付 俊，吳美嬋，王書珍，邵秀麗，何 峰，

（1.黃岡師范學院經(jīng)濟林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室,黃岡438000；2.大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,黃岡438000；3.山東中醫(yī)藥大學藥學院,濟南250355）

真菌感染給人類健康帶來重大危害，科學家們一直致力于尋找安全、高效的抗真菌藥物［1~3］.其中精油由于其廣譜抗真菌活性引起了研究人員的極大關注.例如，He等［4］發(fā)現(xiàn)來源于阿舒假囊酵母的精油具有廣譜抗真菌活性；Hu等［5］研究了紫蘇精油抗黃曲霉的作用機制；Diao等［6］通過測定茴香籽精油處理后酵母細胞內(nèi)容物的外泄研究了茴香籽精油對酵母細胞膜破壞作用；Tang等［7］發(fā)現(xiàn)用精油的主要組分香葉醇和檸檬醛處理黃曲霉后，黃曲霉細胞內(nèi)會產(chǎn)生過量的ROS，導致其細胞膜被破壞.這些研究啟發(fā)人們將來源豐富的精油作為天然的抗真菌候選藥物.

菊花中含有多種生物活性物質(zhì)，因此受到了研究人員的廣泛關注［8］.Yang等［9］發(fā)現(xiàn)菊花中的木犀草素可抑制腫瘤細胞生長；He等［10］發(fā)現(xiàn)菊花總黃酮可保護動脈內(nèi)皮細胞免受氧化應激作用；Wu等［11］從菊花中提取的多酚化合物顯示出有效的自由基清除活性；Han等［12］研究了5個菊花品種中的11常見種化合物，結果表明這些化合物具有潛在的抗炎作用；Zhang等［13］發(fā)現(xiàn)菊花對SARS的治療和預防具有抗補體活性.但目前利用菊花精油進行抗真菌研究的報道還較少，特別是專門利用標記法研究精油抗真菌機理的報道更少.

福白菊（Chrysanthemum morifoliumcv.Fubaiju）是湖北省麻城市特產(chǎn)菊花品種，是國家地理標志產(chǎn)品，2020年7月麻城福白菊入選中歐地理標志首批保護清單.本文采用福白菊作為研究對象，通過有機溶劑萃取和水蒸氣蒸餾相結合制備了福白菊精油.分別采用健那綠、細胞膜熒光探針1，1'-雙十八烷基-3，3，3'，3'-四甲基吲哚菁高氯酸鹽（DiI）、碘化丙啶（PI）、羅丹明123和溴化乙錠（EB）等染料標記酵母細胞、酵母細胞膜、核酸線粒體膜以及質(zhì)粒DNA，研究了福白菊精油的抗真菌機理，以便為將植物精油開發(fā)成為天然抗真菌藥物提供理論依據(jù).

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

福白菊（Chrysanthemum morifoliumcv.Fubaiju）采收于湖北省鳳凰山藥業(yè)有限公司福白菊種植基地，標本保藏于黃岡師范學院標本館（保藏編號為HGNU202000366）；抗真菌實驗所用的指示菌為釀酒酵母（Saccharomyce scerevisiaeATCC 9080，S.cerevisiae），購于上海魯微科技有限公司；染料健那綠（純度≥98%）、細胞膜紅色熒光探針DiI（純度≥98%）、碘化丙啶（純度98%）和溴化乙錠（純度≥95%）購于上海碧云天生物技術有限公司；熒光染料羅丹明123（純度≥95%）購于福州飛凈生物科技有限公司；其它化學試劑均為分析純，購于上海麥克林生化科技有限公司.

CX 41型熒光顯微鏡和CX41型高清顯微鏡，日本Olympus公司；A1 MP STORM型多光子-共聚焦顯微鏡，日本Nikon公司.

