趙歡歡，李存玉，金 紅

（復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院,上海200032）

蛋白質(zhì)磷酸化是生物體內(nèi)廣泛存在的最重要的共價(jià)修飾方式之一.細(xì)胞內(nèi)有30%以上的蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化修飾［1］.蛋白質(zhì)磷酸化是指蛋白質(zhì)在磷酸化激酶的催化下將三磷酸腺苷（ATP）或三磷酸鳥(niǎo)苷（GTP）上的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基上的可逆過(guò)程.激酶誘導(dǎo)蛋白質(zhì)磷酸化，磷酸酶誘導(dǎo)蛋白質(zhì)去磷酸化，這一可逆過(guò)程能調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能，參與各種生理和病理過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、發(fā)育分化、細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及腫瘤發(fā)生等生命活動(dòng).因而，基于質(zhì)譜的磷酸化研究在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的作用尤為重要［2，3］.

磷酸化蛋白豐度較低，因此在質(zhì)譜鑒定前通常需要進(jìn)行磷酸化肽段富集步驟.目前常用的富集方法［4］包括強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜（SCX）、固相金屬離子親和色譜（IMAC）、金屬氧化物親和色譜（MOAC）以及免疫吸附（利用抗體特異性富集酪氨酸磷酸化肽段）等，其中應(yīng)用最廣泛的是IMAC［5~7］和MOAC［8~10］.但是，每種方法對(duì)樣品磷酸化蛋白組的覆蓋度都是有限的，有研究［11］比較了不同的磷酸肽富集方法，包括磷酸酯化學(xué)、IMAC和TiO2色譜，結(jié)果顯示每種方法分離出的磷酸化蛋白質(zhì)組是不同的、只有部分重疊，這意味著目前沒(méi)有任何單獨(dú)的一種富集方法能夠全面地分析磷酸化蛋白質(zhì)組.然而，定量分析磷酸化蛋白質(zhì)組的必要前提是分離出磷酸化蛋白或磷酸化肽，理想的方法是無(wú)偏向地分離出樣品中所有的磷酸化肽，且重現(xiàn)性和特異性高.盡管分離磷酸化蛋白和磷酸化肽的方法已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展［12~17］，但具備上述理想性質(zhì)的技術(shù)尚未開(kāi)發(fā)出來(lái).

為了獲得盡可能全面的磷酸化蛋白質(zhì)組，需要使用互補(bǔ)的方法來(lái)完成富集.Thingholm等［18］開(kāi)發(fā)了MOAC與IMAC相結(jié)合的磷酸肽富集方法，提高了富集磷酸化肽段的選擇性和靈敏度.此后，IMAC和MOAC的順序洗脫富集方法（SIMAC，Sequential elution from IMAC）在各種大規(guī)模的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中獲得了廣泛應(yīng)用［19~21］.Sun等［22］通過(guò)在復(fù)雜生物樣品中添加磷酸肽標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試了SIMAC方法的重復(fù)性和線性，結(jié)果顯示SIMAC方法對(duì)大多數(shù)磷酸肽只有有限的線性和重復(fù)性，可能是每個(gè)生物樣品單獨(dú)富集時(shí)由磷酸化富集方法本身引入的差異，或是電離過(guò)程中不同磷酸化肽的電離水平不同引起的，也可能是由兩者結(jié)合導(dǎo)致的.為了避免多次富集可能引入的差異，近年來(lái)多使用等重標(biāo)記技術(shù)定量磷酸化蛋白質(zhì)組，用等重同位素標(biāo)記不同組的肽段，將其混合后再進(jìn)行磷酸化富集，不同組的樣品得以同步完成磷酸化富集.然而，由于磷酸化肽段豐度極低，如需深度挖掘還要在LC-MS/MS分析前使用液相色譜對(duì)標(biāo)記或者富集后的肽段混合物進(jìn)行組分分離以降低樣本復(fù)雜度［23，24］，同時(shí)對(duì)樣本需求量也較大.

