劉俊楓， 伏 慧， 劉 翔， 王 文， 馬 紅， 臧一銘， 賈 偉， 李 剛

艱難梭菌（Clostridium difficile）是一種主要通過(guò)糞-口途徑傳播的專性厭氧的粗大革蘭陽(yáng)性芽孢桿菌，是院內(nèi)導(dǎo)致胃腸炎相關(guān)感染的重要原因[1]。臨床艱難梭菌感染主要引起患者腹瀉不適，嚴(yán)重者可導(dǎo)致偽膜性腸炎、中毒性巨結(jié)腸、腸壞死，甚至危及生命[2]。本研究旨在了解寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院住院腹瀉患者艱難梭菌感染情況，同時(shí)對(duì)分離菌株進(jìn)行毒素基因檢測(cè)及多位點(diǎn)序列分型（MLST），探討本地區(qū)菌株流行病學(xué)特點(diǎn)，為艱難梭菌監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本收集 收集 2019年1月1日—2020年12月1日此院住院患者腹瀉糞便標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)2017年美國(guó)傳染病學(xué)會(huì)和美國(guó)醫(yī)療保健流行病學(xué)學(xué)會(huì)頒布的成人和兒童艱難梭菌感染臨床實(shí)踐指南[3]，24 h內(nèi)出現(xiàn)過(guò)≥3次包括稀便、糊狀便或水樣便患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：使用導(dǎo)泄劑或灌腸的患者。本研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（倫理審批號(hào) ：2020-864）。

1.1.2 主要儀器與試劑 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF MS）、厭氧產(chǎn)氣袋（法國(guó)生物梅里埃公司），Bugbox厭氧培養(yǎng)箱（英國(guó)Ruskinn 公司），艱難梭菌選擇性培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂平板（英國(guó)OXOID公司），Premix Taq酶（中國(guó)天根有限公司），引物合成及PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海生工有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 艱難梭菌厭氧培養(yǎng)及鑒定 將患者約0.5 g糞便標(biāo)本與95%乙醇等體積混勻，室溫放置30 min后，6 000 r/min離心5 min，取沉渣接種于艱難梭菌選擇性培養(yǎng)基，置于35℃厭氧培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h，挑取黃色、扁平、邊緣不規(guī)則、具有特殊臭味的典型菌落，進(jìn)行質(zhì)譜儀鑒定到種。使用艱難梭菌ATCC 9689為選擇性培養(yǎng)基的質(zhì)控菌株、銅綠假單胞菌ATCC 27853為厭氧培養(yǎng)箱中厭氧環(huán)境的質(zhì)控菌株。

1.2.2 DNA提取及毒素基因檢測(cè) 將鑒定的艱難梭菌純分轉(zhuǎn)種至血平板培養(yǎng)后，刮取約兩環(huán)純菌落，混勻于約150 mL雙蒸水的1.5 mL EP管中，100 ℃金屬浴加熱15 min，12 000 r/min 離心10 min，吸取上清液為DNA模板－20℃保存。參照Griffiths等[4]方案，擴(kuò)增毒素基因tcd A和tcd B。參照Gon?alves等[5]方案檢測(cè)二元毒素基因（ctdA和ctdB），引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系共20 μL：Premix Taq 酶 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 1 μL， DNA 模板 1 μL，ddH2O 7 μL。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠80V恒定電壓電泳40 min成像觀察。

1.2.3 MLST 參照Griffiths等[4]方案，擴(kuò)增 7個(gè)管家基因（adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA和tpi），引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系共50 μL：Premix Taq 酶 25 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 22 μL。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1.0%瓊脂糖凝膠80V恒定電壓電泳40 min成像觀察，有明亮目標(biāo)條帶者，將產(chǎn)物送至上海生工有限公司測(cè)序，將序列輸入網(wǎng)站（https：//pubmlst.org/organisms/clostridioides-difficile）， 獲 取 相 應(yīng)ST型。分型結(jié)果聚類分析采用軟件BioNum-erics BN7.5cn，相似系數(shù)采用Pearson correlation算法，聚類算法選擇非加權(quán)組平均法（UPGMA）。

