陳 丹，胡浚偉，李紅葉，馮 斌

連翹提取物調(diào)控miR-223-3p對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞損傷的影響

陳 丹1，胡浚偉2，李紅葉1，馮 斌3*

1. 駐馬店市中心醫(yī)院 兒內(nèi)一科，河南 駐馬店 463000 2. 黃淮學(xué)院醫(yī)學(xué)院 內(nèi)科教研室，河南 駐馬店 463000 3. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附院醫(yī)院 兒科，河南 鄭州 450000

探討連翹提取物對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞A549損傷的影響及其可能作用機(jī)制。采用肺炎鏈球菌感染肺泡上皮細(xì)胞A549建立細(xì)胞損傷模型，不同劑量的連翹提取物處理細(xì)胞；微小RNA-223-3p（micro RNA-223-3p，miR-223-3p）特異性寡核苷酸抑制劑（anti-miR-223-3p）及其陰性對照序列（anti-miR-NC）分別轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞后用肺炎鏈球菌培養(yǎng)細(xì)胞；miR-223-3p寡核苷酸模擬物（miR-223-3p mimics）轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞后用連翹提取物處理細(xì)胞，然后用肺炎鏈球菌培養(yǎng)細(xì)胞。MTT、流式細(xì)胞術(shù)分別檢測細(xì)胞增殖與凋亡能力；ELISA法檢測白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、γ干擾素（interferon γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）的水平；qRT-PCR法檢測的表達(dá)量；Western blotting法檢測活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteinyl aspartate-specific protease-3，cleaved Caspase-3）蛋白表達(dá)量。連翹提取物能夠以劑量相關(guān)方式增強(qiáng)肺炎鏈球菌感染的A549細(xì)胞活力（＜0.05），升高IL-10水平（＜0.05），降低細(xì)胞凋亡率和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平（＜0.05），還可降低的表達(dá)量和IL-6、INF-γ、TNF-α的水平（＜0.05）；轉(zhuǎn)染anti-miR-223-3p后感染肺炎鏈球菌的A549細(xì)胞活力和IL-10的水平升高（＜0.05），細(xì)胞凋亡率和cleaved Caspase-3蛋白水平降低（＜0.05），IL-6、INF-γ、TNF-α的水平降低（＜0.05）；轉(zhuǎn)染miR-223-3p mimics可逆轉(zhuǎn)連翹提取物對肺炎鏈球菌感染的A549細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)的作用。連翹提取物可能通過抑制的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)從而減輕肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞損傷。

連翹提取物；肺炎鏈球菌；肺泡上皮細(xì)胞A549；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

肺炎鏈球菌屬于革蘭陽性雙球菌，其定植于人體上呼吸道，一旦人體免疫力降低或合并病毒感染時，肺炎鏈球菌會引起敗血癥、肺炎等疾病。我國肺炎鏈球菌肺炎死亡率逐年上升，已嚴(yán)重降低患者生活質(zhì)量，目前臨床常選用抗生素治療肺炎鏈球菌肺炎，但部分患者已產(chǎn)生抗生素耐藥性，因而研發(fā)非抗生素類藥物治療肺炎鏈球菌肺炎具有重要意義[1-4]。連翹屬于木犀科植物連翹(Thunb.) Vahl 的干燥果實(shí)，其具有抗菌、抗炎等作用，且具有抗肺炎克雷伯菌的作用，還可減少過度使用抗生素對患者造成的副作用，而連翹提取物是從連翹中提取的主要活性組分，其具有抗炎、抗腫瘤等作用[5]。但連翹提取物與肺炎鏈球菌肺炎的相關(guān)研究尚未見報道。微小RNA（miRNA）可通過調(diào)控靶mRNA表達(dá)而參與多種疾病發(fā)生發(fā)展過程，并可能作為治療的潛在靶點(diǎn)，研究表明微小RNA-223-3p（micro RNA-223-3p，miR-223-3p）在肺炎繼發(fā)敗血癥患者中表達(dá)水平升高，并可能作為診斷該疾病的潛在生物學(xué)標(biāo)記物[6]。但miR-223-3p在肺炎鏈球菌肺炎中的表達(dá)及其可能作用機(jī)制尚未闡明。因此，本研究采用肺炎鏈球菌感染肺泡上皮細(xì)胞A549建立細(xì)胞損傷模型，探討連翹提取物是否可通過調(diào)控miR-223-3p表達(dá)而減緩肺炎鏈球菌肺炎的發(fā)展進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 試劑

