高永強 施鵬偉 師文楷 劉一鳴

1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院口腔牙周科，鄭州450052；2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科，鄭州450052；3.鄭州大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科，鄭州450052

口腔癌是全球常見的惡性腫瘤之一，口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是其常見的病理類型，約占所有口腔癌的90%[1]。全世界每年新發(fā)超過30萬的OSCC患者，且OSCC整體5 年死亡率達到48%[2]。目前，手術、化療和放療是OSCC 重要的治療手段，但患者在5 年內(nèi)的生存率仍不理想。研究顯示，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA） 的異常表達與OSCC發(fā)生發(fā)展和預后不良有關[3-5]。lncRNA HCG-22 （HLA complex group 22） 是常見lncRNAs 的一種，已被報道在食管鱗癌和膀胱癌等組織中特異性表達下調(diào)且發(fā)揮一定抑癌作用，被認為是潛在的治療新靶點[6-7]。近年來，有學者[8]利用基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO） 和腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA） 分析發(fā)現(xiàn)HCG22在口腔癌的診斷和預后方面顯示出優(yōu)越的潛力，但HCG22 在OSCC 中的表達和作用機制并不完全清楚。本研究通過檢測OSCC組織和細胞中HCG22的表達情況，分析HCG22表達與OSCC患者預后的關系，并探討HCG22表達對OSCC細胞系增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化的作用及可能機制，以期為OSCC 診療提供新線索。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 組織標本的獲取 收集2017 年9 月—2018 年9 月于鄭州大學第一附屬醫(yī)院行手術切除的68 例OSCC患者的癌組織樣本及相應的癌旁組織（距離腫瘤2～3 cm） 標本。納入標準：1） 病理診斷為OSCC；2） 接受手術且術前未接受任何治療；3）有完整的臨床病理資料；4） 無感染性疾病及其他系統(tǒng)腫瘤等。其中，男性36 例，女性32 例，年齡27～80 歲，中位年齡58 歲；獲取的新鮮組織標本立即放入液氮中保存。對所有參與者術后進行隨訪，隨訪截止時間為2020 年9 月。本研究的開展經(jīng)患者或家屬知情同意，并已獲得鄭州大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.1.2 其他實驗材料 人OSCC 細胞株SCC-25、HN13、HSC-3 （上海素爾生物科技有限公司） 和CAL-27 （湖南豐暉生物科技有限公司），人正?？谇唤琴|永生化細胞株HOK、pcDNA3.1-HCG22 過表達載體質粒和pcDNA3.1 空載體質粒（上海雅吉生物科技有限公司），RPMI1640 培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、脂質體3000、甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 試劑盒、逆轉錄試劑盒和Transwell 小室（北京索萊寶生物科技有限公司），AnnexinV-APC/7-AAD 細胞凋亡檢測試劑盒（上海鈺博生物科技有限公司），微小RNA-650（microRNA-650，miR-650） 模擬物（mimics） 及其陰性對照mimics-NC （廣州銳博生物科技有限公司），上皮細胞鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏著蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin） 和磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase， GAPDH） 抗體（Abcam 公司，英國），37XC 型倒置顯微鏡（上海光學儀器廠），iMark 型酶標儀和CFX96 型實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR） 儀（Bio-Rad公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、轉染和分組處理 HSC-3和CAL-27 細胞采用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，而HOK、SCC-25和HN-13細胞采用含10% 胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，均置于溫度為37 ℃、5%CO2和濕度飽和的培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)。將對數(shù)期SCC-25 和HSC-3 細胞種植到6 孔板上，培養(yǎng)至70% 融合度時，按照脂質體3000 使用說明進行瞬時轉染；其中，將轉染pcDNA3.1-HCG22過表達載體質粒的SCC-25 和HSC-3 細胞作為HCG22 組，轉染pcDNA3.1 空載體質粒的SCC-25 和HSC-3 細胞作為空載體組，并以正常培養(yǎng)不做轉染的細胞作為對照組，每組均設3個重復。

1.2.2 RT-qPCR 檢測OSCC 組織和細胞中HCG22及miR-650 表達 按照Trizol 試劑使用說明提取待測組織樣品或細胞的總RNA，測定RNA 純度與濃度后，使用逆轉錄試劑盒將RNA 合成單鏈cDNA。取2 μL cDNA 作為模板，加入10 μL SYBR Green Mix、0.5 μL 上游引物、0.5 μL 下游引物和7 μL ddH2O 制備20 μL 熒光定量體系；將其上樣至RTqPCR 儀上后，在設定的程序（95 ℃3 min；95 ℃20 s、60 ℃30 s、72 ℃30 s，循環(huán)40 次） 下進行PCR 擴增。以GAPDH 或U6 為內(nèi)參照，2-ΔΔCt法計算組織樣品或細胞中HCG22 及miR-650 表達水平。其中，聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR） 引物序列（上海生工生物工程股份有限公司）如下。HCG22 上游引物序列：5’-ACAGCAGTGAAACCCACCA-3’，下游引物序列：5’-GAAGCCCAATCCAACAAAGAGC-3’； miR-650 上游引物序列：5’-AGGAGGCAGCGCTCTC-3’，下游引物序列：5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’；GAPDH上游引物序列：5’-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3’，下游引物序列：5’-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3’；U6 上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3’，下游引物序列：5’-TTTGCGTGTCATCCTTGCG-3’。

