牟艷芳，陳文璐，周 冰，李小倩，庫亞萍，李 冰, *，李莎莎，嚴詩楷

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學與分子對接技術(shù)探討川蛭通絡(luò)膠囊干預微循環(huán)障礙的機制研究

牟艷芳1，陳文璐2#，周 冰1，李小倩2，庫亞萍3，李 冰1, 4*，李莎莎2，嚴詩楷4

1. 魯南制藥集團股份有限公司 中藥制藥共性技術(shù)國家重點實驗室，山東 臨沂 276000 2. 廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510006 3. 臨沂市人民醫(yī)院，山東 臨沂 276000 4. 上海交通大學藥學院，上海 200240

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學與分子對接技術(shù)探討川蛭通絡(luò)膠囊干預微循環(huán)障礙的作用機制。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫及文獻檢索收集川蛭通絡(luò)膠囊化學成分信息；在PubChem、SwissTargetPrediction、GeneCards等數(shù)據(jù)庫收集化學成分作用靶點及微循環(huán)障礙靶點；利用DAVID數(shù)據(jù)庫對共有靶點進行基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析；使用Cytoscape軟件構(gòu)建相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖，篩選主要成分、靶點進行分子對接研究。共整理得到川蛭通絡(luò)膠囊的150個成分及其對應(yīng)的480個靶點，微循環(huán)障礙靶點154個，二者共同靶點32個，富集分析發(fā)現(xiàn)共同靶點主要參與血壓調(diào)節(jié)、缺氧應(yīng)答等生物過程，以及催乳激素信號通路、Janus激酶（Janus kinase，JAK）-信號傳導和轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號通路、缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號通路、脂肪細胞因子信號通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)等信號通路。分子對接結(jié)果顯示，亞麻油酸乙酯、木犀草素、丹酚酸J等成分能與前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）、凝血因子2（coagulation factor 2，F(xiàn)2）等靶點良好對接。川蛭通絡(luò)膠囊可能是通過亞麻油酸乙酯、木犀草素、丹酚酸J等關(guān)鍵成分作用于PTGS2、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、STAT3、ACE、血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HMOX1）、F2等靶點改善氧化應(yīng)激、減輕炎性反應(yīng)，從而干預微循環(huán)障礙。

川蛭通絡(luò)膠囊；微循環(huán)障礙；網(wǎng)絡(luò)藥理學；分子對接；亞麻油酸乙酯；木犀草素；丹酚酸J

微循環(huán)是指微動脈和微靜脈之間的血液循環(huán)，屬于體循環(huán)的末端血管網(wǎng)絡(luò)，由直徑小于20 μm的微血管組成，主要包括微動脈、毛細血管后小靜脈、毛細血管及其（亞）細胞成分等，幫助物質(zhì)轉(zhuǎn)換以支持細胞、組織功能[1]。微循環(huán)障礙則是指其管道、血流或功能異常，導致內(nèi)皮細胞損傷、血流減少等[2]，參與阿爾茲海默癥[3]、心肌缺血[4]、心衰[5]、糖尿病[6]、高膽固醇血癥[7]、膿毒癥[8]等神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、全身炎癥反應(yīng)等多種疾病的發(fā)生發(fā)展。

現(xiàn)代醫(yī)學一般采用保護微血管結(jié)構(gòu)、改善血流動力學及血液流變性等方法改善微循環(huán)障礙，針對特定病理環(huán)節(jié)做出干預。而中醫(yī)藥則從整體觀念、多靶點協(xié)同作用等方面綜合改善微循環(huán)障礙。微血管在解剖結(jié)構(gòu)上類似于“絡(luò)脈”，《靈樞·脈度》中有言“經(jīng)脈為里，支而橫者為絡(luò)，絡(luò)之別著為孫”，絡(luò)脈為機體經(jīng)脈的分支，能夠運行氣血、溝通表里上下，所以當絡(luò)脈結(jié)構(gòu)及功能異常時，易出現(xiàn)氣血運行不暢，導致微循環(huán)障礙。微循環(huán)障礙在中醫(yī)學中類似“血瘀證”，治療從改善血流、抗凝等考慮，即為“活血化瘀”[9-10]。

