覃仕娜，朱素梅#，莫鈞茹，覃 淼，黃金梅，蘇軍峰，梁健欽, 3，奉建芳, 3*

基于質(zhì)量標(biāo)志物的金崗清瘟顆粒有效成分辨識及其含量測定

覃仕娜1，朱素梅1#，莫鈞茹1，覃 淼1，黃金梅1，蘇軍峰2，梁健欽1, 3，奉建芳1, 3*

1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200 2. 廣西恒拓醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，廣西 南寧 530009 3. 廣西優(yōu)勢中成藥與民族藥開發(fā)工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530200

篩選金崗清瘟顆?？寡谆钚猿煞植y定其含量。采用二甲苯致小鼠耳腫脹急性炎癥模型和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥模型，分別以小鼠耳腫脹度以及炎癥因子一氧化氮（nitric oxide，NO）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）為指標(biāo)，評價金崗清瘟顆粒的抗炎作用。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測金崗清瘟顆粒具有抗炎作用的化學(xué)成分和潛在靶點(diǎn)，對作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，對化學(xué)成分的吸收、分布、代謝、排泄、毒性（absorption，distribution，metabolism，excretion，toxicity，ADMET）性質(zhì)進(jìn)行篩選作為有效成分，再通過高效液相色譜（HPLC）法測定有效成分含量。在動物實驗中，與模型組相比，金崗清瘟顆?？梢燥@著減輕小鼠耳腫脹的炎癥反應(yīng)（＜0.01）。在細(xì)胞實驗中，與對照組相比，模型組細(xì)胞上清液中NO、IL-6和TNF-α水平明顯升高（＜0.01）；與模型組相比，金崗清瘟顆粒含藥血清組細(xì)胞上清液中炎癥因子水平顯著降低（＜0.01）。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果顯示，篩選得到43個化學(xué)成分，619個成分靶點(diǎn)和584個疾病靶點(diǎn)，作用靶點(diǎn)128個，主要富集在炎癥反應(yīng)、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控等556條生物過程，以及缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號通路、TNF信號通路等108條通路。結(jié)合ADMET性質(zhì)篩選得到齊墩果酸、熊果酸、咖啡酸和連翹苷作為有效成分，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.65、0.68、0.59、2.38 mg/g。體內(nèi)外實驗證實金崗清瘟顆粒具有抗炎作用，其作用機(jī)制可能是通過作用于前列腺素G/H合酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、IL-6、TNF等靶點(diǎn)調(diào)控HIF-1信號通路、TNF信號通路等信號通路。齊墩果酸、熊果酸、咖啡酸和連翹苷是金崗清瘟顆粒的抗炎活性成分，可作為制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)。

金崗清瘟顆粒；抗炎；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；含量測定；齊墩果酸；熊果酸；咖啡酸；連翹苷

炎癥反應(yīng)是機(jī)體抵御外界刺激的重要過程，是大多數(shù)急慢性疾病的病因，參與肺炎、結(jié)直腸癌、酒精性肝炎、動脈粥樣硬化、糖尿病和腫瘤等疾病的發(fā)展。目前，臨床常用抗炎藥物（如非甾體類抗炎藥、甾體類抗炎藥）長期大量使用會引發(fā)多種不良反應(yīng)[1]。中藥在治療炎癥方面具有療效較好、不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)。因此從中藥資源中尋找能有效抗炎的藥物，具有重要的臨床價值。

金崗清瘟復(fù)方是從廣西壯瑤地區(qū)瘟病用藥經(jīng)驗中挖掘整理得到的，由金果欖、崗梅、白鶴藤等6味中藥民族藥材組成的小復(fù)方。中醫(yī)理論認(rèn)為，金果欖[2]、崗梅[3]、白鶴藤[4]等具有清熱解毒、利咽止痛、解暑除濕等功效，常用于感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、癰疽疔毒等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金果欖、崗梅、白鶴藤均具有抗炎、抗菌、抗病毒等作用，臨床上用于潰瘍、疥瘡等治療[5-7]。本課題組將其開發(fā)成具有抗炎作用的金崗清瘟顆粒，在其開發(fā)過程中，需進(jìn)一步篩選出有效成分作為含量測定的指標(biāo)，以便于建立制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是對中藥有效性和安全性的反映和表征，其建立存在諸多問題，難以客觀、全面評價和有效控制中藥質(zhì)量[8]。針對這個問題，劉昌孝院士[9]提出中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）的概念，用于指導(dǎo)中藥制劑的質(zhì)量研究工作。金崗清瘟顆粒作為一個復(fù)方，其化學(xué)成分較多，如何準(zhǔn)確選擇含測指標(biāo)成分是評價和控制金崗清瘟顆粒質(zhì)量的關(guān)鍵。本研究基于Q-Marker理念，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和Discovery Studio中吸收、分布、代謝、排泄、毒性（absorption，distribution，metabolism，excretion，toxicity，ADMET）插件篩選金崗清瘟顆粒的有效成分，并通過文獻(xiàn)驗證有效成分的有效性，最后測定上述有效成分的含量，為制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