連翹提取物（質(zhì)量濃度為1000 g/L）購自天津美倫醫(yī)藥集團(tuán)有限公司（批號20190203），連翹提取物倍比稀釋成3、6、12 μg/mL的給藥藥液；頭孢羥氨芐購自清遠(yuǎn)華能制藥有限公司（批號171003）；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司（批號20180206）；胎牛血清購自美國Gibco公司（批號20181203）；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen（批號20171212）；miRNA提取試劑盒購自美國Thermo Fisher公司（批號20180203）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號20180506）與qRT-PCR試劑（批號20180204）購自北京天根生化科技有限公司；miR-223-3p特異性寡核苷酸抑制劑（anti-miR-223-3p）及其陰性對照序列（anti-miR-NC）、miR-223-3p寡核苷酸模擬物（miR-223-3p mimics）購自廣州銳博生物公司；白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、γ干擾素（interferon γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物公司（批號分別為20180302、20180506、20180701、20180603）；兔抗人活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteinyl aspartate-specific protease-3，cleaved Caspase-3）單克隆抗體（批號20180509）與二抗（批號20180604）購自美國Abcam公司。StepOnePlus實(shí)時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.2 細(xì)胞

肺泡上皮細(xì)胞A549與肺炎鏈球菌株購自美國ATCC公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

A549細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)并消化傳代。肺炎鏈球菌株培養(yǎng)于含有5%脫纖維羊血的血平板中，實(shí)驗(yàn)開始前置于含有0.5%酵母的托休二氏溶液中培養(yǎng)過夜。A549細(xì)胞分為對照組，模型組，連翹提取物低、中、高劑量（3、6、12 μg/mL）組，anti-miR-NC組，anti-miR-223-3p組，miR-223-3p組，連翹提取物＋miR-223-3p組，頭孢羥氨芐（陽性對照）組。對照組：A549細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。模型組：當(dāng)A549細(xì)胞生長融合度達(dá)到90%時用1×108CFU/mL的肺炎鏈球菌培養(yǎng)細(xì)胞[7]。連翹提取物低、中、高劑量組：A549細(xì)胞先分別加入含有不同質(zhì)量濃度（3、6、12 μg/mL）連翹提取物的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h[8]，收集細(xì)胞后用1×108CFU/mL的肺炎鏈球菌培養(yǎng)細(xì)胞。anti-miR-NC組、anti-miR-223-3p組、miR-223-3p組：anti-miR-NC（0.5 μmol/L）、anti-miR-223-3p（0.5 μmol/L）、miR-223-3p mimics（0.5 μmol/L）分別轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞培養(yǎng)48 h，然后用1×108CFU/mL的肺炎鏈球菌培養(yǎng)細(xì)胞。連翹提取物＋miR-223-3p組：miR-223-3p mimics轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞6 h后加入含有12 μg/mL連翹提取物的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞后用1×108CFU/mL的肺炎鏈球菌培養(yǎng)。頭孢羥氨芐（陽性對照）組：A549細(xì)胞加入含有12 μg/mL頭孢羥氨芐的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞后用1×108CFU/mL的肺炎鏈球菌培養(yǎng)細(xì)胞。

1.4 MTT檢測細(xì)胞增殖

收集各組A549細(xì)胞按照每孔4×103個接種于96孔板，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后每孔加入MTT溶液20 μL，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入150 μL DMSO，室溫避光孵育5 min，用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度（）。每組設(shè)置3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次（＝9）。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

收集各組A549細(xì)胞后用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，3000 r/min離心5 min后棄上清，收集細(xì)胞沉淀，然后加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞（2.5×105個/mL），取100 μL細(xì)胞懸液加入5 μL Annexin V-FITC后室溫避光孵育5 min，然后加入5 μL PI充分混勻，避光染色10 min，于1 h內(nèi)上機(jī)（FACS Calibur流式細(xì)胞儀）檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6 ELISA法檢測IL-6、INF-γ、TNF-α、IL-10水平

收集各組A549細(xì)胞培養(yǎng)液，采用ELISA法檢測IL-6、INF-γ、TNF-α、IL-10的水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.7 qRT-PCR檢測miR-223-3p的表達(dá)水平

