王彬斌，馮曉曉，恩特扎爾·別爾克，趙 暉，李朝霞

開心散對(duì)APP/PS1小鼠神經(jīng)炎癥和Aβ沉積的作用研究

王彬斌，馮曉曉，恩特扎爾·別爾克，趙 暉，李朝霞*

首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069

研究開心散對(duì)阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）動(dòng)物模型淀粉樣前體蛋白/早老素基因1（amyloid precursor protein/presenilin 1，APP/PS1）雙轉(zhuǎn)基因小鼠的作用。將3月齡雄性APP/PS1小鼠隨機(jī)分為模型組、美金剛（3.33 mg/kg）組及開心散低、中、高劑量（0.33、1.00、3.00 g/kg）組，采用同月齡相同遺傳背景C57BL/6J小鼠作為對(duì)照組和對(duì)照給藥（開心散1.00 g/kg）組，每組8只。連續(xù)ig給藥2個(gè)月后，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力；蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)；剛果紅染色法檢測(cè)小鼠腦組織淀粉樣斑塊表達(dá)；免疫組化學(xué)法檢測(cè)小鼠皮層和海馬中β淀粉樣蛋白1-40（amyloid β protein 1-40，Aβ1-40）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）和離子鈣接頭結(jié)合調(diào)節(jié)分子-1（ionized calcium binding adaptor molecule-1，Iba-1）的表達(dá)；ELISA法檢測(cè)小鼠血清中炎癥因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6水平以及皮層和海馬中乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）水平。與模型組相比，美金剛組和開心散組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯提高（＜0.05、0.01），海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量增加（＜0.01）；皮層和海馬中的淀粉樣斑塊、Aβ1-40、GFAP和Iba-1表達(dá)明顯減少（＜0.05、0.01）；血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯降低（＜0.05、0.01）；皮層中Ach水平顯著升高（＜0.01）。開心散可能通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化，降低血清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平，減少Aβ和淀粉樣斑塊的生成，增加皮層中Ach含量，從而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元、防治AD的作用。

開心散；阿爾茨海默癥；淀粉樣前體蛋白/早老素基因1雙轉(zhuǎn)基因小鼠；β淀粉樣蛋白；膠質(zhì)纖維酸性蛋白；離子鈣接頭結(jié)合調(diào)節(jié)分子-1

阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）是一種以獲得性記憶減退、認(rèn)知功能障礙等為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)為主要病理特征[1]。隨著世界人口老齡化，AD的發(fā)病率急劇增高，嚴(yán)重影響人類健康[2]。AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，β淀粉樣蛋白（amyloid β protein，Aβ）沉積和神經(jīng)炎癥在AD的病理進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用[3-4]。AD在中醫(yī)學(xué)屬“呆病”“健忘”“虛勞”等范疇。開心散始載于唐代孫思邈的《備急千金要方》，由“遠(yuǎn)志、人參各4分，茯苓2兩，石菖蒲1兩”組成[5]，“主好忘”，是治療老年癡呆的基礎(chǔ)方。研究表明，開心散可改善AD動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)記憶能力，通過影響Aβ生成、保護(hù)神經(jīng)元、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、抗氧化等途徑發(fā)揮作用[6-8]，在防治AD方面具有良好的應(yīng)用前景，但其基于Aβ沉積和神經(jīng)炎癥的藥理作用還有待于進(jìn)一步系統(tǒng)研究。本研究選擇淀粉樣前體蛋白/早老素基因1（amyloid precursor protein/presenilin 1，APP/PS1）雙轉(zhuǎn)基因小鼠，從行為學(xué)、Aβ沉積、神經(jīng)炎癥等方面評(píng)價(jià)開心散對(duì)APP/PS1小鼠的作用，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性3月齡APP/PS1小鼠和C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量20～30 g，購自北京華阜康生物科技有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2020-0004。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度（25±2）℃、濕度（50±10）%的屏障環(huán)境內(nèi)，自由進(jìn)食飲水，每日光照12 h。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)AEEI-2018-101）。

