王亞楠 吳旋 賈婷婷 馮瑤 劉世岳 徐欣 張東姣

1.山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院種植科 山東省口腔組織再生重點實驗室山東省口腔生物材料與組織再生工程實驗室，濟(jì)南250012；2.寧波口腔醫(yī)院月湖分院種植科，寧波315000；3.山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院牙周科 山東省口腔組織再生重點實驗室山東省口腔生物材料與組織再生工程實驗室，濟(jì)南250012

腫瘤、感染、創(chuàng)傷和發(fā)育畸形等常導(dǎo)致不同程度的頜面部骨組織缺損，如何實現(xiàn)高效地頜骨骨再生一直是口腔醫(yī)生面臨的難題。多種系統(tǒng)性因素和局部因素可以影響頜骨再生，其中2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM） 是影響頜骨骨再生的危險因素。研究[1-3]表明，T2DM 可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、骨折風(fēng)險的增加和骨折愈合時間的延遲。然而，T2DM對頜骨骨缺損愈合的影響及潛在的分子機(jī)制尚未被完全闡明。

T2DM引發(fā)骨代謝不良的原因主要包括胰島素分泌不足，尿鈣、磷、鎂排出增多，促破骨細(xì)胞因子分泌增多，活性維生素D 減少，糖基化終產(chǎn)物增多等等。近年來，糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥的免疫致病機(jī)制得到越來越多的關(guān)注。研究人員發(fā)現(xiàn)，CD4+T 細(xì)胞中存在一組具有相反調(diào)節(jié)功能的亞群，包括發(fā)揮促炎效應(yīng)的輔助性T 細(xì)胞17 （T helper cell 17，Th17） 和發(fā)揮抑炎效應(yīng)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）。有研究[4]證實，患有T2DM 的人與正常人相比，Th17/Treg 細(xì)胞的外周血比率顯著升高。維持Th17/Treg 細(xì)胞平衡可以很好地維持骨代謝穩(wěn)態(tài)，相反，Th17/Treg 細(xì)胞的失衡則與骨組織破壞顯著相關(guān)[5]。然而，Th17/Treg細(xì)胞平衡在T2DM 導(dǎo)致的下頜骨骨缺損愈合不良過程中的改變?nèi)孕柽M(jìn)一步的研究。

蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型2 （protein tyrosine phosphatase non-receptor type 2，PTPN2） 是蛋白酪氨酸磷酸酶家族的重要成員，又稱作T細(xì)胞蛋白酪氨酸磷酸酶。研究表明，PTPN2 在調(diào)節(jié)糖代謝[6]、抑制系統(tǒng)性炎癥[7]、調(diào)控骨代謝[8]方面發(fā)揮重要作用。PTPN2 可以抑制Th17 細(xì)胞向的分化，抑制白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-17分泌，同時促進(jìn)Treg 細(xì)胞向分化，促進(jìn)IL-10 分泌[9]，但PTPN2在調(diào)節(jié)T2DM 小鼠下頜骨骨缺損愈合過程中Th17/Treg 細(xì)胞平衡中的表達(dá)情況和調(diào)控作用機(jī)制尚未得到全面的解釋。

因此，本文通過建立T2DM 小鼠下頜骨骨缺損模型，觀察T2DM 對小鼠下頜骨骨缺損愈合的影響及骨缺損區(qū)域內(nèi)Th17 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)的改變，并對PTPN2 是否參與此過程的可能性做出初步的探索，以期為T2DM 導(dǎo)致頜骨再生不良的分子機(jī)制研究和頜面部骨修復(fù)治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