本文旨在開(kāi)發(fā)能夠靈敏、高效、全面地定量磷酸化蛋白質(zhì)組的技術(shù)，在SIMAC的基礎(chǔ)上探索了另一種順序組合的富集方法SMOAC（Sequential enrichment of MOAC）.考慮到大規(guī)模磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用中，樣品需求量大以及分別富集引入的差異等問(wèn)題，我們將SMOAC與等重同位素標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，對(duì)各個(gè)樣品酶解后的肽段進(jìn)行等重同位素標(biāo)記，然后混合，再用SMOAC富集磷酸化肽段.這不僅減少了樣品的需求量，避免了多個(gè)樣品因多次富集引入的差異，也減少了磷酸化肽段的損失，提高了富集效率，從而實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的磷酸化蛋白質(zhì)差異定量分析.紫草素能抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)紫草素處理后的HepG2細(xì)胞中磷酸化蛋白的表達(dá)有變化［25］.本文將SMOAC結(jié)合TMT-10PLEX試劑等量標(biāo)記的方法對(duì)經(jīng)紫草素處理的及正常的人肝癌HepG2細(xì)胞進(jìn)行磷酸化差異蛋白分析，以研究方法的可行性，并探索了樣品經(jīng)SMOAC富集后獲得單磷酸化肽和多磷酸化肽段的最優(yōu)采集方式.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

人肝癌HepG2細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)）；紫草素（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eagle medium）、胎牛血清（FBS）、胰酶、青鏈霉素混合液（PS）、甲酸（FA，質(zhì)譜純）、0.5 mol/L三（2-羧乙基）膦還原劑（TCEP）、1 mol/L四乙基溴化銨（TEAB）和蛋白酶及磷酸酶抑制劑混合物［Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail（100×）］均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)自Adamas試劑有限公司；尿素（Urea，分析純）、十二烷基硫酸鈉（SDS）和碘乙酰胺（IAA）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氟乙酸（TFA）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；乙腈（ACN，質(zhì)譜純）和甲醇購(gòu)自德國(guó)Merck公司.

MilliQ超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；C18除鹽柱（美國(guó)Waters公司）；C18反相色譜柱、High-Select?TiO2Phosphopeptide Enrichment Kit（TiO2磷酸化肽段富集試劑盒）、High-Select?Fe-NTA Phosphopeptide Enrichment Kit（Fe-NTA磷酸化肽段富集試劑盒）、TMT10plex?Isobaric Label Reagent Set（同位素標(biāo)記試劑）、-80℃超低溫冰箱、Easy-nLC1200型超高效液相色譜儀及Thermo Scientific?Orbitrap Exploris 480型質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）.

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及給藥人肝癌HepG2細(xì)胞株經(jīng)復(fù)蘇后加入DMEM培養(yǎng)基（10%FBS+1%PS）中，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng).取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)：0.25%胰酶消化、細(xì)胞計(jì)數(shù)，并取細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔1×105個(gè)，然后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng).當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)開(kāi)始給藥處理.實(shí)驗(yàn)設(shè)置正常對(duì)照組（C1~C6）和處理組（T1~T6），每組6個(gè)復(fù)孔，處理組加入紫草素（終濃度為10×10-6mol/L），正常對(duì)照組加入等量的空白培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗2次，細(xì)胞沉淀于-80℃保存，備用.