川蛭通絡(luò)膠囊由水蛭、川芎、丹參、黃芪配伍組成，具有活血化瘀、益氣通絡(luò)的功效，臨床用于治療中風病中經(jīng)絡(luò)（腦梗塞）恢復期血瘀氣虛證，質(zhì)量控制標準按照《國家食品藥品監(jiān)督管理局標準YBZ00482009》執(zhí)行。水蛭可破血、逐瘀，川芎、丹參、黃芪共奏行氣活血祛瘀之功。臨床研究表明川蛭通絡(luò)膠囊聯(lián)合化學藥治療急性腦梗死效果優(yōu)于化學藥組，能夠顯著降低炎癥指標，有效改善患者神經(jīng)功能[11-12]。微循環(huán)障礙是腦梗死發(fā)病及繼發(fā)性損害的重要環(huán)節(jié)，改善內(nèi)皮細胞缺血、缺氧及抗炎等都是保護微循環(huán)的措施[13]，基于此，本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學[14]及分子對接技術(shù)探索川蛭通絡(luò)膠囊干預微循環(huán)障礙的機制，為川蛭通絡(luò)膠囊的臨床應(yīng)用提供科學依據(jù)。

1 方法

1.1 川蛭通絡(luò)膠囊成分庫建立

通過TCMSP 2.3數(shù)據(jù)庫[15]（http://tcmspw.com/ tcmsp.php）及文獻檢索，收集川蛭通絡(luò)膠囊各個藥物的成分。其中，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18為TCMSP數(shù)據(jù)庫的篩選條件。

1.2 靶點庫建立

通過PubChem數(shù)據(jù)庫[16]（https://pubchem.ncbi. nlm.nih.gov/）得到藥物成分的SMILES字符串，輸入SwissTargetPrediction網(wǎng)站[17]（http://www. swisstargetprediction.ch/）進行化合物的靶點預測，整理得到川蛭通絡(luò)膠囊成分靶點庫。

以“microcirculation dysfunction”為關(guān)鍵詞，在GeneCards 5.5數(shù)據(jù)庫[18]（https://www.genecards. org/）檢索，選取相關(guān)性分數(shù)＞5的靶點建立微循環(huán)障礙靶點庫。

借助Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/ tools/venny/index.html）網(wǎng)站將川蛭通絡(luò)膠囊藥物成分靶點與微循環(huán)障礙靶點進行交集，得到二者共同靶點。

1.3 基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

將共同靶點輸入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫[19]（https://david.ncifcrf.gov/），設(shè)置標識符為“OFFICIAL GENE SYMBOL”、物種選擇為“homo sapiens”，其余保持默認，進行GO功能和KEGG通路富集分析。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用Cytoscape 3.7.2軟件[20]將結(jié)果進行可視化，構(gòu)建“中藥-成分-共同靶點”“共同靶點互相作用”網(wǎng)絡(luò)圖，通過軟件自帶插件對網(wǎng)絡(luò)展開分析，篩選其中度值較高的成分、靶點開展分子對接研究。

1.5 分子對接

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫及PubChem數(shù)據(jù)庫得到川蛭通絡(luò)膠囊成分的3D結(jié)構(gòu)信息，同時通過PDB數(shù)據(jù)庫[21]（https://www.rcsb.org/）下載靶蛋白的3D結(jié)構(gòu)，使用OpenBabel 3.0軟件[22]、AutodockTool 4.0軟件[23]分別對小分子和靶蛋白進行加氫、去電荷等前處理，借助PyMOL 2.3.4軟件[24]插件找到對接活性位點，即可在Autodock Vina 1.1.2軟件[25]將處理后的成分與靶蛋白進行分子對接，最后通過PyMOL 2.3.4軟件將對接結(jié)果進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 川蛭通絡(luò)膠囊成分庫的建立

根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果及文獻檢索[26]，收集整理并去重后得到川蛭通絡(luò)膠囊150個成分（表1），其中川芎7個、黃芪20個、丹參65個、水蛭59個，1個成分為川芎和黃芪共有。

