洪 玥，陳友霞，劉珍珍，林 琳，張?zhí)礻?yáng)，高春燕

（大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院, 云南大理 671000）

肝臟是機(jī)體最主要的代謝、排泄和解毒器官，具有分泌膽汁、解毒、凝血、免疫等重要生理功能[1?3]。外環(huán)境中的藥物、酒精、病毒、化學(xué)試劑等極易導(dǎo)致肝損傷的發(fā)生，且各種因素導(dǎo)致的肝損傷常伴有氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等[4?7]。四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）所致肝損傷的表現(xiàn)及發(fā)展與許多人類(lèi)肝臟疾病類(lèi)似，常被用于肝損傷的病理研究和保肝藥物的開(kāi)發(fā)[8]。

咖啡酸（caffeic acid，CA）廣泛存在于植物中，是一種安全、無(wú)毒害的天然化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抑菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性，在降低細(xì)菌致病力和抗藥性等方面也有很高的應(yīng)用價(jià)值[9?12]。已有研究表明，CA的抗氧化活性主要源于其強(qiáng)大的還原能力和淬滅自由基的能力，它可通過(guò)抑制肝細(xì)胞氧化應(yīng)激來(lái)改善肝微循環(huán)障礙和肝細(xì)胞損傷[13?14]。氧化應(yīng)激與肝損傷的病理進(jìn)程密切關(guān)聯(lián)，而Nrf2/ARE是重要的抗氧化應(yīng)激信號(hào)通路，激活該信號(hào)通路的傳導(dǎo)對(duì)抑制肝損傷的發(fā)展具有重要作用[15?16]，但CA在CCl4肝細(xì)胞損傷模型中對(duì)抗氧化通路激活作用的研究鮮有報(bào)道。

采用CCl4誘導(dǎo)BRL大鼠肝細(xì)胞損傷模型，以CA進(jìn)行干預(yù)，測(cè)定大鼠肝細(xì)胞的生化指標(biāo)、活性氧（ROS）、細(xì)胞色素 C（Cyt c）、8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-OHdG）水平和部分抗氧化基因的mRNA表達(dá)情況，從氧化應(yīng)激和激活Nrf2/ARE信號(hào)通路的角度探討CA對(duì)CCl4損傷BRL大鼠肝細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制，為肝損傷的靶向治療提供分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

BRL大鼠肝細(xì)胞 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）美國(guó) Gibco公司；青霉素-鏈霉素溶液（100×）、胰酶細(xì)胞消化液、杜氏磷酸鹽緩沖液（D-PBS） 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；四氯化碳 分析純，山東佰仟化工有限公司；活性氧（ROS）試劑盒、細(xì)胞色素C（Cyt c）和 8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-OHdG）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所；Trizol A+總RNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；iScript? Select cDNA 合成試劑盒、Ssoadvanced?SYBR? Green Supermix 美國(guó) Bio-rad 公司。

MDF-382E(N) 超低溫冰箱 日本SANYO公司；RCO3000T-5-VBC型二氧化碳培養(yǎng)箱 美國(guó)REVCO公司；ClassⅡType A2生物安全柜 美國(guó)LABCONCO公司；CKX41SF 倒置顯微鏡、BX53倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司；SP-Max3500FL多功能熒光酶標(biāo)儀 上海閃譜生物科技有限公司；7180全自動(dòng)生化分析儀 日本Hitachi公司；Micro 21R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó) Thermo Fisher 公司；高通量組織研磨儀 美國(guó)MP Biomedicals公司；NP80 Touch 超微量核酸蛋白測(cè)定儀 德國(guó)Implen公司；CFX96 Touch熒光定量PCR儀 美國(guó)Bio-rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 以 DMEM完全培養(yǎng)液（10% 胎牛血清+1% 雙抗）培養(yǎng)BRL大鼠肝細(xì)胞，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組分為對(duì)照組、CCl4模型組（100 mmol/L CCl4損傷 3 h）和 CA干預(yù)組（含 0.2、0.4和 0.8 mg/mL CA 的 DMEM 溶液預(yù)處理 4 h，再行 CCl4暴露 3 h）。