1.2.2 細(xì)胞蛋白質(zhì)提取、酶解及標(biāo)記與C18除鹽向每管HepG2細(xì)胞沉淀中加入8 mol/L Urea+0.1%SDS（質(zhì)量/體積）并混合均勻，所用裂解液中包含Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail（100×），置于冰上裂解30 min，裂解產(chǎn)物于低溫下以12000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min.對(duì)上層清液采用二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)定蛋白濃度.根據(jù)BCA所測(cè)濃度每個(gè)樣品取100 μg蛋白溶液，各加入0.5 mol/L TCEP（終濃度10×10-3mol/L），于37℃孵育1 h進(jìn)行還原反應(yīng)；避光加入1 mol/L IAA（終濃度40×10-3mol/L），于室溫避光靜置45 min進(jìn)行烷基化反應(yīng)；然后，加入6倍體積于-20℃預(yù)冷的丙酮沉淀4 h，以低溫12000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min后去掉上層清液；將沉淀用預(yù)冷的90%丙酮清洗2遍，高速離心后去掉上層清液，待沉淀表面液體揮發(fā)后用100 μL 0.1 mol/L TEAB溶解蛋白沉淀；按胰蛋白酶與蛋白質(zhì)量比1∶25加入胰蛋白酶，于37℃反應(yīng)過(guò)夜.

從低溫冰箱里取出2組六標(biāo)TMT試劑（126，127N，127C，128N，128C和131），室溫下平衡10 min后每管加入41 μL質(zhì)譜純乙腈混合均勻使其溶解，按表1所示分別加入到相應(yīng)的2組酶解肽段中，室溫下反應(yīng)2 h；每管中加入8 μL 5%羥胺于室溫下孵育30 min以終止標(biāo)記反應(yīng)；2組均取等量標(biāo)記肽段混合凍干.

Table 1 TMT reagents of the corresponding samples

用600 μL 0.1%TFA復(fù)溶凍干的2組已標(biāo)記肽段；用1 mL甲醇活化C18柱，1 mL 0.1%TFA平衡柱子；將復(fù)溶的標(biāo)記肽段上樣到平衡好的C18柱上；用0.1%TFA清洗3次后，依次用300 μL 140%ACN+0.1%TFA，300 μL 60%ACN+0.1%TFA洗脫肽段；將2次洗脫液合并混合均勻后凍干，待磷酸化富集實(shí)驗(yàn).

1.2.3 SMOAC法磷酸化肽富集SMOAC連續(xù)富集法分為MOAC富集和IMAC富集2步，依次使用TiO2磷酸化富集試劑盒及Fe-NTA磷酸化富集試劑盒完成.MOAC富集：取TiO2小柱用洗滌緩沖液清洗1次，再用結(jié)合/平衡緩沖液平衡1次；將1.2.2節(jié)標(biāo)記后脫鹽凍干的肽段混合物用結(jié)合/平衡緩沖液重新溶解，轉(zhuǎn)移到平衡過(guò)的TiO2小柱內(nèi)以1000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min以結(jié)合磷酸肽，離心得到的流穿液再轉(zhuǎn)移到TiO2小柱內(nèi)重復(fù)結(jié)合1次，收集流穿液；之后依次用結(jié)合/平衡緩沖液、洗滌緩沖液、質(zhì)譜純水洗滌TiO2小柱，收集這3種清洗液，并與流穿液合并、凍干；分2次用50 μL磷酸化肽段洗脫緩沖液從洗滌過(guò)的TiO2小柱中洗脫出與TiO2結(jié)合的磷酸化肽（TiO2洗脫液），并立即進(jìn)行真空離心凍干.IMAC富集：取Fe-NTA樹(shù)脂柱用試劑盒里的結(jié)合/洗滌緩沖液清洗平衡2次；將上述經(jīng)TiO2富集后的流穿餾分和清洗餾分合并凍干，之后重新溶解于結(jié)合/洗滌緩沖液中，并轉(zhuǎn)移到平衡過(guò)的Fe-NTA樹(shù)脂柱中，室溫下孵育30 min后以1000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 s；用結(jié)合/洗滌緩沖液洗滌Fe-NTA樹(shù)脂柱3次，再用質(zhì)譜純水洗滌1次；分2次用100 μL磷酸化肽段洗脫緩沖液從洗滌過(guò)的樹(shù)脂柱中洗脫出磷酸化肽段（Fe-NTA洗脫液），立即進(jìn)行真空離心凍干.