1.2 福白菊精油的制備

采集含苞待放的菊花花蕾進行冷凍干燥，再用粉碎機將干燥后的花蕾粉碎.以正己烷為溶劑，將菊花花蕾與正己烷按質(zhì)量比1∶4進行萃取，萃取時間3 h，期間適當振蕩.抽濾得到萃取液，原料部分再利用正己烷進行第二次和第三次萃取，合并所有萃取液進行減壓蒸餾，濃縮后得到粗制毛油.利用水蒸汽對粗制毛油進行蒸餾，得到油-水混合物.將油-水混合物在低溫條件下離心后，收集油層，然后用無水亞硫酸鈉進行脫水，得到福白菊精油，置于棕色瓶中于4℃下避光保存.

1.3 抗真菌機理研究

釀酒酵母具有真核細胞生命活動最基本的特征，常作為研究真核生物的模式生物.本文選用釀酒酵母為對象，使用健那綠、DiI、PI、羅丹明123和EB等染料來研究福白菊精油對釀酒酵母的抗真菌機理.

將指示菌釀酒酵母接種于滅菌的液體培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)10 h，離心收集培養(yǎng)的指示菌液，用磷酸鹽緩沖液（PBS緩沖液，pH=7.2）洗滌3次并制備成懸浮液，最終獲得細胞密度為106CFU/mL的酵母菌懸液.

取3份1 mL酵母菌懸液于Eppendorf管中，分別加入0，10和20 μL福白菊精油，于30℃黑暗條件下孵育1 h.各管中均加入10 μL健那綠染料，于30℃黑暗條件下孵育過夜.培養(yǎng)后，洗去染料和精油，將10 μL酵母菌懸液均勻涂覆于載玻片上，采用高清顯微鏡觀察樣品中釀酒酵母細胞的顏色變化來確定福白菊精油對酵母是否具有殺滅作用［14］.

利用DiI直接標記酵母細胞膜，研究福白菊精油對細胞膜的破壞作用.取3份1 mL酵母菌液于Eppendorf管中，分別加入10 μL DiI染料，于30℃黑暗條件下孵育過夜.分別加入0，10和20 μL福白菊精油，于30℃黑暗條件下孵育1 h.洗去染料和精油，將10 μL酵母菌懸液均勻涂覆于載玻片上，利用多光子-共聚焦顯微鏡觀察釀酒酵母溶液熒光強度變化，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為549和565 nm［15］.

利用PI標記酵母細胞膜被破壞后泄露的核酸，參照文獻［16］方法進一步研究福白菊精油對酵母細胞膜的破壞作用.利用多光子-共聚焦顯微鏡觀察時的激發(fā)和發(fā)射波長分別為535和615 nm［16］.

參照文獻［17］方法，利用羅丹明123標記研究福白菊精油對酵母線粒體膜的作用，利用多光子-共聚焦顯微鏡觀察時的激發(fā)和發(fā)射波長分別為488和528 nm［17］.

向4個Eppendorf管中分別加入5 μL質(zhì)粒（PCAMBIA1303）和15 μL TE緩沖液［20 mmol/L Tris和2 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA，pH=8.0）］，然后向每個管中加入2 μL福白菊精油和1 μL EB溶液，混合均勻后于28℃下孵育3 h.將每個管中的樣品點樣在1.2%瓊脂糖凝膠上，電泳30 min（28℃，10 V），觀察各泳道中不同條帶的位置，以確定精油對質(zhì)粒DNA的破壞作用［18］.以DNA marker、未處理的環(huán)形質(zhì)粒樣品和環(huán)形質(zhì)粒用內(nèi)切酶（Bam HI，0.1 mg/mL）處理后的樣品分別作為對照.

2 結果與討論

2.1 精油的制備

以福白菊為原料提取出的淡黃色福白菊精油具有濃郁的、獨特的菊花香味，產(chǎn)率為（0.64±0.2）%，高于神龍架產(chǎn)的野菊花精油（產(chǎn)率0.43%）［19］，也高于西班牙產(chǎn)的菊花精油（產(chǎn)率0.1%）［20］.