利用miRNA提取試劑盒提取各組A549細(xì)胞總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄體系：5×gDNA Buffer 2 μL，10×King RT Buffer 2 μL，F(xiàn)astKing RT Enzyme Mix 1 μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μL，RNA 2 μg，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至20 μL。反應(yīng)條件：42 ℃、15 min，95 ℃、3 min。RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，cDNA 2 μL進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，根據(jù)試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共36次循環(huán)。以為內(nèi)參基因，應(yīng)用ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀檢測相對表達(dá)量。正向引物5’-AGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCG- 3’，反向引物5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.8 Western blotting檢測cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量

收集各組A549細(xì)胞后加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，利用BCA試劑盒對蛋白進(jìn)行定量，取適量蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），分離蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫封閉2 h后用TBST洗滌，分別加入cleaved Caspase-3（1︰1000）、糖酵解酶3-磷酸甘油醛脫氫酶（glycolytic enzyme 3-phosphoglyceraldehyde dehydrogenase，GAPDH）（1︰2000）抗體稀釋液后4 ℃孵育過夜，加入二抗（1︰3000）稀釋液室溫孵育1 h，滴加ECL顯影后用Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 連翹提取物對肺炎鏈球菌感染A549細(xì)胞的細(xì)胞活性和凋亡及cleaved Caspase-3蛋白水平的影響

與對照組比較，模型組細(xì)胞活力降低（＜0.05），細(xì)胞凋亡率和cleaved Caspase-3蛋白水平升高（＜0.05）；與模型組比較，連翹提取物各劑量組細(xì)胞活力升高（＜0.05），凋亡率和cleaved Caspase-3蛋白水平降低（＜0.05），且不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），頭孢羥氨芐組與連翹提取物12 μg/mL組各指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1和表1。

圖1 連翹提取物對A549細(xì)胞凋亡和cleaved Caspase-3蛋白水平的影響

表1 連翹提取物對A549細(xì)胞活性和凋亡及cleaved Caspase-3蛋白水平的影響(，n＝9)

與對照組比較：a＜0.05；與模型組比較：b＜0.05；與連翹提取物3 μg·mL?1組比較：c＜0.05；與連翹提取物6 μg·mL?1組比較：d＜0.05，表2、3同

a< 0.05control group;b< 0.05model group;c< 0.053 μg·mL?1extract group;d< 0.056 μg·mL?1extract group, same as tables 2 and 3

2.2 連翹提取物對肺炎鏈球菌感染的A549細(xì)胞中炎癥因子的影響

與對照組比較，模型組IL-6、INF-γ、TNF-α的水平升高（＜0.05），IL-10的水平降低（＜0.05）；與模型組比較，連翹提取物各劑量組IL-6、INF-γ、TNF-α的水平降低（＜0.05），IL-10的水平升高（＜0.05），且不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），頭孢羥氨芐組與連翹提取物12 μg/mL組各指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

2.3 連翹提取物對肺炎鏈球菌感染的A549細(xì)胞中miR-223-3p表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組細(xì)胞的表達(dá)量明顯升高（＜0.05）；與模型組比較，連翹提取物各劑量組的表達(dá)量明顯降低（＜0.05），且不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），頭孢羥氨芐組與連翹提取物12 μg/mL組各指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表2 連翹提取物對A549細(xì)胞IL-6、INF-γ、TNF-α、IL-10水平的影響(，n＝9)

2.4 抑制miR-223-3p表達(dá)對肺炎鏈球菌感染的A549細(xì)胞的細(xì)胞活性、凋亡及cleaved Caspase-3蛋白和炎癥因子水平的影響

與模型組、anti-miR-NC組比較，anti-miR-223-3p組細(xì)胞活力升高（＜0.05），細(xì)胞凋亡率和cleaved Caspase-3蛋白水平明顯降低（＜0.05），IL-6、INF-γ、TNF-α水平明顯降低（＜0.05），IL-10的水平明顯升高（＜0.05），見圖2和表4。

表3 連翹提取物對A549細(xì)胞中miR-223-3p表達(dá)量的影響(，n＝9)

2.5 過表達(dá)miR-223-3p對連翹提取物作用于肺炎鏈球菌感染A549細(xì)胞的細(xì)胞活性和凋亡及cleaved Caspase-3蛋白水平的影響