需要特別注意的是，2次富集用到的緩沖液來(lái)源于各自的試劑盒，不能混用.該富集實(shí)驗(yàn)采用1.2.2節(jié)的2組標(biāo)記肽段平行進(jìn)行2組，其中一組將2次洗脫下來(lái)的磷酸化肽段合并后進(jìn)行質(zhì)譜分析，另一組分別進(jìn)行質(zhì)譜分析.另外，為了盡量確保2組分析的上樣量一致，前者合并后取一半進(jìn)行質(zhì)譜分析，后者全部進(jìn)行質(zhì)譜分析.

1.2.4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析經(jīng)富集后的磷酸化肽段用Thermo Scientific?Easy-nLC1200型超高效液相色譜儀與Orbitrap Exploris 480型高分辨質(zhì)譜儀聯(lián)用進(jìn)行LC MS/MS實(shí)驗(yàn).

色譜條件：C18反相色譜柱（75 μm×500 mm，2 μm，10 nm）；流動(dòng)相：A相為0.1%FA水溶液，B相為80%ACN+0.1%FA溶液；流速300 nL/min；洗脫梯度：0~170 min，2%~20%B；170~174 min，20%~30%B；174~175 min，30%~100%B；175~180 min，100%B.

質(zhì)譜條件：正離子模式檢測(cè)；一級(jí)質(zhì)譜分辨率120 K，采集的質(zhì)量掃描范圍為m/z400~1600；采集模式為數(shù)據(jù)依賴(lài)采集，Normalized AGC target（%）設(shè)為300，Maximum injection time設(shè)為50×10-3s，檢測(cè)的肽段所帶電荷數(shù)為2~5，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間20 s；二級(jí)分辨率30 K，Normalized AGC target（%）設(shè)為100，Maximum injection time 50×10-3s，二級(jí)碎裂模式HCD.

1.2.5 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Proteome Discoverer 2.4（Thermo Fisher Scientific）內(nèi)嵌（Sequest HT）軟件進(jìn)行分析，以Swiss Prot_human為數(shù)據(jù)庫(kù)搜庫(kù).搜庫(kù)參數(shù)：peptide mass tolerance=10×10-6；enzyme=trypsin；fragment mass tolerance=0.02 u；固定修飾（Fixed modification）：TMT6plex（N-term），Carbamidomethyl（C），TMT6plex（K）；可變修飾（Variable modification）：oxidation（M），acetyl（protein N-term），deamidated（NQ），phosphorylation（S/T/Y）；漏切上限（Max missed cleavage）設(shè)為2；Site probabilities＞75；蛋白假陽(yáng)性率（False discovery rate，F(xiàn)DR）設(shè)為1%.