2.2 抗真菌機理

2.2.1 基于健那綠標記的福白菊精油對酵母的殺滅作用利用健那綠標記時精油對酵母的殺滅作用如圖1所示.健那綠能夠標記正常的酵母細胞［圖1（B）］，隨著對酵母處理的精油量增加，健那綠標記顏色變淺［圖1（C）］，甚至完全消失［圖1（D）］，與未標記的酵母之間沒有明顯差異［圖1（A）］.健那綠是專一性的活細胞線粒體染料，與線粒體中有活性的細胞色素C氧化酶（COX）結合后，可保持氧化狀態(tài)，呈現(xiàn)藍綠色；而死亡細胞中COX失活，健那綠則被還原，呈現(xiàn)無色.在本文中，隨著處理酵母的精油量增加，健那綠標記顏色變淺，甚至完全消失，說明精油對酵母的殺滅作用隨著濃度的增加而增強，最終導致細胞死亡［14］.

Fig.1 Effect of Fubaiju essential oil on S.cerevisiae according to Jana green labeling

2.2.2 基于DiI標記的福白菊精油對酵母細胞膜的破壞作用利用DiI標記時精油對酵母細胞膜的破壞作用如圖2所示，其中圖2（A）~（C）為明視場條件下觀察的酵母細胞，圖2（D）~（F）為熒光條件下觀察的酵母細胞，圖2（A）和（D），（B）和（E），（C）和（F）中酵母位置分別一一對應.DiI是一種親脂性的細胞膜探針，與細胞膜的親和力高，進入細胞膜之前熒光非常弱.進入細胞后DiI與完整細胞磷酯雙層膜結合后，可逐漸擴散至整個細胞膜，發(fā)出強烈的橙紅色熒光.當細胞膜被破壞后，DiI從磷酯雙層膜上脫落，進入水中，熒光變?nèi)?因此，DiI的熒光強弱可反映細胞膜破壞程度［21］.從圖2可以看出，經(jīng)DiI標記但未經(jīng)福白菊精油處理的正常酵母細胞幾乎每個細胞都散發(fā)出熒光［圖2（D）］，表明DiI能正常標記細胞膜完整的酵母.利用10 μL/mL福白菊精油處理經(jīng)DiI標記的酵母細胞后，部分細胞的熒光消失［圖2（E）］，表明當酵母被精油處理后，一部分細胞膜被破壞，DiI從細胞膜上脫落，熒光減弱.利用20 μL/mL福白菊精油處理經(jīng)DiI標記的細胞后，幾乎所有細胞的熒光消失［圖2（F）］，表明當精油作用增強時，細胞膜幾乎全部被破壞，DiI從細胞膜上完全脫落，酵母的熒光幾乎完全消失.實驗結果表明，酵母的細胞膜是福白菊精油抗菌作用的靶點之一.

Fig.2 Effects of Fubaiju essential oil on cell membrane of S.cerevisiae according to DiI labeling

2.2.3 基于PI標記法的福白菊精油對酵母細胞膜的破壞作用利用PI標記時精油對釀酒酵母細胞膜的破壞作用如圖3所示，其中圖3（A）~（C）為明視場條件下觀察的酵母細胞，圖3（D）~（F）為熒光條件下觀察的酵母細胞，圖3（A）和（D），（B）和（E），（C）和（F）中酵母位置分別一一對應.PI是一種紅色熒光染料，常用于核酸標記.PI不能通過完整的細胞膜，但能穿過破損的細胞膜并與核酸結合后發(fā)出熒光，可利用PI的熒光強弱判斷細胞膜被破壞后核酸泄露的程度［22］.從圖3可以看出，未經(jīng)精油處理的酵母細胞無熒光［圖3（D）］，說明細胞完整，PI未能穿過細胞膜與核酸結合.當酵母被10 μL/mL精油處理后，發(fā)出少量熒光［圖3（E）］，說明部分細胞的細胞膜被精油破壞，PI與細胞中泄露的核酸結合，發(fā)出熒光.當精油濃度增加到20 μL/mL時，幾乎每個細胞都發(fā)出熒光［圖3（F）］，說明此時幾乎所有酵母的細胞膜都被破壞，PI與細胞中泄露的核酸結合，精油對酵母細胞膜的破壞作用隨著福白菊精油濃度增加而加強.實驗結果進一步表明酵母的細胞膜是福白菊精油抗真菌作用的靶點之一.