與模型組比較，miR-223-3p組細(xì)胞活力明顯降低（＜0.05），細(xì)胞凋亡率和cleaved Caspase-3蛋白水平明顯升高（＜0.05）；與連翹提取物12 μg/mL組比較，連翹提取物＋miR-223-3p組細(xì)胞活力明顯降低（＜0.05），細(xì)胞凋亡率和cleaved Caspase-3蛋白水平明顯升高（＜0.05），見圖3和表5。

2.6 過表達(dá)miR-223-3p對連翹提取物作用于肺炎鏈球菌感染的A549細(xì)胞中炎癥因子的影響

與模型組比較，miR-223-3p組細(xì)胞IL-6、INF-γ、TNF-α的水平升高（＜0.05），IL-10的水平降低（＜0.05）；與連翹提取物12 μg/mL組比較，連翹提取物＋miR-223-3p組IL-6、INF-γ、TNF-α的水平升高（＜0.05），IL-10的水平降低（＜0.05），見表6。

圖2 抑制miR-223-3p表達(dá)對A549細(xì)胞凋亡及cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量的影響

表4 抑制miR-223-3p表達(dá)對A549細(xì)胞活性、凋亡及cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量和IL-6、INF-γ、TNF-α、IL-10水平的影響(，n＝9)

與模型組比較：a＜0.05；與anti-miR-NC組比較：b＜0.05

a< 0.05model group;b< 0.05anti-miR-NC group

圖3 過表達(dá)miR-223-3p逆轉(zhuǎn)連翹提取物對A549細(xì)胞凋亡及cleaved Caspase-3蛋白水平的作用

表5 過表達(dá)miR-223-3p逆轉(zhuǎn)連翹提取物對A549細(xì)胞活性、凋亡及cleaved Caspase-3蛋白水平的作用(，n＝9)

與模型組比較：a＜0.05；與連翹提取物12 μg·mL?1組比較：b＜0.05，表6同

a< 0.05model group;b< 0.0512 μg·mL?1extract group, same as table 6

3 討論

肺炎鏈球菌肺炎患者對抗生素產(chǎn)生耐藥性可降低治療效果，目前肺炎鏈球菌致病機(jī)制尚未完全闡明，因而其致病機(jī)制及研發(fā)新型藥物成為研究重點(diǎn)，miRNA在肺泡上皮細(xì)胞損傷中表達(dá)異常，并可通過調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡等生物學(xué)行為而參與肺炎發(fā)生發(fā)展過程[9-11]。但miRNA是否可作為中藥治療肺炎鏈球菌肺炎的潛在靶點(diǎn)尚需進(jìn)一步探究。

連翹提取物具有抗流感病毒作用，并可用于治療流感病毒肺炎[12]。連翹提取物主要抗炎活性成分為連翹酯苷A，并可抑制上呼吸道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)[13]。本研究結(jié)果顯示，肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞活力降低，而連翹提取物能夠以劑量相關(guān)的方式增強(qiáng)細(xì)胞活力，提示連翹提取物可促進(jìn)肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞增殖。Caspase-3是細(xì)胞凋亡執(zhí)行因子，其被激活后可形成cleaved Caspase-3，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。本研究結(jié)果顯示，肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞凋亡率和cleaved Caspase-3蛋白水平升高，而連翹提取物可降低細(xì)胞凋亡率和cleaved Caspase-3蛋白水平，且呈劑量相關(guān)性，提示連翹提取物可抑制肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞凋亡。IL-6、INF-γ、TNF-α屬于促炎因子，其可調(diào)控多種細(xì)胞的生理功能，當(dāng)機(jī)體感染肺炎鏈球菌時巨噬細(xì)胞活化，并可產(chǎn)生IL-6、INF-γ、TNF-α等促炎因子，還可通過激活p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號通路而加重肺泡上皮細(xì)胞炎癥損傷，而IL-10屬于抗炎因子，隨著肺炎鏈球菌感染時間的延長IL-10的水平降低[15-16]。與上述報道結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示，肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞中IL-6、INF-γ、TNF-α的水平升高，IL-10的水平降低，提示成功建立細(xì)胞肺炎鏈球菌肺炎模型。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)隨著連翹提取物劑量的升高，肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞中IL-6、INF-γ、TNF-α的水平降低，IL-10的水平升高，提示連翹提取物可抑制肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

表6 過表達(dá)miR-223-3p逆轉(zhuǎn)連翹提取物對A549細(xì)胞中IL-6、INF-γ、TNF-α、IL-10水平的影響(，n＝9)

