(yàn)采用指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別的方法對(duì)不同產(chǎn)地野菊花藥材進(jìn)行綜合分析，對(duì)不同產(chǎn)地野菊花藥材進(jìn)行聚類分析、主成分分析及綜合評(píng)分，采用OPLS-DA快速篩選出了不同產(chǎn)地野菊花的差異標(biāo)志物，為評(píng)價(jià)野菊花藥材的質(zhì)量及品質(zhì)提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國(guó)藥典[S]. 一部. 2020: 126.

[2] 樊高潔, 李淑敏,張珊, 等. 野菊花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J]. 中草藥, 2017, 48(19): 4073-4076.

[3] 吳雪松, 許浚, 張鐵軍, 等. 野菊的化學(xué)成分及質(zhì)量評(píng)價(jià)研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2015, 46(3): 443-452.

[4] 韓正洲. 野菊資源研究與野菊花藥材品質(zhì)評(píng)價(jià) [D]. 廣州: 廣州中醫(yī)藥大學(xué), 2017.

[5] 張麗先, 范毅, 魏悅, 等. 一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定野菊花中12個(gè)成分 [J]. 藥物分析雜志, 2020, 40(2): 218-226.

[6] 陳寧, 韓永成, 劉偉, 等. 野菊花的UPLC指紋圖譜研究 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2014, 20(3): 83-85.

[7] 鄭繼標(biāo), 楊紅梅, 黃春華, 等. 野菊花不同部位蒙花苷含量測(cè)定及HPLC指紋圖譜研究 [J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2019, 15(6): 39-41.

[8] 張艷欣, 吳佩穎, 王丹丹. 中藥指紋圖譜中常用的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法 [J]. 上海醫(yī)藥, 2019, 40(9): 74-77.

[9] 鄒純才, 鄢海燕. 我國(guó)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)方法30年(1988—2017年)研究進(jìn)展與展望 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2018, 43(10): 1969-1977.

[10] 趙娟, 謝世靜, 趙興華, 等. 中藥指紋圖譜質(zhì)控方法研究進(jìn)展 [J]. 云南中醫(yī)中藥雜志, 2020, 41(1): 82-86.

[11] 邱俊娜, 張榆, 張雙, 等. 基于HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別及定量測(cè)定的夏枯草質(zhì)量控制研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(10): 2842-2850.

[12] 楊玉瑩, 張丹丹, 羅心遙, 等. 指紋圖譜及多成分定量結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別法評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地青錢柳質(zhì)量 [J]. 中草藥, 2020, 51(4): 1082-1088.

[13] 李士敏, 李強(qiáng), 孫崇魯, 等. 基于多模式識(shí)別結(jié)合指紋圖譜的三葉青產(chǎn)地鑒別比較研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(1): 197-203.

[14] 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局. 中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行) [J]. 中成藥, 2000, 22(10): 23-29.

[15] 邱俊娜, 張榆, 張雙, 等. 基于HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別及定量測(cè)定的夏枯草質(zhì)量控制研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(10): 2842-2850.

[16] 朱星宇, 陳勇強(qiáng). SPSS多元統(tǒng)計(jì)分析方法及應(yīng)用[M]. 北京: 清華大學(xué)出版社, 2011.

[17] 張金杰, 呂文文, 翁遠(yuǎn)超, 等. 野菊花中黃酮類成分的抗菌活性及指紋圖譜 [J]. 國(guó)際藥學(xué)研究雜志, 2013, 40(6): 807-812.

[18] 許韓婷, 蘇潔, 吳亞軍, 等. 蒙花苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷的影響 [J]. 中藥藥理與臨床, 2016, 32(1): 29-32.

[19] 戴勝. 野菊花保肝活性成分的分離、鑒定及初步分析 [D]. 合肥: 安徽醫(yī)科大學(xué), 2013.

[20] 趙晶晶. 中藥有效成分抗豚鼠巨細(xì)胞病毒體外實(shí)驗(yàn)研究 [D]. 武漢: 華中科技大學(xué), 2011.

[21] Shan J H, Fu J, Zhao Z H,. Chlorogenic acid inhibits lipopolysaccharide-induced cyclooxygenase-2 expression in RAW264.7cells through suppressing NF-kappaB and JNK/AP-1 activation [J]., 2009, 9(9): 1042-1048.

[22] 史紫娟, 林碧珊, 曾杉, 等. 野菊花藥材與菊花藥材特征圖譜的比較 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2020, 22(9): 1511-1513.

[23] 楊琳, 李廷利. 基于HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別的護(hù)肝片質(zhì)量控制研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(14): 3351-3356.

[24] 張麗先, 李自紅, 宋夢(mèng)嬌, 等. 基于指紋圖譜、模式識(shí)別及多成分同時(shí)定量的野菊花質(zhì)量評(píng)價(jià)研究 [J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2020, 55(3): 183-188.

[25] 孫巖, 吳晨光, 韓群, 等. HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別評(píng)價(jià)祖師麻注射液的整體質(zhì)量 [J]. 中草藥, 2020, 51(8): 2170-2176.

Study on establishment of HPLC fingerprints and chemical pattern recognition offrom different regions

XIE Su-meng1, JI Qiao-yu2, LV Shang1, ZHANG Yao3, ZOU Han-lin1, WANG Di1, RAO Yi1,3, WEI Hui-zhen1,3

1. Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China 2. China Resources Jiangzhong Pharmaceutical Technology Center, Nanchang 330004, China 3. National Engineering Research Center for Manufacturing Technology of Traditional Chinese Medicine Solid Preparation, Nanchang 330006, China

To establish an HPLC fingerprint ofmedicinal materials and perform chemical pattern recognition.Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm) chromatographic column was used; Mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid, gradient elution; Detection wavelength was 334 nm; Flow rate was 1 mL/min; Column temperature was 30 ℃; Injection volume was 10 μL. HPLC fingerprints ofmedicinal materials was established, combined with similarity evaluation, cluster analysis, principal component analysis and orthogonal partial least squares-discriminant analysis and other pattern recognition methods, quality evaluation ofmedicinal materials from different places.The established fingerprint method met the method requirements. The 29 batches ofmedicinal materials had 10 common peaks in the HPLC fingerprint, and the similarity was all above 0.91; The samples were divided into two categories according to different origins through cluster analysis; The results of principal component analysis and cluster analysis were consistent; Finally, the orthogonal partial least squares-discriminant analysis was used to screen out six different markers of different batches of wild chrysanthemum medicinal materials. Through the identification of the reference substance, it was determined that peak 10 was montmorrin and peak 5 was 3,4-dicaffeoylquinic acid, peak 3 was luteolin, peak 1 was chlorogenic acid.The established fingerprint method is stable, reliable, and reproducible; Combined with chemical pattern recognition, it can be used for the quality evaluation ofmedicinal materials.

L.; HPLC fingerprint; chemical pattern recognition; cluster analysis; principal component analysis; orthogonal partial least squares-discri-minant analysis; montmorrin; 3,4-dicaffeoylquinic acid; luteolin; chlorogenic acid

R286.2

A

0253 - 2670(2021)24 - 7616 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.24.024

2021-05-06

江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)一流學(xué)科專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（5251800280）；2019年度江西省中醫(yī)藥管理局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2019A005）

謝蘇夢(mèng)（1995—），在讀碩士，從事藥物質(zhì)量控制研究。Tel: 18379973259

魏惠珍，碩士生導(dǎo)師，副主任藥師，從事藥物質(zhì)量控制研究和新藥研發(fā)。Tel: 13870939636 E-mail: weihuizhen101@126.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]