1.2 動物

SPF級昆明種小鼠，4周齡，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物許可證號SYXK（桂）2019-0001。實驗前于廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，室溫20～25 ℃，自由進(jìn)食純水。動物實驗經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物福利倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號DW20210116-018）。

1.3 藥材

金果欖、白鶴藤、羅漢茶購自玉林中藥材市場，崗梅、黃芩、連翹飲片購自南寧市萬藥堂藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院中藥教研室熊萬娜副教授鑒定分別為防己科植物金果欖Gagnep.的干燥塊根、旋花科植物白鶴藤Lour.的地上部分、羅漢茶為胡桃科植物黃杞Wall.的干燥葉、冬青科植物崗梅(Hook. et Arn.) Champ. ex Benth.的干燥根、唇形科植物黃芩Georgi的干燥根、木犀科植物連翹(Thunb.) Vahl的干燥果實。

1.4 藥品與試劑

對照品齊墩果酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)91.1%，批號110709-201808）、熊果酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%，批號110742-201823）、咖啡酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%，批號110885-201703）、連翹苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.1%，批號110821-201816）購自中國食品藥品檢定研究院；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自以色列BI公司；醋酸地塞米松片（批號200419）購自浙江仙琚制藥股份有限公司；噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，批號713A032）均購自北京索萊寶科技有限公司；小鼠白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.5 儀器

EL104型電子天平（德國Sartorius公司）；XSR205DU型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Infinite 200 PRO型多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；MCO-18AIC型CO2培養(yǎng)箱（日本松下健康醫(yī)療器械株式會社）；TD-5型臺式離心機(jī)（四川蜀科儀器有限公司），BDS400型倒置顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司）；LC-2030C3D型高效液相色譜儀（HPLC，日本株式會社島津制作所）。

1.6 數(shù)據(jù)庫及軟件

TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp. php）、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http://www. swisstargetprediction.ch/）、PubChem數(shù)據(jù)庫（https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、String數(shù)據(jù)庫（version 11.0，https://string-db.org/）、GeneCards數(shù)據(jù)庫（https:// www.genecards.org/）、TTD數(shù)據(jù)庫（http://bidd.nus. edu.sg/group/cjttd/）、UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www. uniprot.org/）、DAVID 6.8軟件（https://david-d. ncifcrf.gov/）、Cytoscape軟件（v3.7.2，https:// cytoscape.org/）、Venny 2.1在線工具（https:// bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）。

2 方法

2.1 金崗清瘟顆粒的制備

稱取金果欖6 g、崗梅30 g、白鶴藤15 g、羅漢茶15 g、連翹10 g和黃芩15 g，加10倍量60%乙醇，回流提取1.5 h，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.02～1.08的清膏。藥渣加10倍量水，煎煮2次，每次1.5 h，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.02～1.08的清膏，與上述清膏混勻，干燥成干膏，粉碎，即得。

2.2 二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗

將40只小鼠隨機(jī)分為模型組、地塞米松（0.1 g/kg）組和金崗清瘟顆粒高、低劑量（6.94、3.47 g/kg）組，每組10只。各給藥組ig藥物（20 μL/g），模型組ig 0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥30 min后，取20 μL二甲苯涂布于小鼠右耳的前后兩面刺激耳廓腫脹（以左耳作為空白對照），30 min后頸椎脫臼處死動物，剪下雙耳，用直徑為8 mm的打孔器在左右耳對稱部位打下耳片，精密稱定耳片質(zhì)量，計算耳腫脹度和腫脹抑制率[10]。

耳腫脹度＝右耳片質(zhì)量－左耳片質(zhì)量

腫脹抑制率＝(模型組平均耳腫脹度－給藥組平均耳腫脹度)/模型組平均耳腫脹度

2.3 LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥實驗

2.3.1 含藥血清制備 將30只小鼠隨機(jī)分為地塞米松（0.1 g/kg）組和金崗清瘟顆粒高、低劑量（6.94、3.47 g/kg）組，每組10只，各給藥組ig藥物（20 μL/g），模型組ig 0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥1 h后，小鼠摘眼球取血，13 000 r/min離心，取上層血清，?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 MTT法檢測RAW264.7細(xì)胞活性 取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，以1×105/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設(shè)置對照組、地塞米松組和金崗清瘟顆粒高、低劑量組，棄去培養(yǎng)基，各給藥組每孔加入100 μL 10%含藥血清的DMEM培養(yǎng)基，對照組每孔加入100 μL不含藥物的DMEM培養(yǎng)基，每組設(shè)立6個復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入20 μL MTT，孵育4 h，棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，避光振搖10 min，測定490 nm處的吸光度（）值，計算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝給藥/對照

