周曉敏 孔嘉明 戴習林

摘要：【目的】明確SNP標記位點與羅氏沼蝦生長性狀間的關(guān)聯(lián)性，為羅氏沼蝦生長性狀候選基因的尋找、生長性狀調(diào)控機理及后期分子標記輔助育種研究打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎弥苯訙y序技術(shù)對25個SNP標記位點在羅氏沼蝦生長性狀極端群體中進行多態(tài)性檢測。采用卡方檢驗（χ2）篩選出2個極端（體長極大和極?。┝_氏沼蝦群體中與生長狀況存在潛在相關(guān)性的SNP標記位點，進一步對羅氏沼蝦浙江群體60個個體進行SNP基因型與生長性狀（體長、頭胸甲寬、第一腹節(jié)寬、第一腹節(jié)高和體重）的關(guān)聯(lián)分析。運用一般線性模型對SNP標記位點與羅氏沼蝦5個生長性狀的關(guān)聯(lián)性進行檢測。【結(jié)果】卡方檢驗結(jié)果顯示，SNP6、SNP7、SNP16、SNP20和SNP24等5個標記位點在羅氏沼蝦極端群體中與生長性狀存在潛在相關(guān)。5個潛在相關(guān)SNP標記位點與生長性狀的相關(guān)性分析結(jié)果表明，SNP6、SNP7、SNP16和SNP24等4個位點與生長性狀呈顯著（P<0. 05，下同）或極顯著（P<0. 01，下同）相關(guān)，其中位點SNP6與體長和體重關(guān)聯(lián)極顯著，與頭胸甲寬關(guān)聯(lián)顯著;SNP7與體長、頭胸甲寬、第一腹節(jié)寬和體重關(guān)聯(lián)極顯著，與第一腹節(jié)高關(guān)聯(lián)顯著;SNP16與頭胸甲寬、第一腹節(jié)寬、第一腹節(jié)高和體重關(guān)聯(lián)極顯著，與體長關(guān)聯(lián)顯著;SNP24僅與第一腹節(jié)高關(guān)聯(lián)顯著。對浙江群體中60尾個體體長50%小個體和體長50%大個體2個群體中4個SNP位點的基因型頻率進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，SNP6和SNP24 2個標記與生長的關(guān)聯(lián)性顯著，SNP7和SNP16與生長的關(guān)聯(lián)性極顯著?！窘Y(jié)論】HSP90和HGS基因可能是與羅氏沼蝦生長相關(guān)的重要功能基因，研究結(jié)果為下一步基因定位及分子標記輔助育種提供了更多的標記基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 羅氏沼蝦;生長性狀;SNP標記位點;相關(guān)性分析

中圖分類號： S966.12 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）08-2284-10

Correlation analysis of SNP markers loci with growth related traits of Macrobrachium rosenbergii

ZHOU Xiao-min， KONG Jia-ming， DAI Xi-lin*

（Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China）

Abstract：【Objective】To clarify the relationship between SNP marker loci and growth traits of Macrobrachium rosenbergii， so as to lay a foundation for the search of candidate genes for growth traits， the regulation mechanism of growth traits and the study of molecular marker-assisted breeding in the later stage. 【Method】The direct sequencing technique was used to detect the polymorphism of 25 SNP markers in the extreme population of growth traits of M. rosenbergii. Chi-square test （χ2） was used to screen two SNP marker loci with potential correlation with growth status in two extreme populations（maximum and minimum in body length） of M. rosenbergii. Further， the association between SNP genotypes and growth traits（body length， carapace ?width， first abdominal segment width， first abdominal segment height and body weight） was analyzed in 60 individuals of M. rosenbergii Zhejiang population. The general linear model was used to detect the correlation between SNP marker loci and five growth traits of M. rosenbergii. 【Result】Chi-square test showed that SNP6， SNP7， SNP16， SNP20 and SNP24 were potentially associated with growth traits in M. rosenbergii population. The results of correlation analysis between five potential correlation SNP marker loci and growth traits showed that SNP6， SNP7， SNP16 and SNP24 were significantly（P<0.05， the same below） or extremely significantly（P<0.01， the same below） correlated with growth traits， in which SNP6 was extremely significantly correlated with body length and weight， and significantly correlated with carapace width， while SNP7 was extremely significantly correlated with body length， carapace width， first ventral segment width and body weight， and significantly correlated with first ventral segment height. SNP16 was extremely significantly correlated with carapace width， first abdominal segment width， first abdominal segment height and body weight， and significantly correlated with body length， while SNP24 was only significantly correlated with the first abdominal segment height. The genotypic frequencies of 4 SNP loci in 60 individuals with 50% small body length individuals and 50% large body length individuals in Zhejiang population were statistically analyzed. The results showed that 2 markers in SNP6 and SNP24 were significantly associated with growth， and SNP7 and SNP16 were extremely significantly associated with growth. 【Conclusion】HSP90 and HGS genes may be important functional genes related to the growth of M. rosenbergii.

