陳淑芳，黎慶濤，黃凱，鄔智高，張文清，張良軍

(1.廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)藥健康學(xué)院，廣西 南寧 530004)

籬欄網(wǎng)[Merremiahederacea(Burm.f.)Hall.f.]為旋花科魚黃草屬植物,近年來研究人員發(fā)現(xiàn)籬欄網(wǎng)中可能含有多糖、苷類、黃酮等化學(xué)成分，具有抑菌[1]、消炎[2]、提高機(jī)體吞噬細(xì)胞數(shù)量[3]等作用。目前，多見對(duì)籬欄網(wǎng)粗提取物生物活性的研究，其有效活性成分還并不明確。

現(xiàn)已有大量研究報(bào)道多糖具有抗氧化[4]、抗衰老[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]等一系列重要的生物活性，多糖已經(jīng)被廣泛用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和化妝品工業(yè)中。

本文對(duì)籬欄網(wǎng)多糖的熱水浸提工藝進(jìn)行優(yōu)化，并測(cè)定其對(duì)兩種自由基的清除能力，為后續(xù)天然抗氧化劑的開發(fā)及籬欄網(wǎng)的綜合利用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

籬欄網(wǎng)采集于廣西南寧，由廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院鐘珍副教授鑒定為籬欄網(wǎng)[Merremiahederacea(Burm.f.)Hall.f.]的全草；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、濃硫酸、苯酚、硫酸亞鐵、水楊酸、L(+)-抗壞血酸等均為分析純。

HH-S26恒溫水浴鍋；SHZ-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵；RE-2010旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；TU-1950分光光度計(jì)。

1.2 籬欄網(wǎng)多糖的提取

籬欄網(wǎng)，清洗除雜，烘干，粉碎過60目篩。乙醇預(yù)處理，烘干。熱水浸提，液料比25 mL/g，提取溫度90 ℃，提取時(shí)間3.5 h，提取次數(shù)2次。收集上清液，抽濾，旋蒸，醇沉過夜。收集沉淀，凍干，沉淀復(fù)溶，得籬欄網(wǎng)粗多糖水溶液，采用分光光度計(jì)測(cè)定多糖含量，計(jì)算籬欄網(wǎng)多糖得率(Y)。

Y=[(c標(biāo)曲對(duì)應(yīng)濃度·V多糖溶液)/M原料質(zhì)量]×100%

(1)

1.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[7]

葡萄糖濃度與吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

1.4 籬欄網(wǎng)多糖的抗氧化作用

1.4.1 清除DPPH 自由基能力的測(cè)定 清除 DPPH自由基能力的測(cè)定按照參考文獻(xiàn)[4]的方法，由公式(2)計(jì)算：

Y=[(A0-A樣品+A樣品空白)/A0]×100%

(2)

1.4.2 清除羥自由基能力的測(cè)定 清除羥自由基能力的測(cè)定按照參考文獻(xiàn)[4]的方法，由公式(3)計(jì)算。

Y=[(A0-A樣品+A樣品空白)/A0]×100%

(3)

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

每組測(cè)定3次。

2.1.1 提取次數(shù)對(duì)籬欄網(wǎng)多糖得率的影響 提取次數(shù)的影響見圖2。

圖2 提取次數(shù)對(duì)籬欄網(wǎng)多糖得率的影響Fig.2 Effects of extraction times on yield of Merremiahederacea polysaccharides

由圖2可知，籬欄網(wǎng)多糖得率隨著提取次數(shù)的增加而增加，可能是因?yàn)槎嗵翘崛〈嬖谌艹銎胶?，加入新鮮的溶劑會(huì)重新建立平衡，促使更多多糖溶出，提取次數(shù)為2次時(shí)，籬欄網(wǎng)多糖已基本提取完畢，所以第3次提取時(shí)沒有更多多糖溶出。確定提取次數(shù)為2次。

2.1.2 液料比對(duì)籬欄網(wǎng)多糖得率的影響 液料比的影響見圖3。

圖3 液料比對(duì)籬欄網(wǎng)多糖得率的影響Fig.3 Effects of ratio of liquid to material on yield ofMerremia hederacea polysaccharides

由圖3可知，籬欄網(wǎng)多糖得率隨著液料比的增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，液料比為25 mL/g時(shí)，籬欄網(wǎng)得率最大。這可能是由于隨著液料比增大，籬欄網(wǎng)植物細(xì)胞與水之間的濃度差異大，有利于多糖溶出，但液料比過大可能會(huì)降低分子之間的相互作用，還會(huì)導(dǎo)致籬欄網(wǎng)中部分水溶性雜質(zhì)溶出，干擾多糖溶出效果。選擇液料比為25 mL/g。

2.1.3 溫度對(duì)籬欄網(wǎng)多糖得率的影響 提取溫度的影響見圖4。

圖4 溫度對(duì)籬欄網(wǎng)多糖得率的影響Fig.4 Effects of temperature on yield of Merremiahederacea polysaccharides

由圖4可知，籬欄網(wǎng)多糖得率隨著溫度的升高先增加后降低，90 ℃時(shí)達(dá)最高。可能是溫度增加，改善了籬欄網(wǎng)多糖的溶解性，100 ℃時(shí)，得率略有下降，可能是籬欄網(wǎng)多糖的碳鏈對(duì)熱降解敏感，多糖發(fā)生變性降解，降低了提取過程中靶向回收率?？紤]到溫度越高，能耗越高，選擇提取溫度為90 ℃。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)籬欄網(wǎng)多糖得率的影響 提取時(shí)間的影響見圖5。