2.3.3 一氧化氮（nitric oxide，NO）、IL-6和TNF-α水平的測定 取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，以5×105/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設(shè)置對照組、模型組、地塞米松組和金崗清瘟顆粒高、低劑量組，棄去培養(yǎng)基，各給藥組每孔加入100 μL 10%含藥血清的DMEM培養(yǎng)基，模型組加入100 μL不含藥物的DMEM培養(yǎng)基，對照組加入200 μL不含藥物的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 h。除對照組外，其余各組加入100 μL的LPS溶液（1 μg/mL），培養(yǎng)24 h。吸取上清液，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，取上清液，采用Griess法檢測NO水平，按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-6、TNF-α水平。

2.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.4.1 化學(xué)成分篩選 通過文獻(xiàn)檢索和TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢，以藥材名為關(guān)鍵詞，搜索藥材的化學(xué)成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合文獻(xiàn)報道的相應(yīng)藥材的活性成分作為金崗清瘟顆粒的化學(xué)成分。

2.4.2 成分靶點(diǎn)和抗炎疾病靶點(diǎn)篩選 通過Drugbank數(shù)據(jù)庫和PubChem數(shù)據(jù)庫檢索，導(dǎo)出各化學(xué)成分3D化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，保存為“mol2”格式。將各個成分“mol2”格式文件上傳至SwissTarget Prediction在線平臺，搜索化學(xué)成分靶點(diǎn)，選取預(yù)測結(jié)果中參數(shù)“Probability≥0.1”的靶點(diǎn)，去重，運(yùn)用UniProt數(shù)據(jù)庫校正靶點(diǎn)名稱為官方名稱，最后得到化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)。通過TTD數(shù)據(jù)庫和GeneCards數(shù)據(jù)庫，搜索關(guān)鍵詞“Inflammation”，以基因庫中“Score”的中位數(shù)為篩選條件，選擇“Score≥4.0”的靶點(diǎn)作為疾病靶點(diǎn)，將2個數(shù)據(jù)庫的疾病靶點(diǎn)合并匯總、去重后，利用UniProt數(shù)據(jù)庫校正，得到疾病靶點(diǎn)。

2.4.3 作用靶點(diǎn)聚類分析 將金崗清瘟顆?；瘜W(xué)成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1在線工具，繪制韋恩圖，提取交集部分靶點(diǎn)，即金崗清瘟顆?；瘜W(xué)成分作用于炎癥的靶點(diǎn)。將作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，物種為“home sapiens”，最低相互作用評分設(shè)置為“medium confidence（0.4）”，其余參數(shù)默認(rèn)，獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）關(guān)系，保存為TSV格式文件。將TSV格式文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2，建立PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

2.4.4 基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 將上述作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，選擇排名前10，且≤0.01、FDR≤0.01的通路進(jìn)行分析。

2.4.5 “藥材-化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過Cytoscape 3.7.2軟件，繪制“藥材-化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，節(jié)點(diǎn)表示藥材、化學(xué)成分和作用靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)之間以邊連接。運(yùn)用該軟件的“Network analyzer”插件計算出網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)。節(jié)點(diǎn)度值為網(wǎng)絡(luò)中與某節(jié)點(diǎn)相連邊的數(shù)量，其值越大，則提示該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性越大。

2.5 化學(xué)成分的ADMET篩選

對上述網(wǎng)絡(luò)中化學(xué)成分進(jìn)行ADEMT生物藥劑學(xué)性質(zhì)預(yù)測，篩選出生物藥劑學(xué)性質(zhì)良好（易吸收、低毒性）的成分作為有效成分，供后續(xù)含量測定研究用。具體操作如下：將準(zhǔn)備好的化合物導(dǎo)入Discovery Studio（2016）軟件中，在該軟件“Small Molecules”模塊下的“Calculate Molecular Properties”中選擇ADMET Descriptors，其他參數(shù)選擇默認(rèn)設(shè)置，點(diǎn)擊Run，運(yùn)行計算，獲得這些化學(xué)成分在25 ℃下的水溶解度、血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）通透性、肝毒性、人類腸道吸收性等結(jié)果。各參數(shù)判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：水溶解度可分為0、1、2、3、4，分別代表水溶性極低、非常低、低、好、最佳；BBB通透性可分為0、1、2、3、4，分別代表非常高、高、中等、低、非常低；肝毒性分為F和T，分別代表無肝毒性和有肝毒性；人類腸道吸收性可分為0、1、2、3，分別代表腸道吸收性很好、比較好、比較差、非常差。