表1 川蛭通絡(luò)膠囊化學成分

續(xù)表1

編號成分藥物編號成分藥物 CZTL64epidanshenspiroketallactone丹參CZTL10413-docosenoic acid methyl ester水蛭 CZTL65C09092丹參CZTL105campesterol水蛭 CZTL66isocryptotanshi-none丹參CZTL106adenosine水蛭 CZTL67isotanshinone II丹參CZTL107L-glutamic acid水蛭 CZTL68manool丹參CZTL108methyl 12-methyltetradecanoate水蛭 CZTL69microstegiol丹參CZTL109methyl 14-methylpentadecanoate水蛭 CZTL70miltionone Ⅰ丹參CZTL110methyl heptadecanoate水蛭 CZTL71miltionone Ⅱ丹參CZTL1112-piperidone水蛭 CZTL72miltipolone丹參CZTL112indole-3-carboxaldehyde水蛭 CZTL73miltirone丹參CZTL113methyl stearate水蛭 CZTL74miltirone Ⅱ丹參CZTL114L-arginine水蛭 CZTL75neocryptotanshinone Ⅱ丹參CZTL115L-isoleucine水蛭 CZTL76neocryptotanshinone丹參CZTL116L-tryptophan水蛭 CZTL771-methyl-8,9-dihydro-7H-naphtho[5,6-g]丹參CZTL117L-threonine水蛭 benzofuran-6,10,11-trione CZTL118valine水蛭 CZTL78prolithospermic acid丹參CZTL119L-histidine水蛭 CZTL79(2R)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-[(Z)-3-(3,4- 丹參CZTL120hexanal水蛭 dihydroxyphenyl)acryloyl]oxy-propionic CZTL121phenylalanine水蛭 acid CZTL122L-methionine水蛭 CZTL80(Z)-3-[2-[(E)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)vinyl]-丹參CZTL123L-leucine水蛭 3,4-dihydroxy-phenyl]acrylic acid CZTL124L-tyrosine水蛭 CZTL81salvianolic acid G丹參CZTL125uridine水蛭 CZTL82salvianolic acid J丹參CZTL126cholesterol水蛭 CZTL83salvilenone I丹參CZTL127L-lysine水蛭 CZTL84salviolone丹參CZTL128L-aspartic acid水蛭 CZTL85NSC 122421丹參CZTL129L-serine水蛭 CZTL86(6S)-6-hydroxy-1-methyl-6-methylol-8,9-di-丹參CZTL130L-alanine水蛭 hydro-7H-naphtho[8,7-g]benzofuran-10,11- CZTL131xanthine水蛭 quinone CZTL132uracil水蛭 CZTL87tanshindiol B丹參CZTL133taurine水蛭 CZTL88przewaquinone E丹參CZTL134butanedioic acid水蛭 CZTL89tanshinone iia丹參CZTL135palmitic acid水蛭 CZTL90(6S)-6-(hydroxymethyl)-1,6-dimethyl-8,9-丹參CZTL136nicotinic acid水蛭 dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzofuran- CZTL137histamine水蛭 10,11-dione CZTL138heparin水蛭 CZTL91tanshinone Ⅵ丹參CZTL139glycerol水蛭 CZTL92inosine水蛭CZTL140glycine水蛭 CZTL93hypoxanthine水蛭CZTL141proline水蛭 CZTL94hementin水蛭CZTL142cystine水蛭 CZTL95cholesterol水蛭CZTL143adenine水蛭 CZTL96hirudinoidine B水蛭CZTL144hexadecyl glyceryl ether水蛭 CZTL97hirudinoidine A水蛭CZTL145methyl 10-nonadecenoate水蛭 CZTL98hirudinoidine C水蛭CZTL146methyl 11-methyl hexadecanoate水蛭 CZTL99methyl 4-methyltetradecanoate水蛭CZTL147methyl 14-methyl hexadecanoate水蛭 CZTL100hirudin水蛭CZTL1482-hydroxypurine nucleoside水蛭 CZTL101methyl(Z)-11-hexadecenoate水蛭CZTL1492-hydroxypurine nucleoside 2-acetoxyl-水蛭 CZTL102cholesta-5,7-dien-3-one水蛭 7,9-methyl19-enoate CZTL10313-octadecenoic acid methyl ester水蛭CZTL150indole-3-formic acid-O-D-pyranglucoside水蛭