Key words： Macrobrachium rosenbergii; growth traits; SNP markers loci; correlation analysis

Foundation item： Shanghai Shrimp Industry Technology System Construction Project（HNKCZ〔2014〕5）

0 引言

【研究意義】羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）生長快、食性雜、個體大、肉質(zhì)好、易養(yǎng)殖，是我國主要的淡水養(yǎng)殖蝦類（周勁松，2006），但伴隨羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展的同時，蝦體生長緩慢、個體小型化及病害增多等種質(zhì)退化現(xiàn)象日漸突出（周俊名等，2017），對羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展造成不利影響，因此，羅氏沼蝦優(yōu)良品種的選育工作勢在必行。隨著生物學研究層次的提高和實驗手段的不斷改進，良種選育已從傳統(tǒng)的選擇育種或雜交育種發(fā)展到分子標記輔助育種（Marker assisted selection，MAS），新技術(shù)的應(yīng)用縮短了選育過程和育種速度，成為目前育種工作的重要輔助措施（樊慶燦等，2014;牛志剛等，2020）。關(guān)聯(lián)分析是利用候選基因來分析表型與功能等位基因之間的相關(guān)性，是實現(xiàn)分子標記輔助育種的有效方法（劉思瑋等，2013）。單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）從DNA序列水平對水產(chǎn)動物種質(zhì)進行研究，分析不同群體間的遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳分化，能更準確地評定種質(zhì)的遺傳特性和相互間的關(guān)系，對群體遺傳學的種群進化和群體結(jié)構(gòu)研究具有重要的參考價值。當然，也可通過分析生物與經(jīng)濟性狀的關(guān)聯(lián)性，獲得與經(jīng)濟性狀相關(guān)聯(lián)的遺傳標記。由于其具有覆蓋率高，易于基因分型等優(yōu)點，被廣泛運用于關(guān)聯(lián)分析和分子輔助育種（樊慶燦等，2014;王賽等，2019）?！厩叭搜芯窟M展】在水產(chǎn)動物中，利用SNP標記與生長性狀進行關(guān)聯(lián)分析已有一些報道。倪靜等（2011）分析了牙鲆（Paralichthys olivaceus）GH基因第1外顯子區(qū)域中微衛(wèi)星座位的多態(tài)性，同時對各基因型與其體重、體長等生長性狀進行關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果顯示，基因型為AC的個體體重、頭長和體高明顯大于其他基因型個體，C是一個對體重、頭長和體高有利的等位基因。王海芳（2014）運用比較基因組學、PCR技術(shù)和HRM等技術(shù)研究鱖（Siniperca chautsi）生長相關(guān)基因的SNPs及其與生長性狀的相關(guān)性。陳靜等（2018）采用PCR產(chǎn)物直接測序的方法研究MyoD基因多態(tài)性對草魚（Ctenopharyngodon idella）生長性狀的影響，認為MyoD基因的M1和M5突變位點可作為草魚選育的候選分子標記。李勝杰等（2018）采用RNA-seq技術(shù)進行大口黑鱸（Micropterus salmoides）生長快和生長慢個體肌肉組織的轉(zhuǎn)錄組分析，采用Sna Pshot技術(shù)對檢測到的其中75個EST-SNP標記在大口黑鱸生長性狀極端群體中進行多態(tài)性檢測，進一步采用一般線性模型分析37個EST-SNP標記與大口黑鱸生長性狀的相關(guān)性，結(jié)果表明，CL1452.Contig9__All-847位點與生長性狀顯著相關(guān)（P<0.05），可用于大口黑鱸分子標記輔助育種。李純等（2019）開展GHSR基因多態(tài)性對中華鱉（Pelodiscus sinensis）生長相關(guān)性狀的影響研究，通過直接測序法在GHSR基因5側(cè)翼和3側(cè)翼上篩選SNPs位點，并分析其與生長性狀的相關(guān)性，結(jié)果顯示，檢測到的所有SNP位點均符合Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05）。此外，在北極嘉魚（Salvelinus alpinus L.）（Tao and Boulding，2003）、尖吻鱸（Lates calcarifer）（Xu et al.，2006）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei） （Ciobanu et al.，2010;Li et al.，2010）和斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon） （李運東，2016）等種類上也有相關(guān)報道?！颈狙芯壳腥朦c】SNP標記是一種研究物種遺傳多態(tài)性的理想分子標記，但在羅氏沼蝦的研究中仍以微衛(wèi)星為主，SNP標記鮮見應(yīng)用于羅氏沼蝦的遺傳多態(tài)性分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用直接測序技術(shù)，對25個擴增穩(wěn)定的SNP標記位點進行多態(tài)性檢測，對羅氏沼蝦生長極端（體長極大和極?。﹤€體篩選出具有與生長性狀存在潛在相關(guān)性的SNP標記位點，進一步在隨機選取的同一時期羅氏沼蝦成蝦浙江群體進行SNP基因型與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析，篩選生長相關(guān)分子標記，為羅氏沼蝦生長性狀候選基因的尋找、生長性狀調(diào)控機理及后期分子標記輔助育種研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

