曾小麗 李生嬌 單錚男 殷俊豪 姜吉蕊 鄭章龍 李家

1.上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院·同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科，上海200072；2.上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院·同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院修復(fù)科，上海200072

牙周炎是一種常見的口腔科疾病，慢性牙周炎的持續(xù)進(jìn)展將導(dǎo)致牙齒的松動、脫落乃至口腔咬合功能的完全喪失[1-3]，作為被多種因素混雜影響的慢性炎癥性疾病，牙周炎的發(fā)生、發(fā)展過程中有大量基因及基因產(chǎn)物參與其中，因此，尋找牙周炎發(fā)病過程中的關(guān)鍵基因及相關(guān)因子是目前研究的一大熱點。

隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，通過芯片或測序等技術(shù)研究疾病與對照組間的基因表達(dá)譜的差異成為篩選致病基因的有力工具?；虮磉_(dá)量的變化往往預(yù)示著生理過程的改變或病理過程的發(fā)生，與此同時，基因編碼的產(chǎn)物所涉及的分子功能、生物過程、信號通路則可能與疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。由于慢性牙周炎的發(fā)生發(fā)展是多種基因及其產(chǎn)物的共同作用效果，單個基因或蛋白的表達(dá)變化往往不足以完全反映疾病的發(fā)展過程。此外，由于樣本數(shù)目小以及芯片檢測平臺的差異，過去不同研究者獲得結(jié)果并不完全一致，甚至可能互相矛盾。因此，本實驗基于大樣本量、相同檢測平臺等檢索要求，從基因表達(dá)綜合（gene expression omnibus，GEO） 數(shù)據(jù)庫中篩選并獲得符合標(biāo)準(zhǔn)的兩個慢性牙周炎相關(guān)數(shù)據(jù)集GSE10334 和GSE16134 并深入分析其中差異表達(dá)基因的功能、相關(guān)通路以及核心模塊、基因，為未來的研究指明方向[4-5]。

1 材料和方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)獲取

在GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/） 中以 “牙周炎（periodontitis）” 為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)芯片，并篩選基于同一檢測平臺且樣本量大于100 的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，獲取了2 組符合標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)集：GSE10334 和GSE16134。兩組數(shù)據(jù)集均采用美國Affymetrix 公司提供的Human Genome U133 Plus 2.0 Array 基因芯片進(jìn)行檢測，平臺號為GPL570。兩組芯片數(shù)據(jù)的樣本采集于中重度牙周炎患者炎性區(qū)域牙齦組織（試驗組） 和健康牙齦組織（對照組），兩組使用相同的采樣方法，并具有一致的樣本納入標(biāo)準(zhǔn)和臨床分型指標(biāo)[4-5]。其中，GSE10334 的芯片數(shù)據(jù)來源于90 位患者的247 例樣本（183例病變，64例健康）；GSE16134的芯片數(shù)據(jù)來源于120 位患者的310 例樣本（241 例病變，69例健康）[4-5]。

1.2 篩選差異表達(dá)基因

使用GEO2R 在線分析工具（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/） 進(jìn)行試驗組與對照組之間差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG）的篩選，篩選閾值設(shè)定為調(diào)整P值（adjustedPvalue，adj.P） ＜0.05，差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C） ＞2。使用R 語言的ggplot2 軟件包繪制火山圖和熱圖。

1.3 進(jìn)行功能富集分析

對兩組數(shù)據(jù)集的差異基因取交集后進(jìn)行后續(xù)分析，以增加結(jié)果可信度。使用g: Profiler （https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost） 分別對上、下調(diào)基因進(jìn)行功能富集分析，功能富集分析包括對基因的基因本體論（gene ontology，GO） 分析和通路分析。GO 分析涵蓋了分子功能、生物過程和細(xì)胞組分3個下級類目。通路分析中的生物通路信息來源于京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、Reactome和WIKI共3個數(shù)據(jù)庫。adj.P＜0.05 視為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

為了探索差異表達(dá)基因之間的相互作用關(guān)系，筆者通過在線工具STRING 數(shù)據(jù)庫（https://stringdb.org/） 建立蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI） 網(wǎng)絡(luò)，然后使用Cytoscape （www.cytoscape.org/） 軟件將該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。

1.5 核心模塊與核心基因確立

使用Cytoscape 軟件中的MCODE 插件并基于默認(rèn)閾值（K-core=2，Node Score Cutoff=0.2，Degree Cutoff=2，Maximum Depth=100） 篩選PPI 網(wǎng)絡(luò)中的重要功能模塊。使用cytoHubba 插件進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點的篩選。cytoHubba 插件使用12 種拓?fù)浞治霾呗赃M(jìn)行重要節(jié)點的預(yù)測和評估，在6 種以上算法中得分均位于前10 的節(jié)點被視作核心基因。為進(jìn)一步了解PPI網(wǎng)絡(luò)中重要子網(wǎng)絡(luò)的功能，筆者對MCODE核心模塊中的基因進(jìn)行了功能富集分析，并繪制通絡(luò)分析氣泡圖。