連翹提取物減輕肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞損傷的分子機(jī)制尚未闡明。本研究結(jié)果顯示，肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞中的表達(dá)量升高，而連翹提取物能夠以劑量相關(guān)的方式降低的表達(dá)量，提示連翹提取物可能通過下調(diào)的表達(dá)而抑制肺炎鏈球菌肺炎的發(fā)生。抑制表達(dá)可通過靶向Kruppel樣因子15（Kruppel-like factor 15，KLF15）抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激從而減輕細(xì)胞損傷[17]。此外，研究報道指出通過調(diào)節(jié)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3（nucleotide binding oligomerization domain-like receptor 3，NLRP3）表達(dá)而減輕高脂肪誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷[18]。本研究結(jié)果顯示，抑制表達(dá)后肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞活力升高，凋亡率降低，IL-6、INF-γ、TNF-α的水平降低，IL-10的水平升高，而上調(diào)表達(dá)后肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞活力降低，凋亡率升高，IL-6、INF-γ、TNF-α的水平升高，IL-10的水平降低，提示可通過調(diào)控肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)從而促進(jìn)肺炎鏈球菌肺炎的發(fā)生。同時本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)連翹提取物對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)的作用，提示連翹提取物可通過調(diào)控表達(dá)而減輕肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞損傷。

綜上所述，連翹提取物可促進(jìn)肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞增殖，抑制肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制與抑制的表達(dá)有關(guān)，連翹提取物可能作為治療肺炎鏈球菌肺炎的藥物，并為肺炎鏈球菌肺炎的治療提供理論依據(jù)。但連翹提取物具有多途徑、多靶點(diǎn)等特點(diǎn)，其是否可通過調(diào)控其他基因或信號通路而抑制肺炎鏈球菌肺炎的發(fā)生發(fā)展尚需進(jìn)一步探究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect ofextract on damage of alveolar epithelial cells infected byby regulating miR-223-3p

CHEN Dan1, HU Jun-wei2, LI Hong-ye1, FENG Bin3

1. Department of Pediatrics, Zhumadian Central Hospital, Zhumadian 463000, Cina 2. Department of Internal Medicine, Medical College, Huanghuai University, Zhumadian 463000, China 3. Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China

To explore the effect of Lianqiao () extract on injury of alveolar epithelial cells A549 infected byand its possible mechanism.was used to infect alveolar epithelial cells A549 to establish a cell injury model, and different doses ofextract were used to treat the cells. Micro RNA-223-3p (miR-223-3p) specific oligonucleotide inhibitor (anti-miR-223-3p) and its negative control sequence (anti-miR-NC) were respectively transfected into A549 cells and cultured with. After miR-223-3p oligonucleotide mimics (miR-223-3p mimics) was transfected into A549 cells, the cells were treated withextract, and then the cells were cultured with. MTT and flow cytometry were used to detect cell proliferation and apoptosis. ELISA method was used to detect the levels of interleukin-6 (IL-6), interferon γ (INF-γ), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and IL-10. qRT-PCR method was used to detect the expression of. Western blotting method was used to detect the expression of cleaved Caspase-3 protein.extract could enhance the viability of A549 cells infected byin a dose-dependent manner (< 0.05), and could increase the level of IL-10 (< 0.05), but could reduce the apoptosis rate and the protein level of cleaved Caspase3 (< 0.05), it could also reduce the expression ofand the levels of IL-6, INF-γ, TNF-α (< 0.05). After transfection with anti-miR-223-3p, the viability and IL-10 levels of A549 cells infected bywere increased (< 0.05), while the apoptosis rate and the protein level of cleaved Caspase-3 were decreased (< 0.05), and the levels of IL-6, INF-γ, TNF-α were decreased (< 0.05). Transfection of miR-223-3p mimics could reverse the effects ofextract on the proliferation, apoptosis and inflammation of A549 cells infected with.extract may promote cell proliferation and inhibit cell apoptosis and inflammation by inhibiting the expression of, thereby reducing the damage of alveolar epithelial cells infected by.

extract;; alveolar epithelial cell A549; cell proliferation; apoptosis

R285

A

0253 - 2670(2021)24 - 7561 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.24.018

2021-03-14

陳丹，碩士研究生，從事兒科呼吸系統(tǒng)研究。E-mail: chendan8212@126.com

馮 斌，醫(yī)學(xué)博士，從事兒科專業(yè)。E-mail: fengbin98765@163.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]