SNP生長位點初篩所用樣品為從上海申漕特種水產(chǎn)實驗基地飼養(yǎng)的羅氏沼蝦生長選育系F0中選取的體長5%極大值（Max，體長>9 cm）和5%極小值（Min，體長<2 cm）2種極端表型個體各30尾，關(guān)聯(lián)分析所用樣品為來自浙江南太湖養(yǎng)殖場中隨機挑選同一時期的羅氏沼蝦成蝦60尾，測量其體長、頭胸甲寬、第一腹節(jié)寬、第一腹節(jié)高和體重5個生長相關(guān)性狀數(shù)據(jù)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 DNA提取 采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒（上海傲益生物科技有限公司）提取羅氏沼蝦DNA，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后用于后續(xù)試驗。

1. 2. 2 引物合成及PCR產(chǎn)物測序 12對引物均由上海海洋大學戴習林實驗室開發(fā)，由上海邁浦生物科技有限公司合成。進行PCR擴增，將檢測合格的PCR產(chǎn)物送交上海邁浦生物科技有限公司測序，讀取峰圖。

1. 3 數(shù)據(jù)分析

使用PopGene 3.2對生長性狀極端群體進行觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、哈溫平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）和遺傳多樣性指數(shù)（Nei）分析和計算，在Cervus中計算位點多態(tài)信息含量（PIC）?？ǚ綑z驗25個SNP標記位點與2個羅氏沼蝦生長極端群體的相關(guān)性。采用一般線性模型（General linear model，GLM）（董玉和李琪，2016）對60尾浙江羅氏沼蝦個體各位點基因型與其5個生長性狀進行相關(guān)性分析，以體長、體重等形態(tài)性狀為因變量，篩選得到的SNP標記位點的不同基因型為自變量。

2 結(jié)果與分析

2. 1 SNP在2個羅氏沼蝦生長性狀極端群體的多態(tài)性分析結(jié)果

使用12對引物進行擴增測序，共獲得25個SNP標記位點，詳見表1。在生長性狀極端的羅氏沼蝦群體中進行多態(tài)性檢測，結(jié)果（表2）顯示，除SNP13位點外均表現(xiàn)出多態(tài)性，PIC范圍為0～0.38，平均值為0.28;Ho在0～0.70，平均值為0.27;He在0～0.51，平均值為0.36。哈溫平衡分析發(fā)現(xiàn)極大蝦群體中有10個SNP標記位點顯著偏離平衡（P<0.05，下同），極小蝦群體中有13個SNP標記位點顯著偏離平衡。

2. 2 SNP標記與生長性狀相關(guān)性分析結(jié)果

將25個SNP標記在2個生長性狀極端羅氏沼蝦群體中的各基因型比例進行統(tǒng)計（表3），經(jīng)卡方檢驗，SNP6、SNP7、SNP16、SNP20和SNP24等5個標記位點在極端群體中與生長性狀存在潛在相關(guān)性。進一步分析這5個SNP標記位點在浙江群體的遺傳多樣性，結(jié)果（表4）顯示，其Ho介于0.20～0.62，平均值為0.36;He介于0.30～0.50，均值為0.42;平均PIC為0.33，均屬于中度多態(tài);哈溫平衡檢測結(jié)果顯示，SNP7和SNP24位點顯著偏離哈溫平衡。