2.2 靶點庫建立

將在PubChem數(shù)據(jù)庫得到的SMILES字符串輸入SwissTargetPrediction網(wǎng)站，進行藥物成分的作用靶點預測，根據(jù)預測得分選取每個成分前15個靶點納入成分靶點庫中，同時刪去預測得分為0的靶點并進行去重，最終整理得到川蛭通絡(luò)膠囊成分的作用靶點480個。

以“microcirculation dysfunction”為關(guān)鍵詞輸入GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索得到相關(guān)靶點1054個，篩選其中相關(guān)性分數(shù)＞5分的154個靶點建立微循環(huán)障礙靶點庫。

借助Venny 2.1網(wǎng)站將川蛭通絡(luò)膠囊藥物成分靶點與微循環(huán)障礙靶點進行交集，得到二者共同靶點32個，分別為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）、過氧化物酶體增殖激活受體γ（peroxisome proliferative activated receptor γ，PPARγ）、磷酸二酯酶5A（recombinant phosphodiesterase 5A，PDE5A）、淀粉樣前體蛋白（amyloid precusor protein，APP）、一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase 2，NOS2）、絡(luò)氨酸羥化酶（tyrosine 3 hydroxylase，TH）、凝血因子2（coagulation factor 2，F(xiàn)2）、孤兒受體絡(luò)氨酸激酶（orphan receptor tyrosine kinase，RET）、信號和傳導轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TYMP）、NOS1、血纖維蛋白溶酶原（plasminogen，PLG）、1型血管緊張素II受體（type 1 angiotensin Ⅱ receptor，AGTR1）、STAT1、F3、雄激素受體（androgen receptor，AR）、黃嘌呤脫氫酶（xanthine dehydrogenase，XDH）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、5-羥色胺受體2A（hydroxytryptamine 2A receptor，HTR2A）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine-protein kinase mTOR，MTOR）、腎素（renin，REN）、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因（telomerase reverse transcriptase，TERT）、MMP1、PPARα、血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HMOX1）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞單位α（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit α，PIK3CA）、Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）、二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、細胞周期素D1（Cyclin D1，CCND1）。

2.3 富集分析

將32個共有靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫中，進行GO功能及KEGG通絡(luò)富集分析。以值作為篩選條件，GO富集分析分別選取生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cell composition，CC）、分子功能（molecular function，MF）的前10條通路進行展示，如圖1所示，縱坐標代表富集的通路名稱，橫坐標為每條通路上的基因數(shù)占共有靶點的比例。根據(jù)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)共有靶點可能調(diào)控了血壓調(diào)節(jié)、缺氧應(yīng)答、凋亡過程中半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性的激活、脂多糖反應(yīng)、正向調(diào)控血管平滑肌細胞增殖等BP，作用于膜小凹、細胞質(zhì)、細胞外空間、樹突、胞質(zhì)核周區(qū)域等CC，參與了酶結(jié)合、受體結(jié)合、血紅素結(jié)合、四氫生物蝶呤結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等MF。

圖1 共有靶點GO富集分析

以值作為篩選條件，KEGG通路分析展示前20條通路（圖2），縱坐標代表富集的通路名稱，橫坐標為每條通路上的基因數(shù)占共有靶點的比例。由圖2可知，32個共有靶點主要富集在催乳激素信號通路、JAK-STAT信號通路、缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號通路、脂肪細胞因子信號通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、胰島素抵抗以及癌癥等多種疾病通路上。

2.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

將成分、共同靶點導入Cytoscape 3.7.1軟件，剔除與共同靶點無作用關(guān)系的成分，構(gòu)建“中藥-成分-共同靶點”網(wǎng)絡(luò)（圖3）以及“共同靶點互相作用”網(wǎng)絡(luò)（圖4）。

