劉 菲,張晨曦,張苗苗,孫小莉,韓晨博,王 佳

(1.寶雞市婦幼保健院病理科,陜西 寶雞 721000；2.寶雞市婦幼保健院綜合外科,陜西 寶雞 721000；3.西安市人民醫(yī)院病理科,陜西 西安 710000)

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)在甲狀腺癌中最為常見。隨著外科技術(shù)及放化療技術(shù)的發(fā)展,PTC患者的10年生存率可達74%～95%,但是復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移仍然是PTC患者死亡的主要原因[1]。因此,尋找潛在的PTC分子生物學(xué)標志物是臨床及基礎(chǔ)研究的重點。

prospero相關(guān)同源異形盒蛋白1(prospero-related homeobox 1,PROX1)是果蠅的同源異型盒基因prospero在哺乳動物中的同源框基因轉(zhuǎn)錄因子,在淋巴管的形成和發(fā)育中發(fā)揮重要作用[2]。越來越多的研究證實,PROX1在腦膠質(zhì)母細胞瘤、乳腺癌和肝細胞癌等腫瘤組織中高表達,并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3-5]。Notch1是PROX1下游的信號通路[6],在PTC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[7]。TPC-1是甲狀腺乳頭狀癌細胞,在PTC體外研究中應(yīng)用廣泛[8]。為了探索PROX1在PTC中的表達及意義,本研究檢測PTC細胞系TPC-1、BCPAP、K1、IHH4中PROX1的表達,利用RNA干擾技術(shù)抑制TPC-1細胞中PROX1的表達,觀察TPC-1細胞增殖、侵襲、凋亡及Notch1信號通路相關(guān)蛋白表達水平的變化。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

PTC細胞系BCPAP、TPC-1、K1、IHH4和正常甲狀腺濾泡上皮細胞系Nthy-ori-3-1均購于中科院上海細胞庫,DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購于南京生航生物技術(shù)有限公司,質(zhì)粒由上海吉凱基因科技有限公司設(shè)計并提供,LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購于美國Promega公司,CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒和Transwell小室均購于上海滬震實業(yè)有限公司,PROX1、hes1、hes5、NICD和GAPDH抗體均購于美國Sigma公司。儀器：IX71型倒置顯微鏡(奧林巴斯,日本)、680型酶標儀(Bio-Rad,美國)、AlphaImager Mini型凝膠成像儀(ProteinSimple,美國)、FACSCanto Ⅱ型流式細胞儀(BD,美國)。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將BCPAP、TPC-1、K1、IHH4、Nthy-ori-3-1細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于5% CO2、37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達80%時進行傳代,取5～15代對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。將TPC-1細胞隨機分為NC-siRNA組和PROX1-siRNA組，用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染NC-siRNA和PROX1-siRNA。NC-siRNA序列：5’-GGACGGGAAGUUAGACAAAGA-3’；PROX1-siRNA序列：5’-GGAAGUUAGACAAAGAUGAGA-3’。轉(zhuǎn)染步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3 Western blot檢測PROX1、hes1、hes5、NICD蛋白表達水平

轉(zhuǎn)染48 h后用RAPI裂解液提取總蛋白,10% SDS-PAGE分離蛋白,用半干轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h,加入PROX1(1∶500)、hes1(1∶1 000)、hes5(1∶1 000)、NICD(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)一抗,4 ℃孵育過夜,次日除去一抗,用TBST緩沖液洗滌3次后加入二抗(羊抗兔,1∶500),封閉1 h。最后用ECL法顯色,凝膠成像系統(tǒng)拍照,用Image J軟件分析灰度值。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖能力

轉(zhuǎn)染48 h后取對數(shù)生長期細胞,接種于96孔板。待細胞貼壁后,分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和96 h時加入10 μL CCK-8溶液,孵育2 h后用酶標儀檢測光密度OD值,檢測細胞增殖能力。設(shè)置5個復(fù)孔。

1.5 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力

在Transwell小室的上室鋪基質(zhì)膠,隨后將TPC-1細胞接種于24孔板,以2×105/mL密度將細胞加入上室,每孔加量100 μL；下室中加入培養(yǎng)基,每孔加量250 μL。待細胞貼壁后更換上室培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用無菌棉簽拭去小室濾膜上的細胞,甲醛固定15 min,HE染色,光鏡下統(tǒng)計膜背面侵襲的細胞數(shù)。設(shè)置5個復(fù)孔。