36 只6 周齡C57BL/6J 雄性小鼠均購自山東大學(xué)實驗動物中心，所有實驗按照《實驗動物護(hù)理與使用指南》 進(jìn)行，并經(jīng)山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)（NO.20170302）。36 只小鼠隨機(jī)平分為2 組：正常對照（NC 組，n=18） 和2 型糖尿病組（T2DM 組，n=18）。T2DM 組喂養(yǎng)高脂高糖飼料4 周后，腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（30 mg·Kg-1）；NC 組喂養(yǎng)普通飼料4周后，腹腔注射同等劑量檸檬酸鈉緩沖液。分別于小鼠下頜骨骨缺損建模當(dāng)天（0 d） 和術(shù)后7、14、28 d 進(jìn)行空腹血糖的檢測，當(dāng)小鼠空腹血糖高于11.1 mmol·L-1且穩(wěn)定1 周認(rèn)為T2DM 建模成功，可用于后續(xù)實驗。18 只T2DM 組小鼠建模成功后，在小鼠全身麻醉狀態(tài)下，使用慢速手機(jī)于小鼠下頜骨下緣咬肌嵴的遠(yuǎn)中制作貫穿頰舌向的1 mm×1.5 mm 的骨缺損，即構(gòu)建小鼠下頜骨骨缺損模型。愈合7、14、28 d后取材，4%多聚甲醛固定，12%乙二胺四乙酸脫鈣，梯度乙醇脫水，石蠟包埋后進(jìn)行切片檢測。

1.2 主要試劑

STZ 試劑（Sigma 公司，美國），Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 （Runt-related transcription factor 2，RUNX2） 抗體、叉頭框蛋白P3 （forkhead box protein P3，F(xiàn)oxp3） 抗體（Cell Signaling Technology公司，美國），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）抗體、維甲酸相關(guān)孤核受體（retinoic acid related orphan receptor，ROR） γt 抗體、蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型2 （tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 2，PTPN2） 抗體（Abcam公司，英國），蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE） 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），SP-9000 免疫組織化學(xué)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（3,3’-diaminobenzidine，DAB） 顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 HE染色

NC 組和T2DM 組小鼠下頜骨缺損部位的石蠟切片經(jīng)過二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，蘇木素染色2 min，流水沖洗7 min；伊紅溶液染色4 min，流水沖洗3 min；梯度乙醇脫水，二甲苯透明后使用中性樹膠封片。使用光學(xué)顯微鏡（Olympus 公司，日本） 于10 倍物鏡下觀察小鼠下頜骨缺損部位的新骨形成情況。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

為了觀察T2DM 小鼠下頜骨缺損愈合過程中Th17/Treg 細(xì)胞平衡的改變情況，并進(jìn)一步地探討可能的原因，本研究通過免疫組織化學(xué)染色的方法對NC 組和T2DM 組小鼠下頜骨缺損組織內(nèi)Treg細(xì)胞分化依賴的特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3、Th17 細(xì)胞分化所需的特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt 以及在Th17/Treg 細(xì)胞平衡調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用的蛋白PTPN2的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測。

NC 組和T2DM 組小鼠下頜骨缺損部位的石蠟切片經(jīng)過二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，胰酶抗原修復(fù)后，使用山羊血清封閉劑封閉30 min，滴加ALP 抗體（1∶300）、 RUNX2 抗體（1∶250）、Foxp3 抗體（1∶200）、RORγt 抗體（1∶200） 或PTPN2 抗體（1∶300），4 ℃過夜。次日復(fù)溫后，分別滴加生物素化二抗和酶結(jié)合物于37 ℃條件下孵育25 min，DAB 溶液顯色20～30 s，蘇木素溶液復(fù)染1 min，流水沖洗7 min。切片梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。ALP 和PTPN2 的免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度由單位面積內(nèi)積分光密度值（integrated optical density/area， IOD/area） 衡量；RUNX2、Foxp3 和RORγt 的免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度由40倍物鏡視野下的陽性細(xì)胞數(shù)衡量，使用Image-J軟件軟件進(jìn)行定量分析。

1.5 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均以至少3 個獨立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，通過Shapiro-Wilk 檢驗評估數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，對于正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗比較兩組之間的差異；對于非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，使用非參數(shù)檢驗，P值小于0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 空腹血糖、HE 染色、ALP 和RUNX2 的免疫組織化學(xué)染色檢測結(jié)果

結(jié)果如表1 所示，T2DM 組小鼠在下頜骨骨缺損建模當(dāng)天（0 d） 和術(shù)后7、14、28 d的空腹血糖平均值分別為21.6、 22.6、 23.1、 23.2 mmol·L-1，均明顯高于對應(yīng)時間點NC 組小鼠的空腹血糖和11.1 mmol·L-1的建模標(biāo)準(zhǔn)。