圖2 共有靶點KEGG通路分析

“中藥-成分-共同靶點”網(wǎng)絡(luò)中，來自川芎、黃芪、丹參、水蛭4味中藥的81個有效成分作用于32個靶點，是中藥復方多成分、多靶點共同作用的體現(xiàn)。分析該網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)合度值及中介中心性（betweenness centrality，BC）值篩選，發(fā)現(xiàn)methyl 10-nonadecenoate（CZTL145，10-十九碳烯酸甲酯，度值＝8，BC＝0.064）、hirudinoidine A（CZTL97，度值＝8，BC＝0.046）、proline（CZTL141，脯氨酸，度值＝6，BC＝0.047）、13-octadecenoic acid methyl ester（CZTL103，13-十八烯酸甲酯，度值＝6，BC＝0.045）、13-docosenoic acid methyl ester（CZTL104，13-二十二烯酸甲酯，度值＝6，BC＝0.046）、mandenol（CZTL5，亞麻油酸乙酯，度值＝6，BC＝0.040）、methyl（Z）-11-hexadecenoate（CZTL101，11-十六碳烯酸甲酯，度值＝6，BC＝0.045）、luteolin（CZTL35，木犀草素，度值＝6，BC＝0.024）、salvianolic acid J（CZTL82，丹酚酸J，度值＝6，BC＝0.030）、jaranol（CZTL19，熊竹素，度值＝4，BC＝0.022）、quercetin（CZTL15，槲皮素，度值＝4，BC＝0.020）等度值及BC較大，推測可能是作用于32個共同靶點的關(guān)鍵成分。

對“共同靶點互相作用”網(wǎng)絡(luò)進行分析發(fā)現(xiàn)，PTGS2（度值＝25，BC＝0.115）、MMP9（度值＝22，BC＝0.117）、STAT3（度值＝18，BC＝0.039）、ACE（度值＝17，BC＝0.041）、HMOX1（度值＝17，BC＝0.030）、IL2（度值＝16，BC＝0.034）、PPARγ（度值＝16，BC＝0.036）、F2（度值＝15，BC＝0.033）、MPO（度值＝14，BC＝0.050）等靶點的度值及BC較高，可能在川蛭通絡(luò)膠囊干預微循環(huán)障礙中發(fā)揮主要作用。

圖3 “中藥-成分-共同靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 共有靶點的PPI圖

2.5 分子對接

通過分子對接技術(shù)對網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)果進一步分析，篩選網(wǎng)絡(luò)中度值較高的成分和靶點進行對接，對川蛭通絡(luò)膠囊中成分干預微循環(huán)障礙靶點的能力進行預測打分。根據(jù)圖3分析結(jié)果，在選擇度值的情況下同時考慮每個藥物，故篩選來自川芎的CTZL4（myricanone，楊梅酮）、CZTL5（mandenol，亞麻油酸乙酯），來自黃芪的CZTL15（quercetin，槲皮素）、CZTL25（7--methylisomucronulatol），來自丹參的CZTL35（luteolin，木犀草素）、CZTL82（salvianolic acid J，丹酚酸J），來自水蛭的CZTL101[methyl ()-11-hexadecenoate，11-十六碳烯酸甲酯]、CZTL141（proline，脯氨酸）這8個成分作為對接成分。根據(jù)圖4分析結(jié)果，選取PTGS2、MMP9、STAT3、ACE、HMOX1、IL2、PPARγ、F2、MPO、PIK3CA等度值較大的蛋白作為對接靶蛋白，對接結(jié)果以熱圖形式展示（圖5）。一般用結(jié)合能來評估成分與靶點的結(jié)合能力，結(jié)合能＜0表明可以自由結(jié)合，結(jié)合能越低表明受體與配體之間的親和力越大，二者發(fā)生相互作用的可能性就越高。

部分分子對接結(jié)合模式見圖6，其中藍色為蛋白受體，綠色為小分子配體，黃色虛線為形成的氫鍵，表示配體與受體之間的結(jié)合較穩(wěn)定。分子對接結(jié)果顯示成分與靶點能夠較好結(jié)合。其中，來自川芎的亞麻油酸乙酯以及來自丹參的木犀草素、丹酚酸J與各個靶點的親和力較好，而PTGS2、ACE、F2等靶點與各成分間的對接結(jié)果較好，可能在川蛭通絡(luò)膠囊干預微循環(huán)障礙中起著較為重要的作用。