1.2.3 MTT 法檢測SCC-25 和HSC-3 細胞增殖活力 將對數(shù)期的SCC-25 和HSC-3 細胞種植到96 孔板上后，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)至65%～75% 融合度時按照1.2.1 中的方法進行轉染；在轉染0、24、48、72 和96 h 時，按照MTT 試劑盒說明書以酶標儀于450 nm 處檢測SCC-25 和HSC-3 細胞的光密度（optical density，OD） 值。

1.2.4 流式細胞儀檢測SCC-25 和HSC-3 細胞凋亡率 以預冷的磷酸緩沖液重懸收集到的SCC-25 和HSC-3 細胞后，1000 r·min-1離心5 min；以結合緩沖液調(diào)整細胞后，取100 μL 細胞液（含105個細胞） 于流式管中，分別加入AnnexinV-APC 5 μL和7-AAD 10 μL，室溫避光孵育5 min 后，上流式細胞儀檢測SCC-25和HSC-3細胞凋亡率。

1.2.5 Transwell 小室實驗檢測SCC-25 和HSC-3 細胞遷移和侵襲能力 收集對數(shù)期的HCG22 組、空載體組SCC-25 和HSC-3 細胞，加入無血清培養(yǎng)基制成濃度為每毫升105個單細胞懸液；取100 μL 細胞液至未處理（觀察遷移） 或經(jīng)Matrigel 膠包被（觀察侵襲） 的Transwell 小室上室中，于24 孔板中加入含血清的培養(yǎng)基600 μL，放入培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)；24 h 后以棉簽拭去小室上室內(nèi)殘留的細胞后，先以甲醇固定細胞25 min，再以0.5% 結晶紫染色10 min。洗滌干燥后，采用倒置顯微鏡觀察拍照并統(tǒng)計穿膜細胞數(shù)。

1.2.6 Western blotting 檢測SCC-25 和HSC-3 細胞上皮間質轉化相關蛋白的表達 按照總蛋白提取試劑盒使用說明提取SCC-25 和HSC-3 細胞的總蛋白后，采用二喹啉甲酸法檢測蛋白的濃度。將變性后的蛋白樣品行電泳分離后，半干法轉膜。脫脂奶粉封膜2 h 后，加入GAPDH （1∶2 000）、Ecadherin （1∶1 000）、N-cadherin （1∶1 000） 和Vimentin （1∶800） 抗體；4 ℃下孵育過夜后，再加入辣根過氧化酶標記的二抗（1∶5 000）；室溫孵育2 h 后，化學發(fā)光劑顯影；采用凝聚成像分析系統(tǒng)分析SCC-25 和HSC-3 細胞中E-cadherin、Ncadherin 和Vimentin 蛋白的表達水平，以GAPDH為內(nèi)參照進行校正。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗檢測HCG22 和miR-650靶向關系 將野生的HCG22及定點突變后的HCG22 序列片段克隆重組至pGL3-Basic-Vector載體質粒上，構建野生型pGL3-HCG22 （HCG22-WT） 和突變型pGL3-HCG22 （HCG22-MUT） 質粒。將HCG22-WT、HCG22-MUT 分別與miR-650 mimics 及mimics-NC 共轉染293T 細胞，轉染48 h后按照雙熒光素酶報告基因實驗檢測試劑盒使用說明檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，以x±s表示計量資料，其中，獨立樣本t檢驗分析兩組間差異，單因素方差分析多組間差異，SNK-q檢驗對組間進一步兩兩比較進行分析；計數(shù)資料采用χ2檢驗分析，并采用Kaplan-Meier 法分析隨訪3 年患者的生存情況；以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HCG22 在OSCC 組織中的表達及與臨床病理特征的關系

