馬 英， 劉 曄， 蔣 敏， 范逍遙， 張 臻， 韓 凌， 吳 旸， 賀軼軒

痤瘡是毛囊皮脂腺單位的慢性炎癥性疾病，其發(fā)病與多種因素有關(guān)[1]，其中，痤瘡丙酸桿菌（Cutibacterium acnes）的大量繁殖與痤瘡發(fā)生密切相關(guān)[2]。系統(tǒng)或局部應(yīng)用抗菌藥物抑制痤瘡丙酸桿菌是治療痤瘡的重要手段。然而痤瘡丙酸桿菌對(duì)抗生素的耐藥率正在不斷增加，尤以對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類和林可霉素類的耐藥率最高[3]。以往的研究普遍認(rèn)為痤瘡丙酸桿菌的耐藥性主要是由于染色體變異。例如對(duì)紅霉素和克林霉素的交叉耐藥與編碼23S rRNA 的基因發(fā)生點(diǎn)突變有關(guān)[4-5]。

近年來(lái)，關(guān)于細(xì)菌生物膜形成導(dǎo)致抗菌藥物耐藥的研究越來(lái)越多。體外研究發(fā)現(xiàn)，生物膜內(nèi)細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的抵抗性是浮游菌的1 000倍[6]。有學(xué)者認(rèn)為痤瘡丙酸桿菌生物膜能夠滲透到皮脂中，起到黏合劑的作用，導(dǎo)致角質(zhì)細(xì)胞相互聚集和微粉刺形成[7]。最近的研究在對(duì)不同系統(tǒng)型痤瘡丙酸桿菌菌株體外生物膜形成能力的比較分析中發(fā)現(xiàn)，IA1型菌株顯示出比其他系統(tǒng)型高2～8倍的生物膜形成能力，而同時(shí)IA1型菌株又與中重度痤瘡有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)[8]。本研究通過(guò)體外構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌臨床株的生物膜，分析痤瘡丙酸桿菌耐藥性與生物膜形成的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 2019年1—6月自復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院痤瘡患者皮損處收集分離痤瘡丙酸桿菌44株。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批。

1.1.2 試劑和儀器 哥倫比亞血瓊脂平板購(gòu)自廣州迪景微生物科技有限公司，布氏瓊脂肉湯、腦心浸液培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯、葡萄糖、酵母提取物購(gòu)自英國(guó)OXOID公司，Live/Dead染液購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，CellTiter-BlueTM染液購(gòu)自美國(guó)Promega公司，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（3599）、96孔酶標(biāo)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司，玻璃底熒光皿（FD35-100）購(gòu)自美國(guó)WPI公司，紫外分光光度計(jì)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自德國(guó)Biometra GmbH公司，激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理 對(duì)痤瘡患者面部粉刺、丘疹和膿皰用75%乙醇消毒后，用粉刺針采集痤瘡丙酸桿菌菌株。菌株接種于添加了去纖維蛋白的綿羊血和維生素K的布氏培養(yǎng)基，并置于厭氧箱（5%CO2， 10% H2， 85% N2）內(nèi)培養(yǎng) 72 h。

1.2.2 細(xì)菌鑒定 經(jīng)過(guò)兩個(gè)純化周期后，利用API-20A系統(tǒng)（法國(guó)生物梅里埃公司）對(duì)培養(yǎng)的微生物進(jìn)行鑒定。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 按照瓊脂稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，測(cè)定克林霉素、紅霉素、莫匹羅星、夫西地酸、四環(huán)素的MIC。每種藥物分別采用對(duì)倍稀釋法制備成從128 mg/L到0.06 mg/L 12種不同濃度的瓊脂板。使用多點(diǎn)接種器將每1 μL含有105CFU的痤瘡丙酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌液接種于瓊脂表面，置于37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后測(cè)定MIC。結(jié)果根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)化會(huì)（CLSI）2018年版的標(biāo)準(zhǔn)判讀[9]。