1.2 藥材

開心散由人參、茯苓、石菖蒲和遠(yuǎn)志組成，人參、茯苓和石菖蒲購自北京能濟(jì)中藥飲片有限公司，遠(yuǎn)志購自北京明輝恒通藥業(yè)有限公司，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院李佳副教授鑒定分別為五加科植物人參C. A. Mey.的干燥根和根莖、多孔菌科真菌茯苓(Schw.) Wolf的干燥菌核、天南星科植物石菖蒲Schott.的干燥根莖、遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志W(wǎng)illd.的干燥根。

1.3 藥品與試劑

鹽酸美金剛片（批號(hào)797818）購自丹麥靈北藥廠；Aβ1-40抗體（批號(hào)GB11307）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體（批號(hào)GB11096）、離子鈣接頭結(jié)合調(diào)節(jié)分子-1（ionized calcium binding adaptor molecule-1，Iba-1）抗體（批號(hào)GB11105）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)GB11206）均購自武漢塞維爾生物科技有限公司；小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒、小鼠IL-1β ELISA試劑盒、小鼠乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）ELISA試劑盒均購自上海藍(lán)基生物科技有限公司；PBS溶液、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、多聚甲醛、二甲苯與中性樹膠均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；3%雙氧水、無水乙醇、丙酮均購自北京化工廠。

1.4 儀器

63031型水迷宮實(shí)驗(yàn)設(shè)備（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；3K15型低溫高速離心機(jī)（美國Sigma公司）；超低溫冰箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Bio-Gen PRO200勻漿儀（美國PRO Scientific公司）；Pannoramic scan全自動(dòng)切片掃描儀（匈牙利3DHistech公司）；SpectraMax Plus 385全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；UC7超薄切片機(jī)（德國Leica公司）；E100顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 開心散的制備

將開心散的4味藥材飲片粉碎，過24目篩得中藥粗粉。按原方比例[9-12]（人參、遠(yuǎn)志、石菖蒲、茯苓為1∶1∶25∶50），稱取藥材粉末適量，加入12倍量70%乙醇，浸泡0.5 h，加熱回流提取2 h，濾過；濾渣繼續(xù)用10倍量70%乙醇回流提取1 h，濾過，合并2次濾液，減壓回收乙醇，于真空干燥箱干燥，得到開心散醇提物，4 ℃保存。取適量開心散醇提物干粉，用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液配制一定質(zhì)量濃度的開心散藥液，經(jīng)高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定，開心散中含遠(yuǎn)志𠮿酮III 9.3 μg/g、3,6′-二芥子?；崽?02.0 μg/g、α-細(xì)辛醚97.1 μg/g、β-細(xì)辛醚1033.0 μg/g、去氫土莫酸298.0 μg/g、茯苓酸410.0 μg/g、松苓新酸11.7 μg/g。

2.2 動(dòng)物分組與給藥

將雄性APP/PS1小鼠隨機(jī)分為模型組、美金剛（3.33 mg/kg）組和開心散低、中、高劑量（0.33、1.00、3.00 g/kg，以生藥量計(jì)）組，每組8只。以同月齡、相同遺傳背景的雄性C57BL/6J野生小鼠16只作為正常組，隨機(jī)分為對(duì)照組和對(duì)照給藥（開心散1.00 g/kg）組，每組8只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，各給藥組ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），模型組以及對(duì)照組ig等體積0.5% CMC-Na溶液，1次/d，連續(xù)2個(gè)月。給藥結(jié)束后，進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[13]。

2.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

2.3.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 將平臺(tái)置于某一象限，第1～5天將小鼠分別從其他3個(gè)象限面向池壁放入水中，每日訓(xùn)練3次，記錄小鼠入水后60 s內(nèi)站上平臺(tái)所需時(shí)間，即逃逸潛伏期。小鼠找到平臺(tái)后使其在平臺(tái)上休息10 s，若規(guī)定時(shí)間內(nèi)找不到平臺(tái)，則由操作者將其引導(dǎo)上平臺(tái)，使其在平臺(tái)上停留相同時(shí)間。

2.3.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后，撤除平臺(tái)，將小鼠從同一入水點(diǎn)放入水中，記錄小鼠在60 s內(nèi)的穿越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)象限時(shí)間百分比和平臺(tái)象限路程百分比。