2.6 HPLC測定金崗清瘟顆粒中齊墩果酸、熊果酸、咖啡酸和連翹苷含量

2.6.1 色譜條件 Shimadzu Shim-pack column C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為30 ℃；體積流量1.0 mL/min；齊墩果酸和熊果酸[11]的流動相為乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨水溶液（67∶12∶21），等度洗脫；咖啡酸和連翹苷[12]的流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～80 min，12% A；80～90 min，12%～27% A；90～110 min，27% A；檢測波長為210 nm；進(jìn)樣量為10 μL。理論塔板數(shù)分別按熊果酸、連翹苷峰計，均應(yīng)不低于5000。

2.6.2 對照品溶液的制備 取齊墩果酸、熊果酸、咖啡酸、連翹苷對照品適量，精密稱定，加甲醇分別配制成含齊墩果酸0.05 mg/mL、熊果酸0.06 mg/mL的對照品溶液1，含咖啡酸0.08 mg/mL、連翹苷0.25 mg/mL的對照品溶液2。

2.6.3 供試品溶液的制備 取金崗清瘟顆粒約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶，精密加70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理15 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取濾液，即得。

2.6.4 含量測定 分別精密吸取對照品溶液1、2和供試品溶液各10 μL，注入HPLC，測定，即得。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 金崗清瘟顆粒對小鼠耳廓腫脹度的影響

如表1所示，與模型組相比，各給藥組小鼠耳腫脹度明顯降低（＜0.01），表明金崗清瘟顆?？擅黠@抑制由二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹。與地塞米松組相比，金崗清瘟顆粒高、低劑量組均無顯著差異，提示金崗清瘟顆粒具有良好的抗炎作用。

表1 金崗清瘟顆粒對小鼠耳廓腫脹度的影響(, n = 10)

與模型組比較：**＜0.01

**< 0.01model group

3.2 金崗清瘟顆粒含藥血清對RAW264.7細(xì)胞上清液NO、IL-6和TNF-α水平的影響

MTT結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞存活率為100%，金崗清瘟顆粒含藥血清高、低劑量組和地塞米松含藥血清組細(xì)胞存活率分別為98.01%、103.92%和100.89%，提示相應(yīng)劑量下無明顯細(xì)胞毒性。

如表2所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞上清液中NO、IL-6和TNF-α水平明顯升高（＜0.001），提示LPS可誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥應(yīng)答反應(yīng)。與模型組比較，金崗清瘟顆粒高、低劑量組和地塞米松組上清液NO、IL-6和TNF-α水平均顯著降低（＜0.01）。與地塞米松組相比，金崗清瘟顆粒高、低劑量組上清液NO、IL-6和TNF-α水平均顯著降低（＜0.05、0.01），提示金崗清瘟顆粒具有明顯的抗炎作用。

表2 金崗清瘟顆粒含藥血清對RAW264.7細(xì)胞上清液NO、IL-6和TNF-α水平的影響(, n = 6)

與對照組比較：###＜0.001；與模型組比較：**＜0.01；與地塞米松組比較：△＜0.05△△＜0.01

###< 0.001control group;**< 0.01model group;△< 0.05△△< 0.01dexamethasone group

3.3 金崗清瘟化學(xué)成分、靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)檢索[13-18]，共篩選得到43個化學(xué)成分（表3）。通過Drugbank數(shù)據(jù)庫和PubChem數(shù)據(jù)庫分別得到1077、2673個化學(xué)成分靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化靶點(diǎn)名稱，最后得到619個化學(xué)成分靶點(diǎn)。

通過TTD數(shù)據(jù)庫和GeneCards數(shù)據(jù)庫分別得到43、550個疾病靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，經(jīng)UniProt校正靶點(diǎn)名稱，得到584個疾病靶點(diǎn)。

3.4 作用靶點(diǎn)篩選和富集分析

如圖1所示，化學(xué)成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)有128個，包括B淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma 2，BCL2）、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）、二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、糖原合成酶激酶3α（glycogen synthase kinase 3α，GSK3A）、轉(zhuǎn)錄因子JUN、基質(zhì)金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinase 1，MMP1）、IL-6等。通過聚類分析得到PPI網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)共有128個節(jié)點(diǎn)、2019條邊，節(jié)點(diǎn)的平均度值為31.5，網(wǎng)絡(luò)中心度0.676。