表1 各組小鼠空腹血糖水平Tab 1 The fasting blood glucose levels in each group mmol·L-1

HE 染色結(jié)果（圖1） 顯示：7 d 時，成纖維細(xì)胞在NC 組下頜骨缺損內(nèi)排列整齊，骨缺損邊緣出現(xiàn)少量骨基質(zhì)沉積，而T2DM 組下頜骨缺損區(qū)的新生骨基質(zhì)較少；14 d 時，NC 組缺損邊緣出現(xiàn)連續(xù)條索狀的新生骨組織，而T2DM 組缺損區(qū)內(nèi)出現(xiàn)大量軟骨細(xì)胞；28 d 時，NC 組缺損區(qū)新生骨組織成片狀分布，而T2DM 組的缺損區(qū)仍存在大量結(jié)締組織。

圖1 NC組和T2DM組小鼠下頜骨缺損愈合7、14、28 d后的HE染色結(jié)果Fig 1 HE staining of the mandibular defect in NC group and T2DM group mice after 7 d, 14 d, 28 d

ALP 的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（圖2） 顯示：7 d 時，ALP 在NC 組新生骨基質(zhì)周圍呈陽性表達(dá)，在T2DM 組缺損區(qū)僅有少量的表達(dá)，且表達(dá)量明顯低于NC 組；隨著骨愈合時間的延長，NC 組新生骨組織周圍仍顯示出ALP 的陽性表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度較7 d 時有所降低，但均明顯強(qiáng)于T2DM 組。定量分析結(jié)果（圖3） 顯示：ALP 在T2DM 組與NC 組下頜骨缺損愈合7、14、28 d 后的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 小鼠下頜骨缺損愈合7、14、28 d后ALP免疫組織化學(xué)鏡下照片F(xiàn)ig 2 Pictures under microscope of ALP immunohistochemical staining in the mandibular defect of mice after 7 d, 14 d, 28 d

圖3 小鼠下頜骨缺損愈合7、14、28 d 后ALP 免疫組織化學(xué)染色定量分析Fig 3 Quantitative analysis of ALP immunohistochemical staining in the mandibular defect of mice after 7 d, 14 d, 28 d

RUNX2 的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（圖4） 顯示：7 d 時，RUNX2 在NC 組新生骨周圍呈現(xiàn)陽性表達(dá)，隨著骨缺損愈合時間的延長，新生骨組織周圍中RUNX2 的表達(dá)出現(xiàn)較7 d 時減弱的現(xiàn)象，RUNX2 在T2DM 組骨缺損區(qū)域的表達(dá)均明顯低于NC 組。定量分析結(jié)果（圖5） 顯示：T2DM 組骨缺損區(qū)域的RUNX2陽性細(xì)胞數(shù)量明顯低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 小鼠下頜骨缺損愈合7、14、28 d后RUNX2免疫組織化學(xué)鏡下照片F(xiàn)ig 4 Pictures under microscope of RUNX2 immunohistochemical staining in the mandibular defect of mice after 7 d, 14 d, 28 d

圖5 小鼠下頜骨缺損愈合7、14、28 d 后RUNX2 免疫組織化學(xué)染色定量分析Fig 5 Quantitative analysis of RUNX2 immunohistochemical staining in the mandibular defect of mice after 7 d, 14 d,28 d

上述結(jié)果證實T2DM 顯著抑制了小鼠下頜骨骨缺損的愈合過程。

2.2 Foxp3和RORγt的免疫組織化學(xué)染色檢測結(jié)果

Foxp3的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（圖6） 顯示：7 d 時，F(xiàn)oxp3 在NC 組新生骨周圍呈現(xiàn)陽性表達(dá)，隨著骨缺損愈合時間的延長，新生骨組織周圍中Foxp3的表達(dá)較7 d時減弱，F(xiàn)oxp3在T2DM組骨缺損區(qū)域的表達(dá)均明顯低于NC組。定量分析結(jié)果（圖7） 顯示：T2DM組骨缺損區(qū)域的Foxp3陽性細(xì)胞數(shù)量明顯低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖7 小鼠下頜骨缺損愈合7、14、28 d 后Foxp3 免疫組織化學(xué)染色定量分析Fig 7 Quantitative analysis of Foxp3 immunohistochemical staining in the mandibular defect of mice after 7d, 14 d, 28 d