1.6 預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子

使用Cytoscape 軟件中的iRegulon 插件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測。該插件使用標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)（normalized enrichment score，NES） 來評估預(yù)測結(jié)果的可信度，NES 值越大，說明可信度越高，筆者將NES＞4.5的轉(zhuǎn)錄因子將用于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的建立。

2 結(jié)果

2.1 篩選出的差異表達(dá)基因

基于adj.P＜0.05 且FC 絕對值＞2 的篩選標(biāo)準(zhǔn)，在GSE10334 中篩選出221 個DEG，其中150 個上調(diào)，71 個下調(diào)（圖1A）；在GSE16134 中篩選出297 個DEG，其中212 個上調(diào)， 85 個下調(diào)（圖1C）；兩組DEG 在試驗組與對照組的表達(dá)量變化及其基因、樣本聚類結(jié)果見圖1B、D。

圖1 試驗組與對照組間差異基因的篩選Fig 1 Identification of differentially expressed genes between test group and control group

2.2 差異表達(dá)基因的功能富集分析結(jié)果

在兩組數(shù)據(jù)集中，196 個DEG 表達(dá)趨勢一致，包括139 個上調(diào)基因和57 個下調(diào)基因（圖2A、D）。GO 分析結(jié)果顯示：上調(diào)基因共富集于10 項分子功能、99 項生物過程以及20 項細(xì)胞組分，下調(diào)基因共富集于1項分子功能、11項生物過程以及7項細(xì)胞組分。圖2B、E展示了上、下調(diào)DEG adj.P前10 的GO 條目。在分子功能方面，上調(diào)基因參與趨化因子受體結(jié)合、免疫球蛋白結(jié)合，而下調(diào)基因參與皮膚表皮結(jié)構(gòu)形成。在生物過程方面，上調(diào)基因涉及免疫應(yīng)答、刺激應(yīng)答、白細(xì)胞活化等，而下調(diào)基因涉及皮膚及表皮的發(fā)育和角化。在細(xì)胞組分方面，上調(diào)基因主要位于胞外間隙、細(xì)胞表面、胞外體、質(zhì)膜外側(cè)，而下調(diào)基因主要位于超分子纖維、超分子聚合物、聚合細(xì)胞骨架纖維、透明角化顆粒等處。

通路分析結(jié)果顯示：上調(diào)基因富集于26 條信號通路，其中包括12 條KEGG 通路、12 條Reactome 通路和2 條WIKI 通路；而下調(diào)基因富集于2條Reactome 通路。圖2C、F 分別展示了上調(diào)基因adj.P前15 的通路條目和下調(diào)基因所富集的2 條通路條目。上調(diào)基因參與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、白細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、趨化因子信號通路以及人補體系統(tǒng)、造血干細(xì)胞分化等免疫反應(yīng)相關(guān)通路，而下調(diào)基因涉及角質(zhì)化包膜形成、角化等2條通路。

圖2 差異基因功能富集分析結(jié)果Fig 2 Functional enrichment analysis of differentially expressed genes

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)建立及核心模塊、核心基因篩選結(jié)果

由交集基因構(gòu)成的PPI 網(wǎng)絡(luò)包含132 個節(jié)點和519 個節(jié)點作用關(guān)系（圖3）。圖4A、B 顯示：PPI網(wǎng)絡(luò)的第一模塊涉及病毒蛋白與細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體的相互作用、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用和趨化因子信號通路等通路。圖4C、D 顯示：第二模塊參與B細(xì)胞受體信號通路。圖4E、F顯示：第三模塊與白細(xì)胞介素介導(dǎo)的信號通路、JAK-STAT信號通路等通路有關(guān)。

圖3 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并篩選核心基因Fig 3 Construction of PPI network and identification of hub genes

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)核心模塊篩選與通路分析結(jié)果Fig 4 Identification and pathway analysis of key modules in PPI network

cytoHubba 插件的分析結(jié)果顯示：滿足篩選標(biāo)準(zhǔn)的基因為CXC 基序趨化因子配體（C-X-C motif chemokine ligand，CXCL） 8、CXCL1、CXC 基序趨化因子受體（C-X-C motif chemokine receptor，CXCR） 4、選擇素（selectin，SEL） L， CD19 分子（CD19 molecule，CD19） 和IKAROS 家族鋅指（IKAROS family zinc finger，IKZF） 1。在PPI 網(wǎng)絡(luò)中，CXCL1、CXCL8、CXCR4 和SELL 位于第一模塊，IKZF1位于第三模塊。