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

磷酸化是細(xì)胞內(nèi)最常見(jiàn)的共價(jià)修飾方式之一，在各種生理和病理過(guò)程中起到重要作用.磷酸化肽段豐度低，不易檢出；同時(shí)非磷酸化肽的存在會(huì)抑制磷酸肽的電離，影響其信號(hào).因此，在質(zhì)譜分析之前必須要從肽段中分離出磷酸化肽.目前已開(kāi)發(fā)出的多種磷酸化富集方法對(duì)磷酸化肽段的富集都有一定的選擇性和偏向性，沒(méi)有任何單獨(dú)的一種方法能夠全面地分離出所有的磷酸化肽.為了提高磷酸化肽段的回收率，盡可能全面地獲得樣品中的磷酸化肽，本文探索了一種連續(xù)互補(bǔ)的富集方法SMOAC來(lái)富集磷酸化肽.同時(shí)，考慮到常規(guī)的磷酸化起始富集需要1 mg的蛋白起始量，為了減少樣品需求量，也為了避免每個(gè)樣品分別富集引入的差異，本文結(jié)合TMT等重標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)，將待分析的各個(gè)樣品等重標(biāo)記并混合后進(jìn)行富集（具體實(shí)驗(yàn)流程如圖1）.對(duì)6例經(jīng)紫草素處理的和6例未經(jīng)處理的正常人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，每個(gè)取100 μg蛋白進(jìn)行還原、烷基化后，分2組（每組3例紫草素處理組+3例正常對(duì)照組）用TMT試劑標(biāo)記，分別混合后進(jìn)行脫鹽、凍干處理.凍干后的肽段先經(jīng)過(guò)TiO2富集，收集洗脫液，即富集后的肽段，流穿液和清洗液凍干后再用Fe-NTA進(jìn)行第二次磷酸化肽富集，收集洗脫液.為了更完整地評(píng)價(jià)SMOAC方法，找到獲得其質(zhì)譜數(shù)據(jù)最有效的分析方式，將2組等量的標(biāo)記肽段混合物同時(shí)進(jìn)行2組SMOAC富集，每組各有2種洗脫液（TiO2洗脫液和Fe-NTA洗脫液），分3次進(jìn)行LC-MS/MS分析：一組的2種洗脫液?jiǎn)为?dú)分析（圖1中①和②），另一組的2種洗脫液合并后一起分析（圖1中③）.為了保證2組的上樣量一致，前者全部用來(lái)質(zhì)譜分析，后者合并后取一半進(jìn)行質(zhì)譜分析；為了減少樣品損失，同時(shí)更充分地鑒定磷酸化肽，我們采用3 h長(zhǎng)梯度進(jìn)行LC-MS/MS分析，分別用Proteome Discoverer 2.4軟件檢索，對(duì)比2種分析方式，探索酶解肽段經(jīng)SMOAC富集后采集磷酸化肽的有效方式.

Fig.1 Flow chart of analysis

2.2 TiO2洗脫液與Fe-NTA洗脫液鑒定結(jié)果分析

從TiO2洗脫液中共鑒定到2467個(gè)磷酸化蛋白上7445條磷酸化肽段，肽段特異性約為97%，其中單磷酸化肽段占57.6%，雙磷酸化肽占31.4%，三磷酸化肽占11.0%.從二次富集的Fe-NTA洗脫液中共鑒定到3604個(gè)磷酸化的蛋白上11297條磷酸化肽段，肽段特異性約為87%，其中單磷酸化肽段占98.3%，雙磷酸化肽占1.0%，三磷酸化肽占0.1%（圖2）.

Fig.2 Analysis results of the amount of peptides identified from TiO2 eluate and Fe eluate by LC?MS

由于連續(xù)富集的2次洗脫液中磷酸化肽段存在交蓋（占總磷酸化肽段的22.1%），故共鑒定到3946個(gè)磷酸化蛋白上15349條磷酸化肽段，其中有52%的總磷酸化肽段是只在二次富集的Fe-NTA洗脫液中鑒定到的，而只在首次富集的TiO2洗脫液中鑒定到的磷酸化肽僅占26.4%，單磷酸化肽中有64%是只在Fe-NTA洗脫液中鑒定到的，占單磷酸化肽總數(shù)的50%以上，而大部分多磷酸化肽是從首次富集的TiO2洗脫液中鑒定到的；TiO2洗脫液與Fe-NTA洗脫液共鑒定到磷酸化蛋白3946個(gè)，其中交蓋的蛋白約占54%，只在Fe-NTA洗脫液中鑒定到的約占總鑒定量的37.5%（圖3）.