RORγt 的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（圖8） 顯示，7 d時，NC組新生骨基質(zhì)周圍存在少量RORγt陽性細(xì)胞，而T2DM 組缺損區(qū)的RORγt 陽性細(xì)胞明顯增多；14 d 時，NC 組骨缺損區(qū)域內(nèi)RORγt 陽性細(xì)胞數(shù)量較7 d 時有所降低，但明顯少于T2DM組；28 d時，T2DM 組缺損區(qū)的RORγt陽性細(xì)胞數(shù)量較14 d時增多，且明顯多于NC 組。定量分析結(jié)果（圖9） 顯示：T2DM 組骨缺損區(qū)域的RORγt 陽性細(xì)胞數(shù)量明顯高于NC 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖8 小鼠下頜骨缺損愈合7、14、28 d后RORγt免疫組織化學(xué)鏡下照片F(xiàn)ig 8 Pictures under microscope of RORγt immunohistochemical staining in the mandibular defect of mice after 7 d, 14 d, 28 d

圖9 小鼠下頜骨缺損愈合7、14、28 d 后RORγt 免疫組織化學(xué)染色定量分析Fig 9 Quantitative analysis of RORγt immunohistochemical staining in the mandibular defect of mice after 7 d, 14 d,28 d

上述結(jié)果證實T2DM 小鼠下頜骨缺損愈合過程中出現(xiàn)了Treg-Th17向偏移。

2.3 PTPN2的免疫組織化學(xué)染色檢測結(jié)果

PTPN2 的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（圖10） 顯示：7 d 時，PTPN2 在NC 組新生骨周圍呈現(xiàn)陽性表達(dá)，隨著骨缺損愈合時間的延長，新生骨組織周圍中PTPN2 的表達(dá)較7d 時減弱， PTPN2 在T2DM 組骨缺損區(qū)域的表達(dá)均明顯低于NC 組。定量分析結(jié)果（圖11） 顯示：T2DM 組骨缺損區(qū)域內(nèi)PTPN2表達(dá)量明顯低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖10 小鼠下頜骨缺損愈合7、14、28 d后PTPN2免疫組織化學(xué)鏡下照片F(xiàn)ig 10 Pictures under microscope of PTPN2 immunohistochemical staining in the mandibular defect of mice after 7 d, 14 d, 28 d

圖11 小鼠下頜骨缺損愈合7、14、28 d 后PTPN2 免疫組織化學(xué)染色定量分析Fig 11 Quantitative analysis of PTPN2 immunohistochemical staining in the mandibular defect of mice after 7 d, 14 d,28 d

上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTPN2 在T2DM 小鼠下頜骨缺損愈合過程中的表達(dá)明顯降低，這提示PTPN2表達(dá)的降低可能是T2DM 小鼠下頜骨缺損愈合過程中出現(xiàn)Treg-Th17向偏移的原因。

3 討論

T2DM是以高血糖為特征的代謝性疾病，具有很高的致殘率和致死率，現(xiàn)已成為嚴(yán)重危害人類健康的全球性公共問題[10-11]。本研究聯(lián)合應(yīng)用高脂高糖飲食與低劑量STZ 注射的方法，成功構(gòu)建T2DM 小鼠模型[12]。在整個實驗過程中，T2DM 組小鼠的空腹血糖水平均穩(wěn)定維持在11.1 mmol·L-1之上。HE 染色結(jié)果顯示，T2DM 組小鼠的下頜骨骨缺損范圍內(nèi)新生骨的數(shù)量明顯少于NC 組；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，成骨相關(guān)蛋白ALP 和RUNX2 的表達(dá)在T2DM 組的骨缺損內(nèi)明顯降低；上述結(jié)果證實了T2DM 可以顯著地抑制下頜骨的骨再生過程。