生物過程（biological process，BP）富集分析中共得到556個條目，排名靠前的條目有炎癥反應(yīng)、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控、肽基絲氨酸磷酸化、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控。細(xì)胞組成（cellular component，CC）富集在細(xì)胞外間隙、質(zhì)膜、細(xì)胞表面、膜筏、胞外區(qū)等59個條目。分子功能（molecular function，MF）富集在酶結(jié)合、蛋白激酶活性、相同蛋白質(zhì)結(jié)合、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性，配體激活序列特異性DNA結(jié)合、類固醇激素受體等102個條目。GO富集分析結(jié)果見圖2，作用靶點(diǎn)大多分布在細(xì)胞外間隙及質(zhì)膜中，主要通過炎癥反應(yīng)、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控等生物過程以及酶結(jié)合、蛋白激酶活性等分子功能來發(fā)揮治療炎癥的作用。

表3 金崗清瘟顆粒主要化學(xué)成分

圖1 化學(xué)成分和疾病交集靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 GO功能富集分析

KEGG通路富集結(jié)果見圖3，作用靶點(diǎn)主要富集在癌癥的途徑、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號通路、TNF信號通路、胰腺癌通路等108條通路。表明金崗清瘟顆粒的抗炎作用可能與調(diào)控HIF-1、TNF信號通路等有關(guān)。

3.5 “藥材-化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析

“藥材-化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)如圖4所示，圓形代表作用靶點(diǎn)，四邊形代表化學(xué)成分靶點(diǎn)。該網(wǎng)絡(luò)由157個節(jié)點(diǎn)和656條邊構(gòu)成，平均度值為8.293。通過對化學(xué)成分的度值進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)排名靠前的化學(xué)成分為山柰酚、β-谷甾醇、漢黃芩素、槲皮素、麝香草黃酮等，提示金崗清瘟顆粒中不同藥材多種成分作用于多個靶點(diǎn)，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用。

圖3 KEGG通路富集分析

圖4 “藥材-化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

3.6 化學(xué)成分的ADMET篩選

由圖4可知，山柰酚、β-谷甾醇、漢黃芩素、槲皮素、麝香草黃酮、二甲氧基黃酮、金合歡素、木犀草素、熊果酸、非洲防己堿、黃芩素、齊墩果酸、蘆丁、咖啡酸、落新婦苷、連翹苷、黃芩苷等43個成分與抗炎作用有密切關(guān)系，可作為金崗清瘟顆粒的潛在Q-Marker。但由于成分太多，在制劑質(zhì)量控制中，難以同時對這么多成分進(jìn)行測定，也沒必要同時測定這么多成分的含量。因此，需從43個成分中挑選出主要的成分進(jìn)行含量測定。本研究通過ADMET性質(zhì)預(yù)測，篩選出有效成分進(jìn)行含量測定。

結(jié)果顯示，在25 ℃下水溶性最佳（水溶性水平＝4，?2.0＜lgSw＜0）的成分有原兒茶酸、咖啡酸、綠原酸，水溶性極低（水溶性水平＝0，lgSw＜8.0）的成分有β-谷甾醇、角鯊烯。無肝毒性成分有咖啡酸、齊墩果酸、熊果酸、丁子香萜、牛蒡子苷、連翹苷、β-谷甾醇、角鯊烯、綠原酸、黃杞苷、二羥基木素。如圖5所示，BBB通透性高的成分有非洲防己堿、黃連堿、表小檗堿，通透性低的成分有綠原酸、丁子香萜、黃芩苷、表兒茶素、落新婦苷等共19個。腸道吸收性質(zhì)很好的成分有原兒茶酸、咖啡酸、非洲防己堿、山柰酚、表兒茶素、黃連堿、連翹脂素、木犀草素、黃芩素、古倫賓等28個成分，腸吸收不好的成分有黃芩苷、牛蒡子苷、落新婦苷、β-谷甾醇、蘆丁、金果欖苷、角鯊烯、綠原酸、蘆丁、貫葉金絲桃素、黃杞苷。

圖5 BBB通透性和腸道吸收的置信區(qū)間圖

綜合43個化學(xué)成分的水溶性、BBB通透性、腸道吸收以及肝毒性預(yù)測結(jié)果，篩去ADEMT性質(zhì)不好的成分，最終得到咖啡酸、齊墩果酸、熊果酸、連翹苷、丁子香萜、二羥基木素6個成分可作為金崗清瘟顆粒的Q-Marker。通過PubChem數(shù)據(jù)庫和Pubmed數(shù)據(jù)庫檢索，對上述Q-Marker的抗炎活性進(jìn)行驗證，其中二羥基木素沒有相應(yīng)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)支持。結(jié)果見表4。