RT-qPCR 檢測結果顯示：OSCC 組織中HCG-22 表達水平（0.89±0.21） 較癌旁組織（2.12±0.22）明顯降低（P＜0.05）。以HCG22表達水平中位值為界，將68 例OSCC 組織樣本分為低表達組和高表達組，觀察分析HCG22 表達水平與OSCC 患者臨床病理特征的關系。結果顯示：HCG22 表達水平可能與患者腫瘤大小、TNM 分期、分化程度和淋巴結轉移等密切相關（P＜0.05）（表1）。生存曲線分析結果顯示：截止隨訪，HCG22 低表達組、高表達組患者的總生存率分別為23.25% 和45.27%；與HCG22 高表達組比較，HCG22 低表達組患者總生存率明顯降低（P＜0.05）（圖1）。

表1 HCG22表達與OSCC患者臨床病理特征的關系Tab 1 The relationship between HCG22 expression and clinicopathological features of OSCC patients

圖1 HCG22表達與OSCC患者預后的關系Fig 1 The relationship between HCG22 expression and prognosis of OSCC patients

2.2 HCG22在OSCC中的表達及轉染效果

與人正?？谇唤琴|HOK 細胞比較，OSCC 細胞株HN13、SCC-25、CAL-27 和HSC-3 中HCG22表達水平明顯降低（P＜0.05），且SCC-25和HSC-3細胞相對較低。故選擇SCC-25 和HSC-3 細胞上調(diào)HCG22 的表達進行后續(xù)實驗。將pcDNA3.1-HCG-22 過表達載體轉染至SCC-25 和HSC-3 細胞中，RT-qPCR 檢測結果顯示：與對照組比較，轉染pcDNA3.1空載體后HCG22表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），轉染pcDNA3.1-HCG22 過表達載體組HCG22水平明顯升高（P＜0.05）（圖2）。

圖2 OSCC細胞中HCG22表達水平檢測Fig 2 Detection of HCG22 expression level in OSCC cells

2.3 上調(diào)HCG22表達對OSCC細胞增殖的影響

CCK-8 法檢測結果顯示：與空載體組比較，HCG22組SCC-25細胞和HSC-3細胞增殖活力均明顯降低（P＜0.05）（圖3）。

圖3 上調(diào)HCG22表達對OSCC細胞增殖的影響Fig 3 Effect of up-regulating HCG22 on the proliferation of OSCC cells

2.4 上調(diào)HCG22表達對OSCC細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，與空載體組比較，HCG22組SCC-25細胞和HSC-3細胞的凋亡率均明顯升高（P＜0.05）（圖4）。

2.5 上調(diào)HCG22 表達對OSCC 細胞遷移和侵襲影響

Transwell 小室檢測結果顯示：與空載體組比較，HCG22組SCC-25細胞和HSC-3細胞遷移和侵襲能力明顯減弱（P＜0.05）（圖5）。

圖5 上調(diào)HCG22表達對OSCC細胞遷移和侵襲影響Fig 5 Effects of up-regulating HCG22 on the migration and invasion of OSCC cells

2.6 上調(diào)HCG22 表達對OSCC 細胞上皮間質轉化相關蛋白的影響

Western blotting檢測結果顯示：與空載體組比較，HCG22組SCC-25細胞和HSC-3細胞中上皮間質轉化相關蛋白E-cadherin 表達水平明顯升高，而N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）（圖6）。

圖6 上調(diào)HCG22表達對OSCC細胞上皮間質轉化相關蛋白的影響Fig 6 Effects of up-regulating HCG22 on epithelial mesenchymal transformation related proteins in OSCC cells

2.7 HCG22靶基因預測及其驗證

生物學軟件LncBase Predicted v.2 預測結果顯示：HCG22 和miR-650 之間存在互補的結合位點；雙熒光素酶報告基因實驗檢測結果顯示，轉染miR-650 mimics 可使HCG22-WT 載體的熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05）（圖7A）；RT-qPCR 檢測結果顯示，OSCC 組織中HCG22 和miR-650 表達水平呈負相關性，上調(diào)HCG22表達可引起SCC-25和HSC-3 細胞中miR-650 表達水平降低（P＜0.05）（圖7C）。

圖7 HCG22和miR-650靶向關系的驗證Fig 7 Verification of the targeting relationship between HCG22 and miR-650