2.4 轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測結(jié)果與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的建立

依據(jù)iRegulon預(yù)測結(jié)果，NES＞4.5的轉(zhuǎn)錄因子為干擾素調(diào)節(jié)因子（interferon regulatory factor，IRF） 4、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（E1A binding protein，EP） P300、易洛魁同源盒蛋白（iroquois homeobox，IRX） 4 和TATA 序列結(jié)合蛋白（TATA-box binding protein，TBP），分別調(diào)控60、18、24 和36個DEG（圖5），其中IRF4屬于上調(diào)DEG且位于第二核心模塊，參與B細(xì)胞受體信號通路（圖4 C、D）。

圖5 轉(zhuǎn)錄因子及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig 5 Transcription factors and their regulatory networks

3 討論

牙周炎不僅是成年人失牙的主要原因，也是多種疾病如糖尿病、動脈粥樣硬化、慢性阻塞性肺疾病等系統(tǒng)性疾病的潛在風(fēng)險因素[3,6]。鑒定與牙周炎進(jìn)展相關(guān)的相關(guān)分子及信號通路，有利于了解牙周炎的發(fā)病機(jī)制，為牙周炎的早期診治及伴發(fā)疾病的預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫公開的牙周炎基因表達(dá)譜，通過系統(tǒng)性生物信息學(xué)分析，為牙周炎的機(jī)制研究提供理論依據(jù)和研究方向。由于樣本量小會在一定程度上降低試驗結(jié)果的可信度，因此本研究篩取大樣本數(shù)據(jù)集GSE10334 和GSE16134 （分別含有247 例和310 例樣本） 進(jìn)行生物信息學(xué)分析。聯(lián)合分析兩組芯片數(shù)據(jù)集，在兩組中均差異表達(dá)的基因共196個，其中139 個為上調(diào)基因，57 個為下調(diào)基因。功能富集分析結(jié)果顯示，上調(diào)基因參與免疫系統(tǒng)，病毒蛋白與細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體的相互作用，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用，白細(xì)胞跨內(nèi)膜遷移和趨化因子受體結(jié)合趨化因子等免疫反應(yīng)相關(guān)途徑，由此可見免疫應(yīng)答相關(guān)途徑在牙周炎發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。而下調(diào)基因涉及角質(zhì)化包膜形成、角化等途徑，說明上皮屏障形成能力降低，提示牙周炎的發(fā)生與牙齦上皮完整性喪失相關(guān)。由差異基因構(gòu)建的PPI 網(wǎng)絡(luò)中，MCODE 得分前三的模塊被視作核心模塊，分別富集于趨化因子信號通路、B細(xì)胞受體信號通路以及白細(xì)胞介素介導(dǎo)的信號通路等途徑，由此推測，這些分子事件在牙周炎發(fā)病過程中活躍。CXCL8、CXCL1、CXCR4、SELL、CD19和IKZF1為核心基因，位于PPI網(wǎng)絡(luò)的中心位置，因此最有可能成為牙周炎的治療靶點。

CXCL8 和CXCL1 屬于趨化因子CXC 亞家族，通過募集白細(xì)胞來增強或延長炎癥反應(yīng)。多項研究[7-9]發(fā)現(xiàn)，相較于健康牙齦，炎癥牙齦組織切片中CXCL8 和CXCL1 的mRNA 水平和蛋白水平均顯著升高。這些結(jié)果提示：炎性環(huán)境下牙周細(xì)胞可能通過分泌更多的趨化因子以對抗牙周病原體的感染，而這種過度的免疫應(yīng)答正是牙周組織破壞的主要原因。此外Souto 等[1]研究發(fā)現(xiàn)，CXCL8水平與牙周炎患者的探診出血、探診深度和臨床附著喪失等臨床檢測指標(biāo)正相關(guān)，其結(jié)果提示CXCL8 表達(dá)量與牙周炎嚴(yán)重程度相關(guān)，有望成為牙周炎進(jìn)展標(biāo)志物。

CXCR4 是CXC 趨化因子受體家族成員，Hajishengallis 等[10]發(fā)現(xiàn)，牙齦卟啉單胞菌可通過結(jié)合巨噬細(xì)胞表面CXCR4，逃避宿主的免疫清除?？诜﨏XCR4 的拮抗劑AMD3100，可抑制牙齦卟啉單胞菌的定殖，進(jìn)而預(yù)防或減輕小鼠實驗性牙周炎及其引起的牙槽骨吸收[11]。因此推測，CXCR4是牙齦卟啉單胞菌在牙周炎致病作用的一個關(guān)鍵位點。