3.7 金崗清瘟顆粒的含量測定

中藥Q-Marker具有可測性、有效性、特有性、傳遞與溯源性、處方配伍5個基本特征。上述6個成分中，中國食品藥品檢定研究院未提供丁子香萜、二羥基木素對照品，本研究對余下4個成分（咖啡酸、齊墩果酸、熊果酸、連翹苷）的含量進(jìn)行測定。如圖6所示，在相應(yīng)色譜條件下，供試品色譜中齊墩果酸、熊果酸、咖啡酸和連翹苷分離良好，分別含齊墩果酸0.65 mg/g、熊果酸0.68 mg/g、咖啡酸0.59 mg/g、連翹苷2.38 mg/g。

表4 Q-Marker抗炎藥效的文獻(xiàn)驗證

4 討論

4.1 金崗清瘟顆粒的抗炎藥效

研究表明，金果欖、崗梅、白鶴藤均具有抗炎作用[19-22]。本研究以小鼠耳腫脹度以及炎癥細(xì)胞NO、IL-6和TNF-α分泌量為評價指標(biāo)，對金崗清瘟顆粒進(jìn)行抗炎藥效評價，結(jié)果表明，金崗清瘟顆粒可以明顯抑制小鼠耳腫脹和炎癥細(xì)胞NO、IL-6和TNF-α分泌，證實其具有抗炎作用，這可能與單味藥材的抗炎作用疊加有關(guān)。

4.2 金崗清瘟顆?？寡鬃饔玫木W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

通過抗炎藥效實驗證實金崗清瘟顆粒的抗炎作用，再借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出具有抗炎活性的化學(xué)成分，并分析其可能的抗炎作用機(jī)制。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，共篩選出金崗清瘟顆粒43個活性成分，可能是金崗清瘟顆?？寡椎奈镔|(zhì)基礎(chǔ)。

1-齊墩果酸 2-熊果酸 3-咖啡酸 4-連翹苷 a-對照品溶液1 b-供試品溶液 c-對照品溶液2

通過對128個作用靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)IL-6、TNF、前列腺素G/H合酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase 3，CASP3）等核心靶點(diǎn)可能是抗炎的作用靶點(diǎn)。CC趨化因子配體2（CC chemokine ligand 2，CCL2）是一類可誘導(dǎo)的、促使細(xì)胞分化、遷移和運(yùn)輸功能的促炎細(xì)胞因子，主要趨化、吸引T和B淋巴細(xì)胞進(jìn)入炎癥部位。CASP3在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段起著重要作用，參與細(xì)胞凋亡、壞死和炎癥的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，負(fù)責(zé)凋亡執(zhí)行的半胱氨酸蛋白酶的激活級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。PTGS2是前列腺素合成的主要限速酶、炎癥誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激關(guān)鍵酶，可被多種炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子誘導(dǎo)大量表達(dá)，參與組織炎癥過程及細(xì)胞的分化增殖過程。IL-6、TNF為促炎細(xì)胞因子，主要是由免疫細(xì)胞分泌的內(nèi)源性多肽，是炎癥病理生理反應(yīng)最重要的調(diào)節(jié)因子。本研究結(jié)果提示，金崗清瘟顆粒的化學(xué)成分可能作用于IL-6、TNF、CASP3、PTGS2等靶點(diǎn)發(fā)揮抗炎作用。

GO功能分析結(jié)果顯示，金崗清瘟顆粒的化學(xué)成分可能主要通過炎癥反應(yīng)、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控等生物過程以及酶結(jié)合、蛋白激酶活性等分子功能調(diào)控炎癥。KEGG通路結(jié)果顯示，靶點(diǎn)主要富集在癌癥信號通路、Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）信號通路、TNF信號通路等。癌癥信號通路包含了與腫瘤形成15個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路特定標(biāo)志物基因。其中核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路、環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，Cox-2）通路、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transduction and transcription activator，STAT）通路與炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。TLR屬于固有免疫病原模式識別受體，可以識別入侵機(jī)體的病原微生物的蛋白質(zhì)、核酸和脂類及其在反應(yīng)過程中合成的中間產(chǎn)物和代謝產(chǎn)物，快速激活接頭蛋白、信號復(fù)合體和轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體等，最終導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子、抗炎細(xì)胞因子及趨化因子。TLR通過不同的識別途徑活化多種免疫細(xì)胞，啟動非特異性免疫應(yīng)答并激起適應(yīng)性免疫應(yīng)答以清除病原體，在炎癥、細(xì)胞存活和增殖方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TNF信號通路是一條主要的炎癥通路，TNF-α可激活多條通路，進(jìn)而調(diào)控炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及免疫反應(yīng)。TNF-α是NF-κB調(diào)節(jié)的基因，可以反向作用于NF-κB形成正反饋調(diào)節(jié)，當(dāng)TNF-α被抑制后可以減輕炎癥條件下產(chǎn)生的疼痛[23-24]。本研究結(jié)果提示，金崗清瘟顆?？赡芡ㄟ^調(diào)控TNF、TLR等信號通路從而抑制炎癥因子NO、IL-6和TNF-α的表達(dá)。