圖5 分子對接結(jié)果

A-PTGS2-楊梅酮 B-ACE-亞麻油酸乙酯 C-ACE-槲皮素 D-ACE-7-O-methylisomucronulatol E-ACE-木犀草素 F-HMOX1-methyl (Z)-11-hexadecenoate G-HMOX1-脯氨酸 H-F2-丹酚酸J

3 討論

3.1 川蛭通絡(luò)膠囊干預微循環(huán)障礙藥效成分分析

網(wǎng)絡(luò)藥理學研究結(jié)果顯示，10-十九碳烯酸甲酯、hirudinoidine A、脯氨酸、13-十八烯酸甲酯、13-二十二烯酸甲酯、亞麻油酸乙酯、11-十六碳烯酸甲酯、木犀草素、丹酚酸J、熊竹素、槲皮素等成分可能是川蛭通絡(luò)膠囊干預微循環(huán)障礙的主要成分，分子對接結(jié)果也證明亞麻油酸乙酯、木犀草素、丹酚酸J、槲皮素等與靶點具有良好的結(jié)合能力。

亞麻油酸乙酯屬于不飽和脂肪酸，具有抗菌抗炎特性[27]。亞麻油酸乙酯不僅能夠幫助肝臟分解膽固醇為膽酸并排出體外，也可以減少進入肝臟的脂肪酸從而降低三酰甘油，使高脂血癥發(fā)生幾率變小；除了脂質(zhì)代謝，亞麻油酸乙酯還參與蛋白質(zhì)代謝、促進組織再生[28]。根據(jù)現(xiàn)有報道，可以推測亞麻油酸乙酯可能通過減輕機體炎性反應(yīng)，促進受損內(nèi)皮細胞恢復等途徑來治療高脂血癥等與微循環(huán)障礙密切相關(guān)的疾病。

木犀草素是具有多種藥理活性如抗癌、抗炎的黃酮類化合物。研究表明，低劑量木犀草素能夠抑制NLRP3炎癥小體激活，降低M1巨噬細胞標志物（TNF-α、IL-6和iNOS）的表達，增強M2巨噬細胞標志物（Arg-1和IL-10）的表達，促進巨噬細胞向M2表型分化，證實了木犀草素的抗炎活性[29]。動物實驗表明木犀草素可以有效改善脂多糖誘導的心肌損傷小鼠的心臟功能，減輕線粒體損傷和炎癥反應(yīng)，減少氧化應(yīng)激，抑制心臟細胞凋亡[30]。另外，木犀草素還具有神經(jīng)保護作用，可緩解腦水腫，改善神經(jīng)行為功能障礙和記憶力減退[31]。以上研究可以表明木犀草素可能是川蛭通絡(luò)膠囊治療與微循環(huán)障礙相關(guān)的循環(huán)系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要成分。

丹參中的酚酸類化合物有良好的抗氧化活性，能夠保護血管內(nèi)皮、保護心肌，對心血管疾病具有防治作用，減輕微循環(huán)障礙靶器官損害[32]。槲皮素是一種多酚類黃酮化合物，能夠通過調(diào)節(jié)谷胱甘肽活性、清除活性氧從而抵抗氧化損傷[33]；另外，槲皮素還具有抗炎、抗阿爾茨海默病、抗糖尿病、抗高血壓、心血管保護作用[34]。川蛭通絡(luò)膠囊有效成分可能是通過抗炎、抗氧化作用，減少和修復微血管損傷，從而干預微循環(huán)障礙。

3.2 川蛭通絡(luò)膠囊干預微循環(huán)障礙關(guān)鍵靶點分析

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)分析和分子對接驗證，發(fā)現(xiàn)PTGS2、MMP9、STAT3、ACE、HMOX1、IL2、PPARγ、F2、MPO等靶點可能是川蛭通絡(luò)膠囊干預微循環(huán)障礙的關(guān)鍵靶點。

MMP9可以通過影響IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforing growth factor-β，TGF-β）等多種細胞因子、生長因子來發(fā)揮作用，如MMP9可以釋放血管生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）從而參與血管內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)； MMP9還可以降低血腦屏障的通透性，影響炎性細胞以減少神經(jīng)炎癥，通過CAV-1/VEGF途徑促進神經(jīng)、血管再生，減少氧化應(yīng)激損傷等[35-36]。MMP9可能通過抗炎、抗氧化，以保護血管內(nèi)皮促進其再生，改善微循環(huán)障礙。