表1 艱難梭菌毒素基因及MLST分型相關(guān)引物Table 1 Primers used for toxin genes and multi-locus sequence typing of Clostridium difficle

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 26.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料比較符合正態(tài)分布的采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布采用Mann whitneyU檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)或者Fisher確切檢驗(yàn)法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)毒株篩查

530 份患者腹瀉糞便中共檢出艱難梭菌38株（7.2%，38/530），其中產(chǎn)毒型艱難梭菌 36 株（6.8%，36/530），其中tcdA（－）tcdB（+） 菌株5株（13.9%，5/36），tcdA（+）tcdB（+）菌株29株（80.6%，29/36），tcdA（+）tcdB（－）菌株2株（5.5%，2/36）。所有菌株均未檢出二元毒素cdtA、cdtB。

2.2 臨床基本情況

36例艱難梭菌毒素基因陽(yáng)性患者中男24例，女12 例，平均年齡（51.1±13.5）歲，≥60歲 9例（25.0%）；492例非艱難梭菌感染患者，男235例，女257例，平均年齡（53.4±16.6）歲，≥60歲132例（26.8%）。兩組患者比較，性別構(gòu)成比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.037），男性較女性更易發(fā)生艱難梭菌感染。兩組總體年齡和≥60歲病例數(shù)占比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？剖曳植贾?，艱難梭菌感染陽(yáng)性率以ICU、腎臟內(nèi)科、血液內(nèi)科較高。見(jiàn)表2。

表2 艱難梭菌感染組與非感染組基本情況比較Table 2 Baseline data of patients in terms of Clostridium difficile infection

2.3 MLST

對(duì)38株艱難梭菌經(jīng)MLST分型， 部分管家基因電泳圖見(jiàn)圖1。共有18種ST型：分別為ST2（4株）、ST42（4株）、ST54（4株）、ST3（3株）、ST8（3株）、ST35（3株）和ST102（3株），其余為 ST11（2 株）、ST33（2 株）、ST512（2 株）、ST36（1株）、ST39（1株）、ST99（1株）、ST201（1株 ）、ST221（1株 ）、ST323（1株 ）、ST357（1株）和ST415（1株）。艱難梭菌的ST型別比較分散，未見(jiàn)某一型別在單一科室呈優(yōu)勢(shì)型存在；主要為clade1群（32株，84.2%），另外有少量clade3、clade4和clade5群，見(jiàn)圖 2。

圖1 2株艱難梭菌毒素基因、管家基因電泳圖Figure 1 Electrophoretic map of toxin genes and housekeeping genes of two strains of Clostridium difficile

圖2 38株艱難梭菌的進(jìn)化樹(shù)分析Figure 2 Phylogenetic tree analysis of 38 Clostridium difficile strains

3 討論

據(jù)報(bào)道，臨床上約 50%～75% 的抗菌藥物相關(guān)性結(jié)腸炎和95%～100% 的偽膜性腸炎是由艱難梭菌感染引起[6]。在一些歐美國(guó)家，發(fā)生艱難梭菌高產(chǎn)毒株核糖體分型（ribotyping，RT）RT027型、RT078型多次暴發(fā)流行[7]，在美國(guó)艱難梭菌感染發(fā)病率已高于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）引起的感染，成為醫(yī)院感染的首要病因[8]。本研究中，在腹瀉患者中艱難梭菌的分離率為7.2%（38/530），產(chǎn)毒型艱難梭菌分離率為6.8%（36/530），高于2012年寧夏某醫(yī)院通過(guò)酶聯(lián)免疫分析（ELISA）檢測(cè)艱難梭菌毒素陽(yáng)性率3.8%（9/223）[9]，有研究表明艱難梭菌厭氧培養(yǎng)方法靈敏度要高于ELISA，究竟本地區(qū)艱難梭菌陽(yáng)性率是否真實(shí)升高[10]，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。另外，有研究顯示甘肅[11]、內(nèi)蒙[12]等醫(yī)院艱難梭菌產(chǎn)毒株陽(yáng)性率為 9.9%（16/161）和 11.9%（30/252），初步顯示西北地區(qū)艱難梭菌產(chǎn)毒株陽(yáng)性率相較華東（37.5%，90/240；16.1%，33/205）[13-14]、華北（34.6%，45/130）[15]地區(qū)要低，可能與抗菌藥物使用情況有關(guān)，而有些研究側(cè)重調(diào)查腫瘤患者或ICU致使艱難梭菌感染率偏高，有研究顯示，抗菌藥物的使用、腫瘤等基礎(chǔ)疾病是艱難梭菌感染的危險(xiǎn)因素[16-17]。不過(guò)這只是散在醫(yī)院流行病學(xué)數(shù)據(jù)調(diào)查，真實(shí)情況需要更大范圍、多中心研究。