4.3 ADMET篩選Q-Marker

藥物的ADMET性質(zhì)是藥物研發(fā)中的重要環(huán)節(jié)，ADMET性質(zhì)涵蓋了藥物能否被人體有效吸收、到達(dá)目標(biāo)組織、未知毒性等藥動學(xué)和毒理學(xué)問題，是評估小分子化合物能否成藥的關(guān)鍵指標(biāo)[25]。近年來，利用計算方法預(yù)測藥物的ADMET性質(zhì)引起了國內(nèi)外科學(xué)家的廣泛關(guān)注，根據(jù)已知分子的ADMET性質(zhì)數(shù)據(jù)，通過機(jī)器學(xué)習(xí)和模式識別方法建立計算預(yù)測模型，從而預(yù)測未知分子的ADMET性質(zhì)。與實驗方法相比，使用計算機(jī)方法對化合物進(jìn)行ADMET性質(zhì)預(yù)測具有明顯的優(yōu)勢[26]。

具有較好成藥性的候選成分應(yīng)當(dāng)具備水溶性適宜、BBB通透性良好、毒性低、腸道吸收良好等特性。本研究發(fā)現(xiàn)，金崗清瘟顆粒具有良好的抗炎作用，提示只有生物藥劑學(xué)性質(zhì)良好的化學(xué)成分才能成為金崗清瘟顆粒的有效成分。因此，從43個化學(xué)成分中篩選出生物藥劑學(xué)性質(zhì)好的成分作為金崗清瘟顆粒的Q-Marker是非常必要的。本研究通過Discovery Studio的ADMET插件對金崗清瘟顆粒的化學(xué)成分進(jìn)行ADMET性質(zhì)預(yù)測，由于二羥基木素沒有相應(yīng)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)支持其抗炎活性，最終篩選出齊墩果酸、熊果酸、咖啡酸、連翹苷、丁子香萜共5個成分作為金崗清瘟顆粒的Q-Marker。研究表明，齊墩果酸具有抗炎作用，對IL-6、IL-8和MMP1等炎癥因子、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶和蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）的磷酸化均有明顯的抑制作用，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和NF-κB信號通路而抑制IL-1β刺激的炎癥因子的表達(dá)[27]。熊果酸具有保肝、抗病毒、抗炎以及抗變態(tài)反應(yīng)作用，其抗炎機(jī)制可能為抑制NF-κB活化，減少E-選擇素mRNA轉(zhuǎn)錄，從而抑制炎性細(xì)胞因子[28]。咖啡酸具有很好的抗炎活性，可以抑制由高級糖基化終產(chǎn)物-牛血清白蛋白（advanced glycation end product-bovine serum albumins，AGEs-BSA）誘導(dǎo)的細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，）、血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，）和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，）mRNA表達(dá)，下調(diào)TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)，減少炎癥信號通路p38MAPK/NF-κB相關(guān)激酶的表達(dá)，從而抑制AGEs-BSA誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC炎癥反應(yīng)[29]。連翹苷可緩解肺損傷、腎損傷、腦損傷，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌和保肝等廣泛的藥理作用[30]。后期需對上述4成分的抗炎作用進(jìn)行驗證。

4.4 含量測定指標(biāo)的選擇

中藥復(fù)方具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)，中藥整體性作用的特性使中藥復(fù)方的作用機(jī)制、藥效成分尚不清楚，中藥制劑質(zhì)量更難以準(zhǔn)確評價、控制，主要體現(xiàn)在盲目選擇制劑的含量測定指標(biāo)上。在金崗清瘟顆粒質(zhì)量控制方面，根據(jù)本研究結(jié)果顯示，齊墩果酸、熊果酸、咖啡酸和連翹苷為金崗清瘟顆粒的抗炎有效成分，因此，將以上4個成分作為金崗清瘟顆粒的含量測定指標(biāo)，是合理的。