5個SNP標記位點在群體中均存在3種基因型（表3），各SNP標記位點與60個浙江個體關(guān)聯(lián)分析結(jié)果（表5）顯示，SNP6與體長和體重關(guān)聯(lián)極顯著（P<0.01，下同），與頭胸甲寬關(guān)聯(lián)顯著;SNP7與體長、頭胸甲寬、第一腹節(jié)寬和體重關(guān)聯(lián)極顯著，與第一腹節(jié)高關(guān)聯(lián)顯著;SNP16與頭胸甲寬、第一腹節(jié)寬、第一腹節(jié)高和體重關(guān)聯(lián)極顯著，與體長關(guān)聯(lián)顯著;SNP24僅與第一腹節(jié)高關(guān)聯(lián)顯著;SNP20不同基因型與生長性狀均不存在顯著關(guān)聯(lián)性（P>0.05，下同）。

對關(guān)聯(lián)顯著的4個SNP標記位點的不同基因型間生長性狀進行多重比較，結(jié)果（表6）顯示，SNP6位點的TT基因型個體5種性狀參數(shù)的平均值均高于基因型CC和CT，并且體長、頭胸甲寬和體重的差異均達顯著水平;SNP7位點和SNP16位點的3種基因型在5個性狀中均發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)顯著，且SNP7位點AA基因型所有個體的生長參數(shù)平均值均高于AG和GG基因型，并與AG基因型存在顯著差異，SNP16位點GG基因型所有個體生長參數(shù)平均值小于另外2種基因型，與AG基因型呈顯著差異;SNP24位點的3種基因型在第一腹節(jié)高性狀中CG基因型與GG基因型存在顯著差異。

2. 3 浙江群體體長前50%小個體和后50%大個體各SNP標記位點不同基因型分布

對浙江群體中60尾個體體長50%小個體和體長50%大個體2個群體中4個SNP標記位點的基因型頻率進行統(tǒng)計（表7），經(jīng)卡方檢驗，SNP6和SNP24與生長的關(guān)聯(lián)性顯著，SNP7和SNP16與生長的關(guān)聯(lián)性極顯著。

2. 4 各SNP標記位點不同基因型對應(yīng)的生長性狀分布

對與SNP6、SNP7、SNP16和SNP24等4個標記位點關(guān)聯(lián)顯著的生長性狀統(tǒng)計其基因型分布，結(jié)果見圖1。以ChymotrypsinBll-體長為例，由圖1可看出，CC基因型所有個體體長參數(shù)中位線在7.99 cm處，CT基因型體長參數(shù)中位線在7.40 cm處，TT基因型體長參數(shù)中位線在8.35 cm處，且CC基因型的分布較分散。

3 討論

面對羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)的巨大發(fā)展空間及對養(yǎng)殖品種要求的不斷提高，開展羅氏沼蝦遺傳育種工作，培育更多具有優(yōu)良性狀的新品種成為近年的研究方向。經(jīng)濟性狀的遺傳解析無疑是育種研究的熱點之一（桂建芳等，2018）。群體遺傳背景、連鎖不平衡和樣本含量大小等因素可影響SNP標記位點與群體目標性狀相關(guān)性的準確性和可靠性（封利穎等，2013）。本研究對5個SNP標記位點在浙江群體中的多態(tài)性進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5個標記位點的多態(tài)信息含量均高于0.25，屬于中度多態(tài)，多態(tài)性較豐富，表明此5個SNP標記位點用于遺傳多樣性分析時有較高的有效性和可靠性;SNP7和SNP24顯著偏離哈溫平衡，說明這2個位點易受選種選配的影響。

羅氏沼蝦的體長、頭胸甲寬、第一腹節(jié)寬、第一腹節(jié)高和體重等是影響羅氏沼蝦質(zhì)量和產(chǎn)量的重要經(jīng)濟性狀。SNP標記與羅氏沼蝦生長性狀的關(guān)聯(lián)性分析顯示SNP6和SNP7位點分別與羅氏沼蝦的體長、體重關(guān)聯(lián)極顯著，SNP16位點與體長關(guān)聯(lián)顯著，與體重關(guān)聯(lián)極顯著，出現(xiàn)一個性狀與多個SNP具有關(guān)聯(lián)性現(xiàn)象。表明性狀受多個基因（位點）控制，存在多因一效現(xiàn)象，而多因一效可能是基因連鎖導致，符合數(shù)量性狀的相關(guān)理論（鄭先虎等，2011），也可能是性狀由一個以上QTL控制，由不同的生理生化過程所調(diào)控（李仕貴等，2002）;位點SNP7和SNP16分別與5個生長性狀關(guān)聯(lián)顯著或極顯著，出現(xiàn)了幾種不同的生長性狀與同一個位點相關(guān)聯(lián)，說明這5種生長性狀之間也存在一定程度的關(guān)聯(lián);影響單一性狀的基因只影響某一特定性狀，如位點SNP24，僅與第一腹節(jié)高關(guān)聯(lián)顯著，與其他生長性狀均無顯著關(guān)聯(lián)性。從表型到基因型的分子作用機理非常復雜（曾長英等，2006），通過分析羅氏沼蝦不同基因型與生長性狀的相關(guān)性，揭示這些標記位點存在一因多效或多因一效現(xiàn)象，可為羅氏沼蝦不同生長性狀間的種質(zhì)選擇提供參考。