1.2.2 CA對(duì) CCl4所致 BRL大鼠肝細(xì)胞損傷 AST、ALT和LDH活力的測(cè)定 以5×104/mL的細(xì)胞密度接種于 24孔培養(yǎng)板，每孔 500 μL，于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，樣品干預(yù)組每孔加入750 μL 濃度為 0.2、0.4 和 0.8 mg/mL 的 CA 溶液，對(duì)照組和模型組每孔加入等體積的完全培養(yǎng)液代替樣品溶液。置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，模型組和樣品干預(yù)組每孔加入CCl4染毒液200 μL，對(duì)照組加入等體積的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定AST、ALT和LDH的活力。

1.2.3 CA對(duì) CCl4所致BRL大鼠肝細(xì)胞損傷 ROS、Cyt c和8-OHdG水平的測(cè)定 以5×104/mL的細(xì)胞密度接種于 6孔培養(yǎng)板，每孔 2 mL，于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48 h后，樣品干預(yù)組每孔加入 3 mL 濃度為 0.2、0.4 和 0.8 mg/mL 的樣品工作液，對(duì)照組和模型組每孔加入等體積的完全培養(yǎng)液代替樣品溶液。于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，模型組和CA干預(yù)組每孔加入CCl4染毒液800 μL，對(duì)照組加入等體積的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。

將ROS各處理組的其中一個(gè)培養(yǎng)板于倒置熒光顯微鏡下觀察拍照，另一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板參照ROS試劑盒說(shuō)明書(shū)，收集并重懸細(xì)胞，稀釋調(diào)整細(xì)胞濃度，加入DCFH-DA探針、孵育、洗滌、重懸，使用多功能熒光酶標(biāo)儀測(cè)定OD值（激發(fā)波長(zhǎng)500 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm），結(jié)果以對(duì)照組為1（對(duì)照組OD值/對(duì)照組OD值），其他組用相對(duì)比值表示（處理組OD值/對(duì)照組OD值）。

各處理組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，棄上清液，收集細(xì)胞，通過(guò)反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞[17?18]，離心取上清液。按照Cyt c和8-OHdG酶聯(lián)免疫檢測(cè)劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定OD值，結(jié)果以各組OD值與對(duì)照組OD值的相對(duì)比值表示。運(yùn)用ELISAcalc軟件，選擇Logistic曲線(xiàn)（四參數(shù)）擬合模型，得Cyt c標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)四參數(shù)擬合方程為 Y=(A?D)/[1 + (X/C)B]+D，A=1.1690，B=1.6028，C=251.7827，D=0.0387，R2=0.9983；8-OHdG 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)四參數(shù)擬合方程為Y=(A?D)/[1+(X/C)B]+D，A=1.1579， B=0.6719， C=10.3982， D=?0.3350，R2=0.9998。

1.2.4 損傷抗氧化基因mRNA水平檢測(cè) 細(xì)胞處理同1.2.3，采用試劑盒提取不同實(shí)驗(yàn)組BRL大鼠肝細(xì)胞的總RNA，RNA純度=A260/A280，范圍在1.8~2.1之間說(shuō)明RNA純度較高，可以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄[19?20]。根據(jù) Bio-radiScript Select cDNA 合成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，設(shè)計(jì)引物及合成（見(jiàn)表1）。使用BioradSsoadvancedTMSYBR Green Supermix 試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 測(cè)定，程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min →（95 ℃ 10 s → 60 ℃ 30 s）×40 個(gè)循環(huán)。以β-actin 作為內(nèi)參對(duì)照，根據(jù)各基因的 Ct值，按 2?ΔΔCt法計(jì)算mRNA 相對(duì)表達(dá)量[21?22]。

表 1 qRT-PCR 引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件和ELISAcalc軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間均數(shù)的兩兩比較采用LSD法檢驗(yàn)，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 CA對(duì)CCl4損傷BRL大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)液上清中AST、ALT和LDH活力的影響