3 討論

OSCC是一種好發(fā)于舌、頰和牙齦等部位的惡性腫瘤，有著較高的發(fā)病率和死亡率[9]。目前，手術切除是OSCC治療的主要手段，但部分患者術后易出現(xiàn)復發(fā)和轉移，導致預后不良[10]，其根本原因在于OSCC惡性發(fā)生發(fā)展的機制不夠明確。在人類基因組中，有98% 的RNA 為非編碼RNA，而lncRNAs 在非編碼RNA 中占80～90%；lncRNAs 是一類長度超過200 個堿基的非編碼RNA，在基因的表觀遺傳、基因翻譯、基因轉錄及轉錄后調(diào)控等過程中發(fā)揮著重要作用，廣泛參與了機體的各組生理和病理過程[11]。隨著對OSCC發(fā)生發(fā)展分子機制研究的深入，越來越多的證據(jù)表明OSCC中異常表達的lncRNAs 不僅與患者臨床病理特征關系密切，還可通過調(diào)控miRNA 或者信號通路等多種機制影響腫瘤細胞的生物學行為，發(fā)揮促進或抑制癌癥進展的作用[12-14]；lncRNAs 不僅可作為腫瘤診斷和預后因子，還可作為腫瘤標志物和腫瘤治療的靶點。因此，研究差異性表達的lncRNAs 對OSCC早期診斷和治療具有重要意義。

HCG22 是一種研究相對較少的lncRNA，與人體多種疾病的發(fā)生密切相關。如Yatagai 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，日本人群遲發(fā)性哮喘易感性的增加與HCG-22的變異有關。Jeong等[16]報道指出，HCG22是一種黏蛋白基因，在類固醇誘導的高眼壓發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。除了與哮喘和高眼壓發(fā)生有關外，HCG22 表達異常也被證實與腫瘤的發(fā)生密切相關。Li 等[6]報道指出，HCG22 在食管鱗癌組織中表達下調(diào)，且其表達與分化程度及臨床TNM分期顯著相關；另外，生物功能實驗證實HCG22可以通過靶向調(diào)控ADAMTS12 的表達抑制腫瘤細胞遷移和侵襲。Jiang 等[7]研究指出，HCG-22 在膀胱癌中呈弱表達，且HCG22 低表達與患者低生存率密切相關；細胞水平上也證實HCG22 可通過調(diào)控HuR/PTBP1 軸發(fā)揮抑制癌細胞增殖、遷移和上皮-間充質轉化的作用。盡管，有學者[17]采用GEO數(shù)據(jù)庫及檢測20 例OSCC 組織發(fā)現(xiàn)HCG22 表達下調(diào)，但其在OSCC中的表達及作用機制并不完全清楚。本研究通過檢測OSCC 組織和細胞中HCG22的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)HCG22 在OSCC 中呈低表達狀態(tài)；進一步分析發(fā)現(xiàn)，HCG22 低表達與OSCC患者腫瘤大小、TNM分期、分化程度和淋巴結轉移等密切相關。結果提示，HCG22 可能在OSCC 的惡性進展過程中扮演著重要角色。在具有代表性的SCC-25 和HSC-3 細胞株中進行功能實驗發(fā)現(xiàn)，上調(diào)HCG22表達可抑制SCC-25和HSC-3細胞增殖、遷移、侵襲，誘導細胞凋亡，并可通過上調(diào)上皮間質轉化上皮標志物E-cadherin 和下調(diào)間質標志物N-cadherin、Vimentin 蛋白的表達。因此可見，HCG22 在OSCC 發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著抑癌因子的角色，可能是OSCC診療的潛在靶點。

miRNAs 是一種不同于lncRNAs 的且研究相對較多的短鏈非編碼RNA，其異常表達與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系[18]。研究[19-21]顯示，lncRNAs和miRNA之間存在著相互作用，lncRNAs 可作為 “分子海綿” 靶向調(diào)控miRNA 的表達來發(fā)揮生物學作用。miR-650 是一種與結腸癌、肝癌和非小細胞肺癌等腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關的致癌基因，在腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和上皮間質轉化等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[22-24]。有研究[25]指出，miR-650 在OSCC中表達上調(diào)，且可通過上調(diào)Gfi1 的表達促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究采用生物學軟件對HCG22 潛在靶基因進行預測發(fā)現(xiàn)：HCG22 與miR-650之間存在互補的結合位點，結合上述相關資料最終將miR-650 作為HCG22 的靶向研究對象。檢測結構顯示，miR-650 在OSCC 組織中的表達與HCG22 呈負相關，同時，miR-650 mimics 可使轉染HCG22-WT 質粒細胞的熒光素酶活性降低，而上調(diào)HCG22 表達可降低SCC-25 和HSC-3 細胞中miR-650 表達。因此推測，在OSCC 中HCG22 可直接靶向作用于miR-650，而HCG22 在OSCC 中發(fā)揮抑癌作用的分子機制也可能與對miR-650的調(diào)控有關。

綜上所述，本研究認為HCG22 在OSCC 組織和細胞中低表達，上調(diào)其表達可抑制OSCC細胞的增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化，其作用機制可能與靶向調(diào)控miR-650表達有關。該結果的發(fā)現(xiàn)為進一步探討HCG22 在OSCC 抑癌機制中的作用奠定基礎，也為OSCC 有效診療方案開辟了新的前景。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。