SELL 編碼淋巴細(xì)胞歸巢受體L-選擇素，該因子屬于細(xì)胞表面黏附分子，調(diào)控白細(xì)胞在血管內(nèi)的黏附與遷移。L-選擇素主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞，在炎性疾病中，L-選擇素結(jié)合其相應(yīng)配體，調(diào)控中性粒細(xì)胞活化與聚集，并使其從血管中遷移至炎癥區(qū)域。中性粒細(xì)胞是固有免疫中的重要組成細(xì)胞，在免疫防御中起先驅(qū)作用，但近年來的研究[12]發(fā)現(xiàn)，過度活化的中性粒細(xì)胞可通過產(chǎn)生大量活性氧和基質(zhì)降解酶造成牙周組織的破壞。因此，SELL 可能通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞遷移和活化參與牙周炎病理發(fā)生。

CD19 是特異性表達(dá)于B 細(xì)胞表面的免疫球蛋白基因超家族成員[10-11,13-14]，為B細(xì)胞抗原受體復(fù)合物的共受體，可降低激活下游信號通路和觸發(fā)B細(xì)胞對抗原的反應(yīng)的閾值[14]。因此，CD19 在試驗組的表達(dá)量升高，提示在炎性牙齦中B 細(xì)胞數(shù)目和免疫應(yīng)答活性增加。有研究[15]表明，B 細(xì)胞是牙周炎骨缺損區(qū)分泌RANKL的主要細(xì)胞之一。使用抗B 細(xì)胞藥物如利妥昔單抗則可以緩解牙周炎的多種癥狀[2]。因此，以CD19 為靶點拮抗B 細(xì)胞的藥物研發(fā)，可能成為藥物治療牙周炎的一個研究方向。

IKZF1 編碼淋巴系特異性轉(zhuǎn)錄因子IKAROS，IKAROS 是造血細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，調(diào)控T淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞抗原受體介導(dǎo)的增殖反應(yīng)以及相關(guān)效應(yīng)細(xì)胞的功能[16]，T 細(xì)胞與B 細(xì)胞參與牙周炎結(jié)締組織區(qū)域的炎癥浸潤及骨喪失[2,15]。

IRF4 為iRegulon 預(yù)測結(jié)果中可信度最高的轉(zhuǎn)錄因子， 調(diào)控包括核心基因CXCR4、 CD19 和IKZF1在內(nèi)的60個DEG的轉(zhuǎn)錄，IRF4 mRNA與蛋白質(zhì)在炎性牙齦中的表達(dá)已在過去的文獻(xiàn)[7]報道中得到支持。雖然IRF4 在牙周炎發(fā)病過程中的具體作用尚不明確，但I(xiàn)RF4 參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的發(fā)生[17]，提示其與機(jī)體免疫亢進(jìn)相關(guān)。

在本研究中，為在多樣本高通量數(shù)據(jù)中快速高效找到顯著上調(diào)或下調(diào)的基因，筆者使用了嚴(yán)格的閾值篩選方法，但值得注意的是，這種方法可能會遺漏部分具有重要生物學(xué)意義但表達(dá)量變化并不顯著的基因。例如，白細(xì)胞介素-1β 和腫瘤壞死因子-α 作為牙周炎疾病中重要的炎性因子和骨吸收介質(zhì)，可激活下游核因子κB 信號通路參與牙周炎相關(guān)骨丟失[18]。然而由于不滿足FC＞2 的閾值標(biāo)準(zhǔn)，這些牙周炎相關(guān)基因在本實驗中不作為“差異表達(dá)基因” 納入后續(xù)分析，其在牙周炎發(fā)病過程中的作用也未得到體現(xiàn)。因此本研究尚存在一定局限性，相關(guān)分析結(jié)果需要通過后續(xù)的分子生物學(xué)實驗和動物實驗進(jìn)一步驗證。

綜上所述，本研究基于大樣本芯片數(shù)據(jù)集研究，通過生物信息學(xué)分析篩選、鑒定與牙周炎發(fā)病相關(guān)的易感基因、轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)信號通路。共發(fā)現(xiàn)196 個牙周炎相關(guān)差異基因，包括6 個核心基因（CXCL8、CXCL1、CXCR4、SELL、CD19和IKZF1） 和1 個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（IRF4），這些分子通過細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子受體結(jié)合趨化因子等多條免疫相關(guān)途徑參與牙周炎的病理發(fā)生。本研究首次報道了IKZF1、IRF4與中重度牙周炎患者牙齦組織炎性病變相關(guān)的研究。病毒蛋白與細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體的相互作用、白細(xì)胞跨內(nèi)膜遷移、B細(xì)胞受體信號通路等途徑是本研究新發(fā)現(xiàn)的與牙周炎發(fā)病相關(guān)的信號通路。針對以上分子及通路展開深入研究，將有助于牙周炎發(fā)病機(jī)制的闡明和治療靶標(biāo)的確立。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。