由表2可知，CCl4模型組BRL大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的AST、ALT和LDH活力較對(duì)照組分別升高了 277.18%、99.40% 和 100.82%（P<0.01）。與模型組相比，隨著CA預(yù)處理濃度的升高，BRL大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)液上清中AST活力下降了19.64%~35.90%，ALT活力下降了15.02%~45.05%，LDH活力下降了14.09%~27.99%。這表明CA能夠有效抑制CCl4所致的AST、ALT和LDH活力的異常升高，保護(hù) CCl4所致肝細(xì)胞損傷的發(fā)生，且隨著CA濃度的提高，保護(hù)作用增強(qiáng)。

表 2 咖啡酸對(duì) CCl4 損傷 BRL 大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)液上清中AST、ALT和LDH活力的影響Table 2 Effect of caffeic acid on the AST, ALT and LDH activities in the supernatant of BRL hepatocyte injured by CC14

2.2 CA對(duì)CCl4損傷BRL大鼠肝細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

如圖1所示，與對(duì)照組相比，CCl4處理組大鼠肝細(xì)胞中綠色熒光顯著增強(qiáng)，說(shuō)明細(xì)胞中ROS水平明顯升高。與模型組相比，各干預(yù)組細(xì)胞中二氯熒光黃（dichlorofluorescein，DCF）熒光強(qiáng)度明顯減弱。由圖2可知，CCl4處理組大鼠肝細(xì)胞中ROS水平是對(duì)照組的132.33倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；而經(jīng)CA預(yù)處理后再行CCl4暴露的細(xì)胞中ROS水平較模型組均顯著降低（P<0.01），且隨著CA干預(yù)濃度的升高分別降低了47.28%、93.84% 和97.75%。

2.3 CA對(duì)CCl4損傷BRL大鼠肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中Cyt c水平的影響

如圖3所示，CCl4模型組的大鼠肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中Cyt c含量是對(duì)照組的3.92倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；相較于 CCl4模型組，0.2 mg/mL的CA 溶液干預(yù)效果不顯著（P>0.05），而 0.4 mg/mL和 0.8 mg/mL CA干預(yù)組BRL大鼠肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中Cyt c含量分別下降了50.52%和57.99%（P<0.01）。

Cyt c可直接參與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也可通過(guò)擾亂呼吸鏈中的電子傳遞、促進(jìn)ROS生成和阻斷能量合成等途徑在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮作用[23]。正常狀態(tài)下，Cyt c在線(xiàn)粒體的內(nèi)膜和外膜之間，不會(huì)透過(guò)外膜進(jìn)入到胞漿中。當(dāng)細(xì)胞受到不良刺激時(shí)，ROS的過(guò)量產(chǎn)生可使線(xiàn)粒體通透性增加，同時(shí)膜電位的崩潰以及線(xiàn)粒體腫脹、破裂的發(fā)生都將促使Cyt c釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[24]。

2.4 CA對(duì)CCl4損傷BRL大鼠肝細(xì)胞質(zhì)中8-OHdG含量的影響

如圖4所示，CCl4模型組的大鼠肝細(xì)胞中8-OHdG含量是對(duì)照組的9.64倍，差異性顯著（P<0.01），表明在CCl4的損傷作用下，大鼠肝細(xì)胞發(fā)生了明顯的氧化損傷。相較于 CCl4模型組，0.2、0.4和0.8 mg/mL CA樣品干預(yù)組的細(xì)胞中8-OHdG含量分別降低了49.79%、72.20% 和83.20%（P<0.01）。

圖 1 咖啡酸對(duì) CCl4 損傷 BRL 大鼠肝細(xì)胞胞內(nèi) ROS 水平的影響 （200×）Fig.1 Effect of caffeic acid on intracellular ROS levels of CCl4-injured BRL hepatocyte (200 ×)

圖 2 咖啡酸對(duì) CCl4 損傷 BRL 大鼠肝細(xì)胞胞內(nèi)ROS水平的影響Fig.2 Effect of caffeic acid on intracellular ROS levels of CCl4-injured BRL hepatocyte

圖 3 咖啡酸對(duì) CCl4 損傷 BRL 大鼠肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中Cyt c水平的影響Fig.3 Effect of caffeic acid on the cytoplasm Cyt c level of CCl4-injured BRL hepatocyte