2.4 取材

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠吸入異氟烷麻醉后取血，用于血清炎癥因子的檢測(cè)。取血后每組隨機(jī)取3只小鼠心臟灌注4%多聚甲醛固定組織，制備腦組織石蠟包埋切片，分別進(jìn)行HE染色、剛果紅染色和免疫組化實(shí)驗(yàn)；每組剩余的5只小鼠取血后處死，斷頭取腦，冰上快速分離海馬和皮層，于液氮中快速冷凍，?80 ℃凍存，用于Ach檢測(cè)。

2.5 HE染色法觀察小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)

取各組小鼠腦組織石蠟切片，通過常規(guī)脫蠟水化后，進(jìn)行HE染色，中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)并采集圖像，同時(shí)進(jìn)行神經(jīng)元計(jì)數(shù)。

2.6 剛果紅染色法檢測(cè)小鼠腦組織淀粉樣斑塊的表達(dá)

取各組小鼠腦組織石蠟切片，通過常規(guī)脫蠟水化后，進(jìn)行剛果紅染色，中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像。每個(gè)切片隨機(jī)選取多個(gè)不同視野，測(cè)定淀粉樣斑塊的吸光度（）值。

2.7 免疫組化法檢測(cè)小鼠腦組織Aβ1-40、GFAP和Iba-1蛋白表達(dá)

取各組小鼠腦組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化，抗原修復(fù)；放入3%雙氧水溶液孵育后血清封閉，滴加Aβ1-40、GFAP、Iba-1抗體，4 ℃孵育過夜；加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，室溫孵育；滴加DAB顯色，中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像。每個(gè)切片隨機(jī)選取多個(gè)不同視野，測(cè)定Aβ1-40、GFAP和Iba-1的值。

2.8 ELISA法檢測(cè)小鼠血清中炎癥因子以及皮層、海馬組織Ach水平

取各組小鼠血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平。取各組小鼠的皮層和海馬組織，按照組織質(zhì)量和體積（1∶9）加入PBS溶液，冰浴下勻漿，4 ℃、3000 r/min離心，分離上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)Ach水平。

2.9 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果

3.1 開心散對(duì)APP/PS1小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1、2。在定位航行實(shí)驗(yàn)中，各組小鼠逃逸潛伏期隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加整體呈下降趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，對(duì)照給藥組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力無明顯差異；模型組小鼠在第2～5天的逃逸潛伏期明顯延長(zhǎng)（＜0.01）。與模型組相比，美金剛組小鼠在第3～5天的逃逸潛伏期明顯縮短（＜0.05）；開心散各劑量組小鼠的逃逸潛伏期均有所減少，其中開心散高劑量組小鼠在第3～5天的逃逸潛伏期明顯縮短（＜0.05、0.01）。

表1 各組小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果(, n = 8)

與對(duì)照組比較：#＜0.05##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

#< 0.05##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as below tables

表2 各組小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果(, n = 8)

空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組小鼠的穿越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)象限時(shí)間百分比和平臺(tái)象限路程百分比均明顯減少（＜0.05、0.01）；與模型組相比，美金剛組小鼠的穿越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)象限時(shí)間百分比和平臺(tái)象限路程百分比均明顯增加（＜0.05）；開心散各劑量組小鼠的穿越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)象限時(shí)間百分比和平臺(tái)象限路程百分比均增加，其中開心散高劑量組具有顯著性差異（＜0.05）。

3.2 開心散對(duì)APP/PS1小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷的影響

如圖1和表3所示，對(duì)照組和對(duì)照給藥組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元染色清楚且均勻，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核呈圓形，核仁清晰。與對(duì)照組相比，模型組小鼠的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少（＜0.01），細(xì)胞排列較為分散，核固縮現(xiàn)象明顯，核仁不清晰；與模型組相比，美金剛組小鼠的海馬CA1神經(jīng)元數(shù)量明顯增多（＜0.01），神經(jīng)元排列較為整齊，核固縮現(xiàn)象明顯改善；開心散各劑量組小鼠的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量均明顯增多（＜0.01），神經(jīng)元排列較為規(guī)則整齊，核固縮現(xiàn)象明顯得到改善。