1.2.4 培養(yǎng)基 對(duì)實(shí)驗(yàn)室容易獲得和配置的4種培養(yǎng)基進(jìn)行了比較，包括腦心浸液（BHI）培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基、BHI補(bǔ)充培養(yǎng)基（添加了葡萄糖和酵母提取物的BHI培養(yǎng)基）、TSB補(bǔ)充培養(yǎng)基（添加了葡萄糖和酵母提取物的TSB培養(yǎng)基）。在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)96 h和120 h后，用結(jié)晶紫染色法測(cè)定生物膜的生物量，并用刃天青染色評(píng)估生物膜內(nèi)細(xì)胞活力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與其他三種培養(yǎng)基相比，BHI補(bǔ)充培養(yǎng)基中痤瘡丙酸桿菌的生物膜生物量和細(xì)胞活力均顯著提高，使用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察時(shí)，痤瘡丙酸桿菌表現(xiàn)出更強(qiáng)的黏附力和更有序的生物膜結(jié)構(gòu)。BHI補(bǔ)充培養(yǎng)基是體外構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌生物膜的理想培養(yǎng)基，其配方如下：將37 g BHI干粉和5 g酵母抽提物溶解在1 L去離子水中，并添加葡萄糖以制備1%葡萄糖溶液（pH 7.0）。

1.2.5 細(xì)菌培養(yǎng) 將痤瘡丙酸桿菌接種于BHI補(bǔ)充培養(yǎng)基，37℃ 220 r/min振蕩厭氧培養(yǎng)120 h。用無(wú)菌離心管收集菌體，離心后棄上清液。用BHI補(bǔ)充培養(yǎng)基重懸菌體，使用紫外分光光度計(jì)調(diào)整至D600nm=1.0，再用BHI補(bǔ)充培養(yǎng)基以1∶100稀釋，加入96孔培養(yǎng)板（200 μL/孔），37℃厭氧培養(yǎng)120 h。當(dāng)培養(yǎng)至96 h、120 h時(shí)，分別進(jìn)行以下操作：棄菌液，加入PBS（200 μL/孔）洗去未黏附細(xì)菌，重復(fù)洗3次。

1.2.6 生物膜半定量檢測(cè) 向上述處理好的96孔板內(nèi)加入99%甲醇固定15 min，棄去液體后室溫干燥。再加入1%結(jié)晶紫染色8 min，自來(lái)水沖洗至流水無(wú)色，室溫干燥。10%乙酸溶液溶解生物膜，室溫干燥后使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定D570nm。不接種菌株的BHI補(bǔ)充培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照（Dc）。

1.2.7 生物膜內(nèi)活菌數(shù)量檢測(cè) 在培養(yǎng)處理好的96孔板，每孔加入100 μL生理鹽水，反復(fù)吹打使生物膜內(nèi)細(xì)菌完全重懸于生理鹽水中。將每孔內(nèi)重懸后的菌液分別轉(zhuǎn)移至白色96孔酶標(biāo)板內(nèi)，并向每孔加入20 μL CellTiter-BlueTM試劑，300 r/min搖1 min，37℃厭氧培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀記錄熒光。CellTiter-BlueTM試劑，即溶解于緩沖溶液中的高純度的刃天青。有活性的細(xì)胞可將深藍(lán)色的氧化型染料（刃天青）轉(zhuǎn)化為紅色的還原型染料（試鹵靈），并產(chǎn)生熒光信號(hào)。

1.2.8 生物膜結(jié)構(gòu)觀察 將痤瘡丙酸桿菌接種于BHI補(bǔ)充培養(yǎng)基，使用紫外分光光度計(jì)調(diào)整至D600nm=1.0，再用BHI補(bǔ)充培養(yǎng)基以1∶10稀釋，稀釋后的菌液再加入至玻璃底熒光皿（2 mL/皿），37℃厭氧培養(yǎng)至120 h。棄上清液，生理鹽水輕柔洗3次，加入600 μL Live/Dead染液，室溫放置20 min后于激光共聚焦顯微鏡下觀察。每個(gè)玻璃底熒光皿至少選擇5處進(jìn)行觀察（4個(gè)角落和中央）。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較不同菌株D570nm、560EM/590EX熒光值之間的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用GraphPad Prism 6軟件繪圖，結(jié)果用表示。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)

44株痤瘡丙酸桿菌對(duì)莫匹羅星的耐藥率為100%。對(duì)紅霉素的耐藥率為47.7%，對(duì)克林霉素的耐藥率為56.8%。見(jiàn)表1。18株痤瘡丙酸桿菌對(duì)克林霉素和紅霉素表現(xiàn)出交叉耐藥。將痤瘡丙酸桿菌分為敏感株、克林霉素-紅霉素雙耐藥株、紅霉素耐藥株和克林霉素耐藥株，研究生物膜形成與耐藥的關(guān)系。

表1 痤瘡丙酸桿菌對(duì)抗菌藥物的敏感性和耐藥性Table 1 Susceptibility of Cutibacterium acnes strains to antimicrobial agents