HMOX1是參與血紅素降解的關(guān)鍵酶，是心肌中內(nèi)源性保護因子，上調(diào)HMOX1表達可以抑制心肌細胞的凋亡，保護心肌細胞缺血再灌注損傷[37]；HMOX也可以通過干預血紅素應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來改善粥樣硬化、治療血管疾病[38]。F2則可以誘導血管生成素II的表達增加和血管平滑肌細胞增殖，血管生成素II參與調(diào)節(jié)血管通透性和血管生成，并調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能，是血管疾病的重要因子；血管平滑肌細胞增殖會形成纖維帽，穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊、保護斑塊不破裂[39-40]。

MPO作為炎性標志物，在機體組織、細胞的修復和再生中發(fā)揮重要作用。研究表明，MPO可能通過對細胞外基質(zhì)的降解，使冠狀動脈痙攣、血管內(nèi)斑塊破裂而形成血栓[41]。臨床試驗表明，丹參中的丹酚酸A能夠通過調(diào)控過敏毒素C3a受體，抑制中性粒細胞中MPO的表達，減輕血管疾病風險[42]。川蛭通絡(luò)膠囊通過其有效成分，對關(guān)鍵靶蛋白的表達進行調(diào)控，參與到保護血管內(nèi)皮細胞、減少炎性因子表達、減少血栓形成等過程，干預微循環(huán)障礙。

3.3 川蛭通絡(luò)膠囊干預微循環(huán)障礙作用機制分析

對32個靶點進行富集分析發(fā)現(xiàn)，它們可能參與調(diào)控了催乳激素信號通路、JAK-STAT信號通路、HIF-1信號通路、脂肪細胞因子信號通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、胰島素抵抗等信號通路，以及血壓調(diào)節(jié)、缺氧應(yīng)答、凋亡過程中半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性的激活、脂多糖反應(yīng)、正向調(diào)控血管平滑肌細胞增殖等BP。

HIF-1是一種異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，由氧敏感亞基HIF-1α和芳烴核轉(zhuǎn)運蛋白HIF-1β組成。HIF在轉(zhuǎn)錄水平上介導了大多數(shù)細胞對缺氧的反應(yīng)，HIF-1α參與機體缺血缺氧等病理狀態(tài)，也可以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子、促紅細胞生成素和糖酵解酶的表達，促進組織重塑，維持機體氧氣穩(wěn)態(tài)[43-44]。組織缺氧在動脈粥樣硬化、心力衰竭等多種心血管疾病中均有表現(xiàn)，調(diào)控HIF-1信號通路可改善機體缺氧狀態(tài)。HIF-1不僅與氧化應(yīng)激狀態(tài)相關(guān)，在炎癥中也發(fā)揮重要作用，如羥化酶抑制劑可以通過激活HIF-1α途徑發(fā)揮抗炎作用[45]。

脂肪組織不僅是能量儲存器官，也是重要的內(nèi)分泌器官，能夠分泌激素、細胞因子、細胞外基質(zhì)、血管活性脂肪因子、抗炎細胞因子等，參與炎癥、免疫、糖脂代謝、血壓控制等一系列生理病理反應(yīng)[46]。而血管周圍的脂肪組織作為血管壁的活性成分，可以參與調(diào)節(jié)血管穩(wěn)態(tài)，影響動脈粥樣硬化的發(fā)病機制，脂肪組織正常分泌生物活性因子時，血管周圍脂肪組織則具有抗動脈粥樣硬化的能力，在肥胖等病理狀態(tài)下，血管周圍脂肪組織則會分泌促炎脂肪因子，誘導內(nèi)皮功能障礙和炎癥細胞浸潤，導致微循環(huán)障礙的發(fā)生[47]。脂聯(lián)素作為脂肪細胞分泌較多的細胞因子，在肥胖、II型糖尿病、心血管疾病中起重要作用，具有胰島素增敏、抗炎、抗動脈粥樣硬化作用[48]。