Fig.3 Analysis results of the overlap of peptides and proteins identified from TiO2 eluate and Fe?NTA eluate by LC?MS

以上結(jié)果說(shuō)明了在處理高度復(fù)雜的混合物時(shí)分析這些通常被丟棄的部分（流穿液和清洗液）的重要性.肽段混合物經(jīng)TiO2富集后會(huì)有一些未能結(jié)合在TiO2上的磷酸化肽段或結(jié)合不緊密的磷酸化肽段存在于流穿液或清洗液中，將其凍干后再用Fe-NTA進(jìn)行二次富集，可有效減少磷酸化肽的損失，提高磷酸化肽富集的特異性及鑒定的靈敏度.雖然這種連續(xù)富集的策略（SMOAC）需要1次額外的富集步驟，但是工作量遠(yuǎn)比將肽段混合物分餾后再進(jìn)行多次磷酸肽富集的工作量要低得多.總之，在分析復(fù)雜生物樣品的磷酸化蛋白質(zhì)組過(guò)程中，SMOAC是一種快速簡(jiǎn)便且高效的方法，可顯著提高大規(guī)模定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的水平.

2.3 兩次洗脫液合并質(zhì)譜分析與分別質(zhì)譜分析結(jié)果比較

2.3.1 磷酸化肽段及位點(diǎn)比較如圖4所示，將2次洗脫液合并進(jìn)行質(zhì)譜分析與分別進(jìn)行質(zhì)譜分析相比，鑒定到的總磷酸化肽段數(shù)提高了6%，單磷酸化肽段占所有肽段的比例提高14%，但多磷酸化肽段比例降低了7%.2次洗脫液合并分析鑒定到的總磷酸化肽段較多，說(shuō)明TiO2洗脫液和Fe-NTA洗脫液中有一些共有的磷酸化肽段，由于豐度較低，在分別分析時(shí)未能被質(zhì)譜檢測(cè)到，將2次洗脫液合并后信號(hào)強(qiáng)度提高而被質(zhì)譜檢測(cè)到；鑒定到的單磷酸化占比提高，表明合并后磷酸化信號(hào)強(qiáng)度的升高主要得益于單磷酸化肽段豐度的提高；而多磷酸化肽大多數(shù)在TiO2洗脫液中鑒定到，合并質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)其比例反而降低，可能是由于單磷酸肽強(qiáng)度的升高使得其對(duì)多磷酸化肽電離化的抑制作用增強(qiáng)［18，26］，從而降低了被質(zhì)譜檢測(cè)到的機(jī)會(huì).綜上，SMOAC的2次洗脫液合并分析得到的總磷酸化肽段更多，分別分析得到的多磷酸化肽更多.

Fig.4 Comparison of the amount of phosphopeptides identified from two types of analysis

2.3.2 磷酸化蛋白鑒定及定量比較2次洗脫液分別分析定量得到3946個(gè)磷酸化蛋白（FDR<1%），占總鑒定量的91.4%；合并分析定量得到4263個(gè)磷酸化蛋白（FDR<1%），占總鑒定量的90.3%.這說(shuō)明SMOAC能夠有效富集TMT標(biāo)記的磷酸化肽段，利用TMT等重標(biāo)記技術(shù)結(jié)合SMOAC富集技術(shù)實(shí)現(xiàn)磷酸化蛋白質(zhì)組的高通量定量是可行的.即使是低于1 mg的少量生物樣本，該策略也能對(duì)其磷酸化蛋白質(zhì)組進(jìn)行全面的定量分析，也說(shuō)明將2次洗脫液合并進(jìn)行質(zhì)譜分析得到的磷酸化蛋白更多.

2.4 組內(nèi)重復(fù)標(biāo)記間相關(guān)性分析

由于在樣品前處理過(guò)程中標(biāo)記肽段的混合發(fā)生在比較早的階段（富集和質(zhì)譜分析之前），因此，等量標(biāo)記最重要的優(yōu)點(diǎn)之一是提高了實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性.為了評(píng)價(jià)SMOAC富集TMT標(biāo)記肽段這一流程的可重復(fù)性，分析了對(duì)照組和處理組組內(nèi)重復(fù)通道間的信號(hào)強(qiáng)度.經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索后，將1個(gè)通道中的lg Abundances與另一個(gè)重復(fù)通道中的lg Abundances進(jìn)行了對(duì)比.如圖5所示，組內(nèi)各2個(gè)重復(fù)間磷酸化蛋白的強(qiáng)度非常好地相關(guān)（R＞0.95），表明標(biāo)記肽段用SMOAC方法富集以后出現(xiàn)的變化較小，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好.