2.2 生物膜半定量檢測(cè)

培養(yǎng)至96 h和120 h時(shí)，結(jié)晶紫染色測(cè)量不同耐藥性菌株的D570nm。Dc為陰性對(duì)照孔的D570nm，當(dāng)D＞Dc則判定為有生物膜形成。所有菌株D570nm均大于Dc，提示有生物膜形成。培養(yǎng)至96 h和120 h時(shí)，全部耐藥菌株D570nm均大于敏感菌株D570nm，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，P＜0.05）。見(jiàn)表2。該結(jié)果說(shuō)明，耐藥株形成的生物膜生物量明顯高于敏感株。

表2 培養(yǎng)至96 h和120 h時(shí)不同耐藥性菌株生物膜生物量Table 2 Cutibacterium acnes biofilm biomass after cultivation for 96 h and 120 h

2.3 生物膜內(nèi)活菌數(shù)量檢測(cè)

培養(yǎng)至96 h和120 h時(shí)，刃天青染色測(cè)量不同耐藥性菌株的560Ex/590Em，培養(yǎng)至96 h和120 h時(shí)，全部耐藥菌株熒光值均大于敏感菌株熒光值，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見(jiàn)表3。該結(jié)果說(shuō)明，耐藥株所形成的生物膜內(nèi)活菌數(shù)量明顯高于敏感株。

表3 培養(yǎng)至96 h和120 h時(shí)不同耐藥性菌株生物膜內(nèi)活菌數(shù)量Table 3 Live bacteria in C. acnes biofilm after cultivation for 96 h and 120 h

2.4 生物膜形態(tài)的觀察

與結(jié)晶紫染色和刃天青染色結(jié)果一致，培養(yǎng)至120 h時(shí)使用激光共聚焦顯微鏡觀察克林霉素-紅霉素雙重耐藥株與敏感株生物膜形態(tài)，發(fā)現(xiàn)兩者具有明顯差異?？肆置顾?紅霉素雙重耐藥株形成的生物膜能夠牢固地附著于玻璃底熒光皿底部，經(jīng)PBS水洗后仍未與玻璃底熒光皿底部脫離。在激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)玻璃底熒光皿底部均勻附著一層膜狀結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部痤瘡丙酸桿菌較為整齊地排列成鏈條狀（圖1A、C）。而抗菌藥物敏感的痤瘡丙酸桿菌形成的生物膜附著不牢固，經(jīng)過(guò)PBS水洗后大部分與玻璃底熒光皿底部脫離，分散成塊狀漂浮。在激光共聚焦顯微鏡下雖可以看到生物膜內(nèi)痤瘡丙酸桿菌相互聚集，但排列雜亂，無(wú)規(guī)律結(jié)構(gòu)（圖1B、D）。

圖1 培養(yǎng)至120 h時(shí)激光共聚焦顯微鏡觀察不同耐藥性菌株生物膜形態(tài)Figure 1 The morphological features of Cutibacterium acnes biofilm after cultivation for 120 hours observed under a confocal laser scanning microscope

3 討論

痤瘡是一種好發(fā)于青春期的毛囊皮脂腺單位的慢性炎癥性皮膚病。痤瘡的臨床特征包括粉刺、丘疹、膿皰、結(jié)節(jié)、囊腫，愈后可留有不同程度的瘢痕，給患者身心健康帶來(lái)很大影響。痤瘡的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，目前認(rèn)為發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因素包括胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、雄激素等激素分泌增加、皮脂腺過(guò)度分泌、毛囊皮脂腺導(dǎo)管角化異常以及炎癥和免疫反應(yīng)[10]。其中，痤瘡丙酸桿菌的大量繁殖與痤瘡發(fā)生密切相關(guān)[2]。

幾十年來(lái)，抗菌藥物一直是治療痤瘡的關(guān)鍵手段。四環(huán)素類、甲氧芐啶-磺胺甲唑、甲氧芐啶、大環(huán)內(nèi)酯類、阿莫西林和頭孢氨芐的療效已得到證實(shí)[11]。然而，痤瘡丙酸桿菌的耐藥率正在不斷上升。其中，痤瘡丙酸桿菌對(duì)紅霉素和克林霉素的耐藥率高達(dá)50%[12]。一些痤瘡丙酸桿菌甚至表現(xiàn)出對(duì)多種抗菌藥物的耐藥性。一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)表明，痤瘡丙酸桿菌對(duì)硫酸新霉素、克林霉素、紅霉素的耐藥率分別為11.7%、33.4%、49.3%，對(duì)多黏菌素B和莫匹羅星則表現(xiàn)出了完全耐藥性[13]。