3.3 開心散對(duì)APP/PS1小鼠腦組織淀粉樣斑塊表達(dá)的影響

如圖2所示，對(duì)照組和對(duì)照給藥組小鼠的皮層和海馬中均未檢測(cè)到陽性表達(dá)，在其他組小鼠的皮層和海馬則檢測(cè)到了呈彌散性分布的粉紅色陽性表達(dá)，即淀粉樣斑塊。分別對(duì)海馬和皮層中淀粉樣斑塊陽性表達(dá)的值進(jìn)行半定量分析，結(jié)果見表4，與模型組相比，美金剛組和開心散中、高劑量組小鼠皮層中的淀粉樣斑塊均明顯減少（＜0.01），但對(duì)海馬中淀粉樣斑塊的表達(dá)無明顯改善作用。

圖1 開心散對(duì)APP/PS1小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的影響 (HE, ×400)

表3 開心散對(duì)APP/PS1小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量的影響(, n = 3)

A-對(duì)照組 B-對(duì)照給藥組 C-模型組 D-美金剛組 E-開心散低劑量組 F-開心散中劑量組 G-開心散高劑量組 圖片從左至右依次為全腦 (×20)、皮層 (×630)、海馬(×100)、海馬局部放大圖(×630)，黑色框標(biāo)注局部放大區(qū)域，圖3～5同

表4 開心散對(duì)APP/PS1小鼠腦組織淀粉樣斑塊表達(dá)的影響(, n = 3)

ND表示未檢測(cè)到

ND means not detected

3.4 開心散對(duì)APP/PS1小鼠腦組織Aβ1-40表達(dá)的影響

Aβ1-40陽性表達(dá)為棕褐色。如圖3和表5所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠的皮層和海馬中Aβ1-40陽性表達(dá)顯著增加（＜0.01）；與模型組相比，美金剛組小鼠的皮層和海馬中Aβ1-40陽性表達(dá)明顯減少（＜0.05），開心散各劑量組小鼠皮層和海馬中Aβ1-40陽性表達(dá)均有所減少，其中開心散低、中劑量組皮層Aβ1-40陽性表達(dá)具有顯著性差異（＜0.05），開心散中、劑量組海馬中Aβ1-40陽性表達(dá)具有顯著性差異（＜0.05）。

圖3 開心散對(duì)APP/PS1小鼠腦組織Aβ1-40表達(dá)的影響

表5 開心散對(duì)APP/PS1小鼠腦組織Aβ1-40表達(dá)的影響(, n = 3)

3.5 開心散對(duì)APP/PS1小鼠腦組織GFAP表達(dá)的影響

各組小鼠皮層和海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物GFAP的免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4和表6，陽性表達(dá)為棕褐色。與對(duì)照組相比，模型組小鼠皮層和海馬中GFAP表達(dá)明顯增加（＜0.01）；與模型組相比，美金剛組小鼠皮層中GFAP表達(dá)明顯減少（＜0.01），開心散中劑量組海馬和皮層中的GFAP表達(dá)均明顯降低（＜0.01）。

圖4 開心散對(duì)APP/PS1小鼠腦組織GFAP表達(dá)的影響

表6 開心散對(duì)APP/PS1小鼠腦組織GFAP表達(dá)的影響(, n = 3)

3.6 開心散對(duì)APP/PS1小鼠腦組織Iba-1表達(dá)的影響

各組小鼠皮層和海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物Iba-1的免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5和表7，陽性表達(dá)為棕褐色。與對(duì)照組相比，模型組小鼠皮層和海馬中Iba-1的表達(dá)明顯增加（＜0.05、0.01）；與模型組相比，美金剛組小鼠海馬中Iba-1的表達(dá)明顯減少（＜0.05），開心散中劑量組海馬和皮層中Iba-1表達(dá)顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.7 開心散對(duì)APP/PS1小鼠血清炎癥因子水平的影響

如表8所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均明顯升高（＜0.05、0.01）；與模型組相比，美金剛組和開心散高劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均明顯降低（＜0.05、0.01），開心散中劑量組小鼠血清中TNF-α水平明顯降低（＜0.05）。

圖5 開心散對(duì)APP/PS1小鼠腦組織中Iba-1表達(dá)的影響

表7 開心散對(duì)APP/PS1小鼠腦組織Iba-1表達(dá)的影響(, n = 3)

3.8 開心散對(duì)APP/PS1小鼠皮層和海馬中Ach水平的影響

如表9所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠皮層和海馬中Ach水平均明顯下降（＜0.01）；與模型組相比，美金剛組和開心散中劑量組小鼠皮層中Ach水平明顯升高（＜0.01）。