1.6 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力

取轉(zhuǎn)染后細胞,以5×104個/孔密度將TPC-1細胞接種于6孔板,當細胞融合度達90%時,用無菌槍頭進行劃痕處理,隨后置于無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)0 h、24 h時用顯微鏡拍照,并計算細胞遷移率,細胞遷移率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%[8]。設(shè)置5個復(fù)孔。

1.7 Annexin V-FITC/PI流式細胞術(shù)檢測凋亡細胞

取轉(zhuǎn)染后細胞,用500 μL預(yù)冷1×結(jié)合緩沖液將其制成1×106/mL的懸液。加入5 μL異硫氰基熒光素,混勻后孵育10 min。隨后加入2.5 μL碘化丙啶孵育5 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。設(shè)置5個復(fù)孔。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PROX1在PTC細胞系中的表達

與正常甲狀腺濾泡上皮細胞系Nthy-ori-3-1比較,PTC細胞系TPC-1、BCPAP、K1和IHH4中PROX1蛋白表達水平明顯較高(F=36.989,P<0.05),其中TPC-1最高,見圖1。

*：與Nthy-ori-3-1比較,P<0.05

2.2 沉默PROX1基因?qū)PC-1細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響

與NC-siRNA組比較,PROX1-siRNA組PROX1蛋白表達水平較低(t=19.012,P<0.05),48 h、72 h和96 h時細胞增殖活力OD值較低(t=6.034,P<0.05),侵襲細胞數(shù)較少(t=10.012,P<0.05),細胞遷移率較低(t=6.783,P<0.05),細胞凋亡率較高(t=7.783,P<0.05),見圖2。

a：Western blot檢測細胞中PROX1蛋白表達水平；b：CCK-8法檢測細胞增殖能力；c：Transwell實驗檢測細胞侵襲能力(HE染色,×100)；d：Annexin V-FITC/PI流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡；e：細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 *：與PROX1-siRNA組比較,P<0.05

2.3 沉默PROX1基因?qū)PC-1細胞Notch1信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

與NC-siRNA組比較,PROX1-siRNA組hes1(t=6.781,P<0.05)、hes5(t=4.290,P=0.05)和NICD(t=8.342,P<0.05)蛋白表達水平較低,見圖3。

*：與NC-siRNA組比較,P<0.05

3 討論

PROX1在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[9-11],但其作用機制尚未完全明確。有研究顯示,PROX1可以結(jié)合并抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-14的表達,從而促進肝細胞癌的血管生成和腫瘤侵襲[12]。PROX1還能夠促進核小體重塑,形成去乙?；笍?fù)合物,進而促進結(jié)直腸癌細胞的增殖[6]。另外,PROX1與免疫炎癥損傷密切相關(guān)[13]。還有研究顯示,PROX1高表達于淋巴管內(nèi)皮細胞,進而參與腫瘤淋巴管新生和淋巴轉(zhuǎn)移[13-14]。PROX1在甲狀腺濾泡狀癌和髓樣癌中高表達[15-16],但PROX1在PTC中的表達以往少有報道。因此,本研究檢測PTC細胞系TPC-1、BCPAP、K1、IHH4中PROX1的表達,探討PROX1在PTC中的表達及意義。

本研究結(jié)果顯示,與正常甲狀腺濾泡上皮細胞系Nthy-ori-3-1比較,PTC細胞系TPC-1、BCPAP、K1和IHH4中PROX1蛋白表達水平明顯較高。沉默PROX1表達后TPC-1細胞的增殖、侵襲、遷移均受到抑制,且細胞凋亡率升高,說明PROX1可能作為促癌基因在PTC中發(fā)揮作用。Notch1信號通路在甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用,其可通過DLL4參與PTC腫瘤血管生成,并通過激活MAPK信號通路促進PTC癌細胞的增殖和侵襲[17-18]。Notch1是PROX1的下游信號通路[6]，抑制TPC-1細胞中Notch1的表達可以明顯抑制PTC細胞的增殖、侵襲和遷移[18-19]。本研究結(jié)果顯示,沉默PROX1基因可以明顯抑制Notch1信號通路相關(guān)蛋白hes1、hes5和NICD的表達,提示沉默PROX1基因可能通過抑制Notch1信號通路抑制TPC-1細胞的增殖、侵襲、遷移,并促進其凋亡。

綜上所述,PROX1在PTC細胞中高表達,可能成為PTC的分子生物學(xué)標志物。本研究也存在一些局限性,如未檢測PTC組織及血清中PROX1的表達,未分析PROX1與PTC臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系,未來需要進一步分析PTC組織中PROX1的表達及其臨床意義。