細(xì)菌生物膜的存在可能在對(duì)抗菌藥物耐藥中起著關(guān)鍵作用。生物膜有三個(gè)關(guān)鍵的組成部分：細(xì)菌細(xì)胞、供細(xì)菌附著的平面，以及細(xì)胞外的多糖蛋白復(fù)合物。生物膜的耐藥機(jī)制包括細(xì)菌分泌的多糖蛋白復(fù)合物阻礙了抗菌藥物的滲透，生物膜深部的休眠細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和代謝率低，特定耐藥基因的表達(dá)，通過(guò)自誘導(dǎo)分子從周圍環(huán)境整合信息等[14-16]。Jahns等[17]發(fā)現(xiàn)痤瘡患者皮損中痤瘡丙酸桿菌生物膜的檢出率（37%）明顯高于良性色素痣患者（13%）。Kravvas等[18]發(fā)現(xiàn)，生物膜與痤瘡、濕疹、化膿性汗腺炎、甲真菌病、粟粒疹和膿皰病的發(fā)病有關(guān)。然而，目前尚無(wú)體外研究報(bào)道痤瘡丙酸桿菌生物膜形成與抗菌藥物耐藥的關(guān)系。

本研究比較了不同痤瘡丙酸桿菌菌株的生物膜形成能力，并分析了生物膜形成與抗菌藥物耐藥性的關(guān)系。在我們之前的研究中發(fā)現(xiàn)，BHI補(bǔ)充培養(yǎng)基是體外構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌生物膜的理想培養(yǎng)基。使用結(jié)晶紫染色法檢測(cè)生物膜生物量，刃天青染色法檢測(cè)生物膜內(nèi)的活菌數(shù)量，使用激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)96 h和120 h后，耐藥株的生物膜生物量（D570nm）和生物膜內(nèi)的活菌數(shù)量（560Ex/590Em）顯著高于敏感株。此外，耐藥株的生物膜經(jīng)過(guò)洗滌后，仍能牢固附著在玻璃底熒光皿底部，形成均勻的膜狀結(jié)構(gòu)，并且生物膜內(nèi)部痤瘡丙酸桿菌整齊地排列為鏈條狀。而敏感株的生物膜經(jīng)過(guò)洗滌，從玻璃底熒光皿底部脫落，呈分散狀漂浮，其內(nèi)部的痤瘡丙酸桿菌雖然相互聚集，但排列雜亂無(wú)章。

本研究結(jié)果表明，痤瘡丙酸桿菌生物膜的形成與其耐藥有關(guān)。此外，與其他耐藥菌株相比，克林霉素-紅霉素雙重耐藥菌株所形成的生物膜內(nèi)部活菌數(shù)量更多，這表明生物膜的形成可能與雙重或多重耐藥性有關(guān)。

針對(duì)痤瘡丙酸桿菌生物膜從植物提取的白藜蘆醇[19]、大花紅景天中提取的紅景天苷等都表現(xiàn)出了抗痤瘡丙酸桿菌生物膜的特性[20]。這些天然藥物的療效與其他抗菌藥物相當(dāng)，但不良反應(yīng)比后者要小。自誘導(dǎo)分子（autoinducers，AI）是細(xì)菌群體感應(yīng)（QS）機(jī)制中的一種分子信號(hào)，在細(xì)菌生物膜形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。因此針對(duì)AI進(jìn)行的藥物研發(fā)在治療生物膜相關(guān)疾病中具有廣闊的前景。Brackman等[21]發(fā)現(xiàn)兩種噻唑烷二酮類衍生物（TZD8和TZD10）是潛在的QS抑制劑，能夠在亞抑菌濃度（sub-MIC）下促進(jìn)痤瘡丙酸桿菌生物膜內(nèi)細(xì)菌解聚播散而不抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，從而減少生物膜中生物量和代謝活躍的細(xì)菌數(shù)量。其與抗菌藥物聯(lián)用可增強(qiáng)生物膜對(duì)抗生素的敏感性，有效改善耐藥狀況。Bumah等[22]發(fā)現(xiàn)450 nm脈沖藍(lán)光照射可破壞痤瘡丙酸桿菌生物膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致生物膜解體，這表明激光治療可能是痤瘡丙酸桿菌相關(guān)疾病的一種新型治療手段。