Fig.5 Scatterplots reflecting correlation of protein abundances in technical replicates

2.5 差異磷酸化蛋白結(jié)果分析

采用Student’s T-test，以磷酸化蛋白質(zhì)在經(jīng)紫草素處理的及正常的HepG2細(xì)胞中表達(dá)含量作為參考，在SMOAC 2次洗脫液合并分析的數(shù)據(jù)中找出具有顯著差異的磷酸化蛋白1961種（以P<0.05，表達(dá)量±20%為差異［27，28］），其中上調(diào)1397種，下調(diào)564種.

Fig.6 Scatter plot of enriched KEGG pathways statistics

為了鑒定經(jīng)紫草素處理后細(xì)胞中涉及的信號(hào)通路，使用DAVID軟件對(duì)鑒定到的差異表達(dá)的磷酸化蛋白進(jìn)行KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，京都基因與基因組百科全書(shū)）信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)定量到的差異磷酸化蛋白在32種KEGG通路中顯著富集（P≤0.05，表S1，見(jiàn)本文支持信息）.圖6示出了前10個(gè)富集通路，主要包括DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、核糖體生成、蛋白酶體、剪接體和mRNA監(jiān)視通路等，意味著紫草素可能主要通過(guò)影響遺傳物質(zhì)的生成來(lái)抑制HepG2細(xì)胞的增殖及生長(zhǎng)，與已有研究結(jié)果相符［25］.

綜上所述，為尋找快速、簡(jiǎn)便且能夠全面定量磷酸化蛋白質(zhì)組的技術(shù)，提出了一種靈敏、高效、高通量定量磷酸化蛋白質(zhì)組的策略：TMT10-plex標(biāo)記定量技術(shù)結(jié)合連續(xù)互補(bǔ)的磷酸化肽富集法SMOAC.結(jié)果表明，SMOAC能夠有效富集TMT10-plex標(biāo)記的磷酸化肽段，包括多磷酸化肽和單磷酸化肽；并且其特異性強(qiáng)、靈敏度高、工作量少，不需要將混合的標(biāo)記肽段分餾后多次富集，只需要一次額外的富集步驟；即使是低于1 mg的少量復(fù)雜生物樣本，也能對(duì)其差異表達(dá)的磷酸化蛋白進(jìn)行相對(duì)全面的定量分析.將該策略與高精度高靈敏度質(zhì)譜儀結(jié)合，可使每組樣品只需要3 h質(zhì)譜分析時(shí)間即能識(shí)別大量的磷酸化位點(diǎn)，極大提高了磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的定量水平.此外，實(shí)驗(yàn)使用6個(gè)TMT試劑標(biāo)記了處理組與對(duì)照組各3例樣品的肽段，實(shí)現(xiàn)了1次SMOAC富集加1次質(zhì)譜分析同時(shí)分析定量6個(gè)生物樣品磷酸化蛋白質(zhì)組的目的.如果用TMTpro 16-plex標(biāo)記試劑（美國(guó)Thermo Scientific），最多可一次性分析16個(gè)樣本，由于富集前需要將標(biāo)記肽段全部混合，每個(gè)樣品只需要50 μg就能得到理想的效果.該策略為標(biāo)準(zhǔn)化磷蛋白質(zhì)組標(biāo)記定量技術(shù)提供了參考.

感謝復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院公共技術(shù)平臺(tái)蛋白質(zhì)子平臺(tái)周新文老師和劉曉慧老師分別在質(zhì)譜采集和報(bào)告撰寫(xiě)方面提供的幫助.

支持信息見(jiàn)http：//www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20210406.