綜上所述，本研究通過體內(nèi)外實驗證實金崗清瘟顆粒具有顯著的抗炎作用，可以減輕二甲苯刺激的小鼠耳腫脹，抑制炎癥細(xì)胞NO、IL-6和TNF-α分泌。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合文獻(xiàn)報道，預(yù)測得到43個具有抗炎作用的潛在Q-Marker，主要作用于PTGS2、IL-6、TNF為主的多個靶點(diǎn)，進(jìn)而參與調(diào)控TLR信號通路、TNF信號通路等多條經(jīng)典炎癥通路，最終下調(diào)NO、IL-6和TNF-α等促炎因子水平，發(fā)揮抗炎作用。從43個化學(xué)成分中篩選出ADMET性質(zhì)良好的4個有效成分（齊墩果酸、熊果酸、咖啡酸和連翹苷）作為金崗清瘟顆粒的含量測定指標(biāo)，為其后續(xù)的質(zhì)量控制研究及新藥開發(fā)提供依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Screening and determination of effective content of Jingang Qingwen Granules based on quality marker

QIN Shi-na1, ZHU Su-mei1, MO Jun-ru1, QIN Miao1, HUANG Jin-mei1, SU Jun-feng2, LIANG Jian-qin1, 3, FENG Jian-fang1, 3

1. Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530200, China 2. Guangxi Hengtuo Pharmaceutical Group Co., Ltd., Nanning 530009, China 3. Guangxi Superior Proprietary Chinese Medicine and Ethnic Medicine Development Engineering Technology Research Center, Nanning 530200, China

To screen and determine the anti-inflammatory active components of Jinggang Qingwen Granules (金崗清瘟顆粒, JGQW).Acute inflammation model of xylene induced ear swelling in mice and lipopolysaccharide (LPS) induced inflammation model of RAW264.7 cells were used to evaluate the anti-inflammatory effects of JGQW, using the degree of ear swelling in mice and inflammatory factors nitric oxide (NO), interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) as indicators. The chemical components and potential targets of JGQW with anti-inflammatory effects were predicted by network pharmacology. The targets were analyzed by gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis. Absorption, distribution, metabolism, excretion, toxicity (ADMET) and other properties of chemical components were screened to obtain effective components. Finally, content of active components was determined by high performance liquid chromatography (HPLC).In animal experiments, JGQW significantly reduced the inflammatory response of ear swelling in mice compared with model group (0.01). In cell experiments, levels of NO, IL-6 and TNF-α in supernatant produced by cells in model group were significantly higher than control group (0.01), while the levels of inflammatory factors in JGQW-containing serum group were significantly lower than model group (0.01). Network pharmacological analysis obtained 43 chemical components, 619 component targets, 584 disease targets and 128 action targets, which were mainly concentrated in 556 biological processes such as inflammatory response and positive regulation of nitric oxide biosynthesis, as well as 108 pathways such as hypoxia inducible factor-1 (HIF-1) signal pathway and TNF signal pathway. Combined with ADMET screening, oleanolic acid, ursolic acid, caffeic acid and forsythin were obtained as target component with the contents of 0.65, 0.68, 0.59 and 2.38 mg/g, respectively.andexperiments confirmed that JGQW has anti-inflammatory effects, and its mechanism may be related to the interaction with prostaglandin G/H synthase 2 (PTGS2), IL-6, TNF and other targets to regulate HIF-1 signaling pathway, TNF signaling pathway and other signaling pathways. Oleanolic acid, ursolic acid, caffeic acid and forsythin are anti-inflammatory active ingredients of JGQW and can be used as quality control indicators for the formulation.

Jingang Qingwen Granules; anti-inflammation; network pharmacology; content determination;oleanolic acid; ursolic acid; caffeic acid; forsythin

R285

A

0253 - 2670(2021)24 - 7527 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.24.015

2021-08-25

中國科學(xué)院科技服務(wù)網(wǎng)絡(luò)計劃（STS計劃）區(qū)域重點(diǎn)項目（KFJ-STS-QYZD-2021-03-002）；廣西自然科學(xué)基金資助項目（2020GXNSFAA238035）；廣西科技基地和人才專項（桂科AD20238058）

覃仕娜（1997—），女，2019級在讀碩士生，從事中藥新藥開發(fā)。Tel: 15678878462 E-mail: 1643130710@qq.com

奉建芳，教授，博士生導(dǎo)師。Tel: 13817588549，E-mail: fengjianfang@vip.163.com

#共同第一作者：朱素梅（1996—），女，2020級在讀碩士生，從事中藥新藥開發(fā)。Tel: 15177589769 E-mail: 1627555900@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]