近年來，Th17/Treg 免疫平衡機(jī)制在糖尿病及其并發(fā)癥、炎癥性骨代謝等多種生物學(xué)過程中的作用受到了越來越多的關(guān)注[5]。研究[13]表明，在T2DM 腎病患者中，尿白蛋白與肌酐的比值與Th1和Th17 細(xì)胞的比例呈正相關(guān)，與Treg 細(xì)胞的比例呈負(fù)相關(guān)。Samuel 等[14]研究證實，Th17 細(xì)胞在糖尿病大鼠根尖周炎的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮主導(dǎo)作用。 Th17 細(xì)胞分化所需的特異性轉(zhuǎn)錄因子是RORγt，Treg細(xì)胞的分化則依賴于特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3[15]， 因此Foxp3 與RORγt 的表達(dá)對“Treg-Th17 向偏移” 具有重要的調(diào)控作用。免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果顯示，T2DM小鼠下頜骨骨缺損范圍內(nèi)的RORγt陽性細(xì)胞數(shù)量增加，F(xiàn)oxp3陽性細(xì)胞數(shù)量減少，這提示T2DM 小鼠下頜骨骨缺損范圍內(nèi)可能出現(xiàn)了 “Treg-Th17向偏移”。

PTPN2 是蛋白酪氨酸磷酸酶家族的重要成員，包括TC45 和TC48 兩種形式[16]。其中當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，TC45 游離出細(xì)胞核，去磷酸化細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的某些關(guān)鍵蛋白質(zhì)（如蛋白酪氨酸激酶、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子等），從而抑制下游信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在調(diào)節(jié)糖代謝、抑制系統(tǒng)性炎癥、調(diào)控骨代謝方面發(fā)揮重要作用[17]。在本實驗中，免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果顯示T2DM 小鼠下頜骨骨缺損范圍內(nèi)的PTPN2 表達(dá)減少，這提示PTPN2 可能參與到T2DM 小鼠頜骨愈合 “Treg-Th17 向偏移” 的過程中，這與先前的研究發(fā)現(xiàn)較為一致。有報道證實，高血糖狀態(tài)會顯著降低全身組織或器官中PTPN2 的表達(dá)，T2DM 患者的血清中PTPN2 水平顯著低于健康成年人。Li 等[18]通過免疫組織化學(xué)染色和蛋白質(zhì)印跡法這兩種實驗手段檢測到與正常組相比，糖尿病組小鼠附睪白色脂肪組織中PTPN2 蛋白水平顯著降低。本課題組的前期實驗研究[8]發(fā)現(xiàn)，T2DM 大鼠股骨種植體周圍PTPN2 的表達(dá)明顯降低；另外，經(jīng)高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中PTPN2 的表達(dá)也與體內(nèi)實驗呈現(xiàn)相同的趨勢。

PTPN2 是調(diào)控糖代謝的重要分子，已有研究表明，肝臟特異性PTPN2 敲除小鼠的肝臟，脂肪變性、肥胖和胰島素抵抗情況明顯加重；胰腺特異性PTPN2 敲除小鼠經(jīng)長期高脂肪飲食喂養(yǎng)后，表現(xiàn)出葡萄糖耐量降低和葡萄糖刺激的胰島素分泌減少。另外，PTPN2 可以調(diào)節(jié)機(jī)體的固有免疫和適應(yīng)性免疫，有效地抑制系統(tǒng)性炎癥。Li 等[18]證實，過表達(dá)PTPN2 可以逆轉(zhuǎn)糖尿病小鼠附睪白色脂肪組織中的高Th17/Treg 比例。有研究[9]發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸炎小鼠動物模型中進(jìn)行Ptpn2-/-CD4+T 細(xì)胞再輸注，使得Th1細(xì)胞數(shù)量增加了近3倍，Th17細(xì)胞數(shù)量增加了2 倍，Treg 細(xì)胞數(shù)量減少了3 倍。除此之外，PTPN2 在調(diào)控骨代謝、降低骨缺損的局部破骨細(xì)胞密度等方面具有一定的積極作用。最近的研究表明，PTPN2 缺乏導(dǎo)致小鼠自發(fā)性滑膜炎和軟骨下的骨吸收，股骨中骨量減少以及破骨細(xì)胞密度增加。因此，通過靶向調(diào)控PTPN2，實現(xiàn)對糖尿病性骨代謝不良的治療，具有極大的應(yīng)用前景，這也是后續(xù)進(jìn)一步的研究方向。

綜上所述，本研究結(jié)果表明T2DM 可以顯著地抑制下頜骨骨再生過程，PTPN2 的下降以及Treg-Th17向偏移可能為其潛在的分子機(jī)制。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。