對4個與生長性狀顯著相關(guān)的標記位點基因型進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同基因型對應(yīng)的生長性狀分布規(guī)律與多重比較的結(jié)果相一致。如多重比較中（表5），Chymotrypsin基因CT基因型的體長（7.45±0.20 cm）小于CC基因型的體長（7.63±0.47 cm）和TT基因型的體長（8.43±0.20 cm）;CT基因型的體長中位數(shù)最小，TT基因型的體長中位數(shù)最大，進一步表明Chymotrypsin基因的CT基因型和TT基因型的體長存在差異。候選基因關(guān)聯(lián)分析已成為確定某些水產(chǎn)養(yǎng)殖物種表型性狀相關(guān)性遺傳基礎(chǔ)的方法，來自EST的外顯子SNP一直是關(guān)聯(lián)研究的主要目標，因為SNP可能通過改變所得蛋白質(zhì)中存在的氨基酸（即非同義突變）來影響靶基因的生理功能（Genissel et al.，2004）。最近的一項研究表明，外顯子區(qū)域的同義和非同義SNP對遺傳應(yīng)用（即作圖和關(guān)聯(lián)研究）同樣有用，因為同義SNP也可能導致表型變異（Kimchi-Sarfaty et al.，2007）。在甲殼類動物中，大多數(shù)HSP形式的研究已用于評估與先天免疫反應(yīng)或環(huán)境壓力的關(guān)系，但一些研究表明它們參與了甲殼類動物肌肉生長，如凡納濱對蝦（Cesar and Yang，2007）。與甲殼類動物生長相關(guān)的HSP的第一個直接證據(jù)表明，HSP的推定功能作用不應(yīng)僅限于先天免疫反應(yīng)和環(huán)境壓力（周玉蘭等，2017;王曉雯等，2019），而必須擴展到生長。HGS基因為肝細胞生長因子激活因子，是一種來自于間充質(zhì)的多效生長因子，具有高度保守性，能促進細胞生長和分化。關(guān)聯(lián)分析中位點SNP7和SNP16與5個生長性狀均關(guān)聯(lián)顯著或極顯著，該2個位點分別位于HSP90基因和HGS基因，與上述文獻不謀而合。在羅氏沼蝦選育系F0生長性狀極端群體中，SNP6、SNP7、SNP16、SNP20和SNP24表現(xiàn)出潛在相關(guān)性，但在浙江養(yǎng)殖群體中，只有SNP6、SNP7、SNP16和SNP24等4個位點表現(xiàn)出顯著或極顯著關(guān)聯(lián)，其原因可能是試驗樣本量較少所致，也可能是樣本所出自的家系材料不同導致，這也是試驗用浙江群體進行進一步驗證的原因。盡管如此，仍不能確保在此2個群體中都適用的標記也適用于其他群體，在后續(xù)研究中，還需要更大的驗證群體及不同的育種系來進一步驗證SNP標記與生長性狀的相關(guān)性，尋找具有普遍性的、與生長相關(guān)的SNP標記，確定具有最佳遺傳潛力的育種種群。

4 結(jié)論

HSP90和HGS基因可能是與羅氏沼蝦生長相關(guān)的重要功能基因，研究結(jié)果為下一步基因定位及分子標記輔助育種提供了更多的標記基礎(chǔ)。

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（責任編輯 麻小燕）

收稿日期：2020-06-24

基金項目：上海市蝦類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目（滬農(nóng)科產(chǎn)字〔2014〕第5號）

通訊作者：戴習林（1969-），https：//orcid.org/0000-0003-0595-9715，教授，主要從事海洋生物繁殖與發(fā)育生物學、甲殼動物增養(yǎng)殖及水環(huán)境調(diào)控研究工作，E-mail： xldai@ shou. edu.cn

第一作者：周曉敏（1992-），https：//orcid.org/0000-0002-7106-6803，研究方向為甲殼動物遺傳育種，E-mail： 18616829502@163.com