表8 開心散對(duì)APP/PS1小鼠血清中炎癥因子水平的影響(, n = 8)

表9 開心散對(duì)APP/PS1小鼠皮層和海馬中Ach水平的影響(, n = 5)

4 討論

AD在中醫(yī)學(xué)屬“呆病”“健忘”“虛勞”等范疇。歷代中醫(yī)醫(yī)家對(duì)老年癡呆疾病的癥狀、病因和病機(jī)等都有著全面而深刻的認(rèn)識(shí)，在疾病的治療上多從補(bǔ)氣、益智、安神等方面用藥[14-15]。開心散始載于唐代孫思邈《備急千金要方·卷十四》，為益智方劑，“主好忘”，由“遠(yuǎn)志、人參各4分，茯苓2兩，石菖蒲1兩”組成。方中人參具有補(bǔ)氣固脫、寧心益智之功效；遠(yuǎn)志具有安神益智、祛痰、消腫之功效；茯苓具有寧心安神、利水滲濕之功效；石菖蒲具有醒神益智、開竅豁痰之功效[16]。從數(shù)據(jù)挖掘角度分析中醫(yī)藥治療健忘和癡呆的用藥規(guī)律，人參、遠(yuǎn)志、茯苓和石菖蒲均為高頻使用中藥，故可認(rèn)為開心散治療老年性癡呆具有歷史淵源且是治療老年癡呆的基礎(chǔ)方[17-18]，其治療老年癡呆的作用機(jī)制值得進(jìn)一步的研究與探索。

AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多個(gè)病理環(huán)節(jié)。Aβ在腦內(nèi)沉積是AD主要的發(fā)病機(jī)制之一[19-20]。Aβ在腦內(nèi)生成過剩，不能及時(shí)得到清除，繼而在神經(jīng)細(xì)胞外大量聚集形成淀粉樣斑塊，引發(fā)神經(jīng)炎癥、神經(jīng)元變性等一系列病理變化，最終導(dǎo)致患者的認(rèn)知和記憶能力下降[21]。本研究結(jié)果顯示，5月齡APP/PS1小鼠皮層和海馬中均出現(xiàn)彌散分布的淀粉樣斑塊，Aβ1-40表達(dá)與對(duì)照組相比明顯增多。給藥2個(gè)月后，中、高劑量開心散可使APP/PS1小鼠皮層中淀粉樣斑塊表達(dá)明顯降低，低、中劑量開心散可使APP/PS1小鼠皮層中Aβ1-40表達(dá)明顯降低，中、高劑量開心散可使APP/PS1小鼠海馬中Aβ1-40表達(dá)明顯降低。結(jié)果表明，開心散對(duì)APP/PS1皮層和海馬中的Aβ沉積具有一定的改善作用，可能通過降低Aβ1-40表達(dá)發(fā)揮作用。

神經(jīng)炎癥也是AD的發(fā)病機(jī)制之一[22-23]。神經(jīng)炎癥反應(yīng)主要由腦組織中的免疫細(xì)胞異常激活介導(dǎo)，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞是腦中主要負(fù)責(zé)免疫調(diào)節(jié)的細(xì)胞，GFAP和Iba-1分別是星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物[24-25]。研究表明，開心散具有降低AD小鼠腦組織和血清中炎癥因子水平[26-27]以及通過調(diào)控中樞神經(jīng)炎癥系統(tǒng)、抗抑郁的作用[28-29]，但未見開心散在APP/PS1小鼠的抗炎作用報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，5月齡APP/PS1小鼠皮層和海馬中GFAP和Iba-1表達(dá)異常增加，出現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨?，血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平增加。中劑量開心散可明顯降低APP/PS1小鼠皮層和海馬中GFAP和Iba-1表達(dá)，并降低血清中IL-1β水平；高劑量開心散可明顯降低血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平，表明開心散可緩解星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的異?；罨种蒲装Y因子TNF-α、IL-1β和IL-6的大量釋放。