Fig.3 Effects of Fubaiju essential oil on cell membrane of S.cerevisiae according to PI labeling

2.2.4基于羅丹明123標記的福白菊精油對酵母線粒體膜的破壞作用精油對釀酒酵母線粒體膜的破壞作用如圖4所示，其中圖4（A）~（C）為明視場條件下觀察的酵母細胞，圖4（D）~（F）為熒光條件下觀察的酵母細胞，圖4（A）和（D），（B）和（E），（C）和（F）中酵母位置分別一一對應.羅丹明123是一種檢測線粒體膜電位的熒光探針，進入正常細胞線粒體基質(zhì)后熒光強度降低或消失，但線粒體膜被破壞后，羅丹明123從線粒體基質(zhì)中釋放，發(fā)出黃綠色熒光［18］.從圖4可以看出，經(jīng)羅丹明123標記但未經(jīng)福白菊精油處理的正常酵母細胞無熒光，說明羅丹明123進入細胞的線粒體基質(zhì)后熒光消失［圖4（D）］.當酵母被10 μL/mL精油處理后，發(fā)射出較弱的黃綠色熒光［圖4（E）］，說明部分細胞的線粒體膜被破壞，羅丹明123從線粒體基質(zhì)中釋放.當精油濃度增加到20 μL/mL時，發(fā)射出強的黃綠色熒光［圖4（F）］，說明幾乎所有酵母的線粒體膜均被破壞，羅丹明123從線粒體基質(zhì)中釋放出來.實驗結果表明酵母的線粒體是福白菊精油抗真菌作用的靶點之一.Guimar?es等［23］和Xu等［24］認為精油中親脂性萜類和萜烯類化合物快速插入細胞膜、線粒體膜的膜系統(tǒng)后，由于其疏水性引起膜滲透性增加，破壞膜結構，使膜內(nèi)容物泄漏，導致菌體死亡.福白菊精油中含有大量的萜類和萜烯類化合物，這可能是其破壞真菌細胞膜、線粒體的原因.

Fig.4 Effect of Fubaiju essential oil on mitochondrial membrane of S.cerevisiae according to rhodamine 123 labeling

Fig.5 DNA destruction assay by Fubaiju essential oil according to EB labeling

2.2.5 基于EB標記法的福白菊精油對酵母DNA的破壞利用EB標記時，福白菊精油對酵母DNA的破壞作用如圖5所示.泳道1和泳道2分別表示DNA marker和環(huán)形質(zhì)粒pCAMBIA1303，泳道3是環(huán)形質(zhì)粒pCAMBIA1303被Bam-HI內(nèi)切酶酶切后的線形質(zhì)粒，泳道4~7為環(huán)形質(zhì)粒pCAMBIA1303被福白菊精油處理過的電泳結果，泳道4~7是平行樣.經(jīng)福白菊精油處理后，環(huán)形pCAMBIA1303形成大小不一的片段.有的片段在泳道中移動得快，說明環(huán)形pCAMBIA130可能被精油破壞成線性片段；有的片段在泳道中移動得慢，說明環(huán)形pCAMBIA130可能被精油改變了結構，使其在電泳作用下移動得慢.這些結果表明，DNA可能是福白菊精油作用靶點之一.Chung等［16］發(fā)現(xiàn)韓茵陳（Artemisia iwayomogi）精油的主要成分Vulgarone B與PBR322質(zhì)粒結合后會改變其結構，使其比原PBR322質(zhì)粒更大，電泳作用下移動得慢.福白菊精油中含有類似于Vulgarone B的物質(zhì)［25］，但精油與DNA分子之間如何相互作用還有待于進一步研究.

3 結 論

福白菊精油的抗真菌機理是通過多途徑、多靶點實現(xiàn)的.它不僅能破壞細胞膜，使細胞內(nèi)含物外泄；還能夠穿過細胞膜后破壞線粒體膜，破壞DNA，最終導致細胞死亡.不同于抗生素的抗菌作用位點單一而容易產(chǎn)生耐藥性，福白菊精油的多重作用機制可能使真菌不易對其產(chǎn)生耐藥性，這為植物精油作為天然抗真菌藥物的開發(fā)提供了新的思路.