由圖5可知，籬欄網(wǎng)多糖得率隨時(shí)間的變化規(guī)律基本符合菲克第二定律：在一定時(shí)間后，固體基質(zhì)和萃取溶液中的溶質(zhì)濃度會(huì)達(dá)到平衡。提取時(shí)間到達(dá)3.5 h時(shí)，多糖得率已趨于穩(wěn)定，再增加反應(yīng)時(shí)間對(duì)多糖得率影響不大。提取時(shí)間選擇3.5 h。

圖5 提取時(shí)間對(duì)籬欄網(wǎng)多糖得率的影響Fig.5 Effects of extraction time on yield of Merremiahederacea polysaccharides

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果 選擇液料比、溫度和提取時(shí)間為自變量，通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化籬欄網(wǎng)多糖的提取工藝，因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)曲面因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and results forresponse surface analysis

用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到籬欄網(wǎng)多糖得率(Y)對(duì)液料比(A)、溫度(B)和提取時(shí)間(C)的回歸模型Y=4.31+0.15A+0.31B+0.25C-0.083AB+0.017AC-0.18BC-0.39A2-0.25B2-0.21C2，方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表3可知，回歸模型的P值<0.000 1，差異顯著。失擬項(xiàng)的值為0.415 6，高于0.05，相對(duì)于純誤差而言不顯著。說明該模型可以用來分析籬欄網(wǎng)多糖的提取工藝。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 使用Design-Expert8.0.6軟件繪制響應(yīng)值與不同影響因子間的響應(yīng)面及等高線圖，見圖6(a～c)。

由圖6a可知，在料液比20～30 mL/g的范圍內(nèi)，隨溫度從80 ℃增加到95 ℃左右，多糖得率增加，而后隨溫度從95 ℃增加至100 ℃，多糖得率變化不大。由圖6b可知，溫度為80～100 ℃時(shí)，隨提取時(shí)間由3 h升至4 h，多糖得率增加，在4 h后多糖提取達(dá)平衡，得率變化不大。由圖6c可知，在提取時(shí)間在3～4 h范圍內(nèi)時(shí)，多糖得率隨料液比增大先升高后降低。

圖6 各因素交互作用對(duì)籬欄網(wǎng)多糖得率的響應(yīng)面及等高線圖Fig.6 Response surface diagrams and contour diagrams of the interactive effects of variousfactors on the yield of Merremia hederacea polysaccharides

據(jù)報(bào)道[8]，溶解率是提取過程中的限速步驟，提取溫度對(duì)多糖的溶解率具有重要影響。因此，溫度是熱水提取法提取籬欄網(wǎng)多糖的關(guān)鍵因素。通常熱水提取法提取植物多糖的最適溫度在90 ℃左右，不同文獻(xiàn)中報(bào)道的溫度范圍略有不同，具體取決于提取物和提取的方法。

回歸方程預(yù)測(cè)籬欄網(wǎng)多糖最佳提取工藝條件為：液料比25.59 mL/g，溫度 94.5 ℃，提取時(shí)間 3.6 h，最大籬欄網(wǎng)多糖得率為 4.39%。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為便于實(shí)際操作，將最佳條件簡(jiǎn)化為：液料比26 mL/g，溫度94.5 ℃，提取時(shí)間 3.6 h，在該條件下提取2次，實(shí)際籬欄網(wǎng)多糖得率為(4.38±0.04)%，與預(yù)測(cè)值4.39%相近。因此，該模型預(yù)測(cè)的籬欄網(wǎng)多糖提取工藝參數(shù)是可行的。

2.3 抗氧化能力分析

多糖的抗氧化性歸因于多糖鏈上的電子供體或氫供體官能團(tuán)，可以通過進(jìn)行體外抗氧化劑測(cè)定。

2.3.1 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基具有不成對(duì)的電子，呈紫色，當(dāng)其遇到自由基清除劑后會(huì)被還原而轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。由圖7可知，籬欄網(wǎng)多糖清除DPPH自由基的IC50為(0.12±0.03)mg/mL。

圖7 籬欄網(wǎng)多糖對(duì)DPPH自由基清除能力Fig.7 Scavenging ability of Merremia hederaceapolysaccharides to DPPH free radical

2.3.2 羥自由基清除能力 羥自由基是自然界危害最大的反應(yīng)性自由基之一，它可以與細(xì)胞中幾乎所有的生物大分子發(fā)生反應(yīng)，清除該自由基對(duì)于預(yù)防氧化損傷至關(guān)重要。由圖8可知，籬欄網(wǎng)多糖對(duì)羥自由基的清除率與抗壞血酸相近，其IC50值為 (1.21±0.02)mg/mL。

圖8 籬欄網(wǎng)多糖對(duì)羥自由基清除能力Fig.8 Scavening ability of Merremia hederaceapolysaccharides to hydroxy free radical

3 結(jié)論

采用熱水浸提法提取籬欄網(wǎng)多糖最佳工藝參數(shù)為：液料比26 mL/g，溫度94.5 ℃，提取時(shí)間3.6 h。在此條件下，籬欄網(wǎng)多糖得率為(4.38±0.04)%。該多糖具有較好的抗氧化能力，可用于食品，藥物和醫(yī)學(xué)應(yīng)用。