血壓調(diào)節(jié)與免疫系統(tǒng)、炎癥相互關(guān)聯(lián)，當免疫系統(tǒng)觸發(fā)炎癥過程時機體血壓可能升高，導致器官損傷。免疫系統(tǒng)會產(chǎn)生可以殺死病原體的活性氧，但是當免疫系統(tǒng)觸發(fā)長期炎癥時，會增加活性氧的產(chǎn)生引起氧化應(yīng)激，從而導致內(nèi)皮功能障礙，影響其調(diào)節(jié)血管張力、結(jié)構(gòu)的功能。另外，當炎癥持續(xù)時，一氧化氮生物利用度降低，破壞其作為血管擴張劑的主要功能，使血管松弛和血管舒張作用消失[49]。

綜上，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)，發(fā)現(xiàn)川蛭通絡(luò)膠囊可能通過亞麻油酸乙酯、木犀草素、丹酚酸J、槲皮素等關(guān)鍵成分，作用于PTGS2、MMP9、STAT3、ACE、HMOX1、F2等靶點，通過改善氧化應(yīng)激、減輕炎性反應(yīng)等機制發(fā)揮保護微血管、改善血流變等作用，從而干預微循環(huán)障礙。本研究可為川蛭通絡(luò)膠囊防治微循環(huán)障礙及其他相關(guān)疾病的研究及臨床應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Chuanzhi Tongluo Capsules on microcirculation disturbance based on network pharmacology and molecular docking

MOU Yan-fang1, CHEN Wen-lu2, ZHOU Bing1, LI Xiao-qian2, KU Ya-ping3, LI Bing1, 4, LI Sha-sha2, YAN Shi-kai4

1. State Key Laboratory of Generic Manufacture Technology of Chinese Traditional Medicine, Lunan Pharmaceutical Group Co. Ltd., Linyi 276000, China 2. The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, 510006, China 3. Linyi People’s Hospital, Linyi 276000, China 4. School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, 200240, China

To explore the mechanism of Chuanzhi Tongluo Capsules (川蛭通絡(luò)膠囊) on microcirculation dysfunction through network pharmacology and molecular docking.The compounds information of Chuanzhi Tongluo Capsules was summarized by TCMSP database and literature retrieval. The targets of compounds and microcirculation dysfunction were collected by PubChem, SwissTargetPrediction, GeneCards databases. Gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway analysis of common targets were performed using DAVID database. Cytoscape was used to construct the relevant network diagram, and the major components and targets were screened for molecular docking.A total of 150 compounds of Chuanzhi Tongluo Capsules and its corresponding 480 targets, 154 microcirculation dysfunction targets, and 32 common targets were obtained. Enrichment analysis showed that the common targets were mainly involved in biological processes such as regulation of blood pressure and response to hypoxia, as well as prolactin signaling pathway, Janus kinase (JAK)-signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway, hypoxia inducible factor-1 (HIF-1) signaling pathway, adipocytokine signaling pathway, and renin-angiotensin system. Molecular docking results showed that mandenol, luteolin, salvianolic acid J and other components could dock well with prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2), angiotensin converting enzyme (ACE) and coagulation factor 2 (F2).Chuanzhi Tongluo Capsules might intervene in microcirculation dysfunction by acting on PTGS2, matrix metalloproteinase 9 (MMP9), STAT3, ACE, heme oxygenase 1 (HMOX1), F2 through key components such as mandenol, luteolin and salvianolic acid J.

Chuanzhi Tongluo Capsules; microcirculation dysfunction; network pharmacology; molecular docking; mandenol; luteolin; salvianolic acid J

R285.5

A

0253 - 2670(2021)24 - 7550 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.24.017

2021-09-23

廣東省中醫(yī)藥防治難治性慢病重點實驗室項目（2018B030322012）

牟艷芳（1983—），女，工程師，從事中藥研發(fā)。E-mail: lncattleya@163.com

李 冰，男，高級工程師，從事中醫(yī)藥系統(tǒng)生物學研究。E-mail: libingt@126.com

#共同第一作者：陳文璐（1996—），女，碩士研究生，從事中醫(yī)藥系統(tǒng)生物學研究。E-mail: chenwenlu2266@163.com

[責任編輯 李亞楠]