在AD的病理過程中，炎癥反應(yīng)與Aβ沉積密切相關(guān)。Aβ沉積可誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞過度激活[30-31]。小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活導(dǎo)致促炎因子大量釋放，對(duì)Aβ的清除減少[32]；星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活后表現(xiàn)出神經(jīng)毒性作用，促使炎性介質(zhì)釋放增加，導(dǎo)致神經(jīng)變性和突觸丟失，加劇認(rèn)知障礙[33]，從而形成惡性循環(huán)。開心散具體通過哪些作用靶點(diǎn)和通路抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化、炎癥反應(yīng)和Aβ沉積，有待進(jìn)一步深入研究。

此外，有研究表明膽堿能異常與Aβ異常沉積之間存在緊密聯(lián)系，膽堿能缺失可能促進(jìn)Aβ和tau的病理改變，從而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[34]。腦內(nèi)的Ach主要來源于皮層和基底前腦的膽堿能神經(jīng)元，在學(xué)習(xí)記憶與認(rèn)知功能中起重要作用。FDA批準(zhǔn)上市的AD治療藥物主要是膽堿酯酶抑制劑，它們通過抑制Ach水解從而增加腦內(nèi)Ach水平。本研究結(jié)果顯示，5月齡APP/PS1小鼠腦組織的皮層和海馬腦區(qū)均出現(xiàn)Ach水平下降，開心散給藥2個(gè)月后，中劑量開心散可明顯提高大腦皮層中的Ach水平，提示開心散可能通過增加Ach的含量發(fā)揮改善學(xué)習(xí)記憶的功能。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)開心散給藥2個(gè)月可改善APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其作用機(jī)制為通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化，降低血清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平，改善神經(jīng)炎癥，降低Aβ的含量，提高神經(jīng)遞質(zhì)Ach水平，從而發(fā)揮對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Pharmacological effects of Kaixin San on neuroinflammation and Aβ deposition in APP/PS1 mice

WANG Bin-bin, FENG Xiao-xiao, Entzal Berk, ZHAO Hui, LI Zhao-xia

Beijing Key Laboratory of TCM Collateral Disease Theory Research, School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069, China

To study the pharmacological effects of Kaixin San (開心散) on Alzheimer’s disease (AD) aninal model, amyloid precursor protein/presenilin 1 (APP/PS1) double transgenic mice.Three-month-old male APP/PS1 mice were randomly divided into model group, memantine group (3.33 mg/kg), low-, medium- and high-dose Kaixin San (0.33, 1.00, 3.00 g/kg) groups. C57BL/6J mice with the same genetic background of same month age were used as control group and control administration (Kaixin San 1.00 g/kg) group, with eight mice in each group. After continuous ig administration for two months, the learning and memory ability of mice was evaluated by Morris water maze test; Hematoxylin-eosin (HE) staining method was used to observe the neuron morphology in hippocampus CA1 area; Congo red staining was used to detect amyloid plaques expression in cortex and hippocampus; Immunohistochemical staining was used to detect amyloid β protein 1-40 (Aβ1-40), glial fibrillary acidic protein (GFAP) and ionized calcium binding adaptor molecule-1 (Iba-1) expressions in cortex and hippocampus; ELISA was used to detect the levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) and IL-6 in serum and acetylcholine (Ach) level in cortex and hippocampus.Compared with model group, learning and memory ability of mice in memantine group and Kaixin San group was significantly improved (< 0.05, 0.01), number of neurons in hippocampal CA1 area was increased (< 0.01); Expressions of amyloid plaques, Aβ1-40, GFAP and Iba-1 in cortex and hippocampus were significantly reduced (< 0.05, 0.01); Levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in serum were significantly reduced (< 0.05, 0.01); Ach level in cortex was increased (< 0.01).Kaixin San may prevent and treat AD by inhibiting the activation of astrocytes and microglia, decreasing the levels of inflammatory factors TNF-α, IL-6 and IL-1β in serum, reducing the production of Aβ and amyloid plaques, and increasing the content of Ach.

Kaixin San; Alzheimer’s disease; APP/PS1 double transgenic mice; amyloid β protein; glial fibrillary acidic protein; ionized calcium binding adaptor molecule-1

R285.5

A

0253 - 2670(2021)24 - 7511 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.24.013

2021-09-03

北京市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（7182019）

王彬斌，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庴w內(nèi)過程和作用機(jī)制研究。E-mail: missbin1996@163.com

李朝霞，副教授，研究方向?yàn)橹兴庴w內(nèi)過程和作用機(jī)制研究。E-mail: gmacli@ccmu.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]