圖 4 咖啡酸對(duì) CCl4 損傷 BRL 大鼠肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中8-OHdG含量的影響Fig.4 Effect of caffeic acid on cytoplasm 8-OHdG content of CCl4-injured BRL hepatocyte

8-OHdG與多種氧化損傷疾病具有關(guān)聯(lián)性，是最常采用的氧化應(yīng)激敏感指標(biāo)和DNA損傷標(biāo)志物[25]。正常條件下機(jī)體可對(duì)DNA氧化損傷進(jìn)行修復(fù)，然而當(dāng)損傷超出自身修復(fù)能力或修復(fù)機(jī)制異常時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致8-OHdG堆積，進(jìn)而引發(fā)致畸、致癌、致突變等損傷效應(yīng)[26]。

2.5 CA對(duì)CCl4損傷BRL大鼠肝細(xì)胞抗氧化基因mRNA水平的影響

如圖5所示，與對(duì)照組細(xì)胞相比，CCl4模型組細(xì)胞中Nrf2、GSR、NQO1和SOD基因的 mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著變化（P>0.05）。經(jīng)0.2、0.4和0.8 mg/mL的CA預(yù)處理后再行CCl4暴露的各組細(xì)胞中Nrf2、GSR、NQO1和SOD的mRNA表達(dá)水平較模型組顯著升高（P<0.05）。隨著CA預(yù)處理濃度的升高，Nrf2的 mRNA表達(dá)水平分別為模型組的 2.61、3.51倍和4.52倍；GSR的mRNA表達(dá)水平分別為模型組的1.69、2.41倍和2.98倍；NQO1的mRNA表達(dá)水平分別為模型組的3.57、5.58倍和8.01倍；SOD的mRNA表達(dá)水平分別為模型組的2.12、2.31倍和4.04倍。且各基因的mRNA表達(dá)水平隨CA預(yù)處理濃度的增加而逐漸上升。

圖 5 咖啡酸對(duì) CCl4 損傷 BRL 大鼠肝細(xì)胞 Nrf2、GSR、NQO1和SOD基因mRNA水平的影響Fig.5 Effect of caffeic acid on mRNA levels of Nrf2, GSR,NQO1 and SOD in CCl4-injured BRL hepatocyte

Nrf2是機(jī)體重要的抗氧化調(diào)節(jié)因子，活化的Nrf2能夠促進(jìn)抗氧化酶的表達(dá)，清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的ROS，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[27?28]。大量研究表明，Nrf2/ARE通路是機(jī)體抗氧化應(yīng)激的重要通路，在抗炎、抗凋亡、抗細(xì)胞損傷等方面也發(fā)揮著重要作用[29]。本研究結(jié)果顯示，CCl4損傷的大鼠肝細(xì)胞中Nrf2水平并未提高，而經(jīng)CA預(yù)處理后再行CCl4染毒的各組細(xì)胞中Nrf2、GSR、NQO1和SOD基因的mRNA表達(dá)水平均顯著升高，表明CA對(duì)BRL大鼠肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用與激活Nrf2/ARE信號(hào)通路有關(guān)。

3 討論與結(jié)論

CCl4所致的肝細(xì)胞損傷與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，而CA可有效抑制CCl4損傷的BRL大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)液中AST、ALT和LDH活力的升高，抑制細(xì)胞內(nèi)ROS、Cyt c和8-OHdG水平的異常升高，上調(diào)Nrf2、GSR、NQO1和SOD基因表達(dá)。其作用機(jī)制可能是通過(guò)直接增強(qiáng)大鼠肝細(xì)胞清除自由基的能力或上調(diào)細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)水平，激活Nrf2/ARE抗氧化通路，調(diào)節(jié)多個(gè)抗氧化基因的表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄水平上提高細(xì)胞的抗氧化防御能力，從而減少氧化損傷。這與SU等[30?33]的研究結(jié)果一致，即酚類(lèi)化合物可通過(guò)激活Nrf2/ARE信號(hào)通路啟動(dòng)抗氧化機(jī)制，從而提高抗氧化基因或蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化作用。該研究結(jié)果為CA的保肝作用機(jī)制提供了一定的理論依據(jù)，但抗氧化相關(guān)蛋白表達(dá)情況以及Nrf2通路的激活機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。