艱難梭菌主要通過(guò)分泌毒素A、B及二元毒素而引起腸道感染，毒素A、B分別由位于致病性決定區(qū)（pathogenicity locus，PaLoc）的tcdA、tcdB編碼，二元毒素由獨(dú)立于PaLoc之外的染色體基因（cdtA、cdtB）編碼，被命名為CdtLoc[18-19]。本研究中，產(chǎn)毒類型以tcdA（+）tcdB（+）cdtA（－）cdtB（－）為主（80.5%，29/36），與相關(guān)研究[20-21]較為一致，國(guó)外流行的菌株絕大多數(shù)也均產(chǎn)生A、B毒素[22]。研究發(fā)現(xiàn)在富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的艱難梭菌通常在平臺(tái)期表達(dá)A、B毒素，而毒素的表達(dá)受多種環(huán)境的影響，包括溫度、某些抗生素的濃度、群體信號(hào)等[23]。本研究中所有菌株雖未檢出二元素基因cdtA、cdtB，但國(guó)內(nèi)已有少數(shù)RT027型[24]、RT078型[25]以及其他型別[26]菌株基因檢測(cè)陽(yáng)性的報(bào)道，它們產(chǎn)生的二元毒素致病力更強(qiáng)，防止其在國(guó)內(nèi)播散流行的問(wèn)題不容忽視[27]。

艱難梭菌分子分型方法很多，歐洲主要使用RT分型，北美主要使用脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）分型，這使得不同型別之間的交流比較困難，MLST是一種可靠準(zhǔn)確的基于7個(gè)管家基因測(cè)序的分型方法，國(guó)內(nèi)常使用此種方法，更利于實(shí)驗(yàn)室之間數(shù)據(jù)共享交流。本研究中，艱難梭菌被分成18種ST型，主要的ST型為ST2、ST42和ST54，這與國(guó)內(nèi)Wang等[28]研究中發(fā)現(xiàn)以ST54、ST2和ST37型為主的結(jié)果較為相似。有研究顯示中國(guó)華北地區(qū)ST54是優(yōu)勢(shì)型別[29]，華東地區(qū)ST37是優(yōu)勢(shì)型別[21]，亞洲其他國(guó)家報(bào)道也流行ST37型[30]，不同的是本研究中未見(jiàn)ST37型。歐美國(guó)家主要流行RT027型， RT型與ST型并非一一對(duì)應(yīng)，但有研究表明RT027型與ST1型密切相關(guān)[31]，本研究未發(fā)現(xiàn)ST1型。遺憾的是本研究未進(jìn)行RT、PFGE分型，篩查人群仍很有限，需要未來(lái)進(jìn)一步的工作。

總之，本研究闡述了艱難梭菌在寧夏地區(qū)一所大型教學(xué)醫(yī)院的毒力基因及MLST型別，豐富了全國(guó)艱難梭菌監(jiān)測(cè)流行病學(xué)數(shù)據(jù)。本地區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)艱難梭菌暴發(fā)流行，隨著危險(xiǎn)因素如過(guò)度使用抗生素、住院老年人口不斷增長(zhǎng)等，意味著艱難梭菌感染可能會(huì)成為一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題。因此，臨床應(yīng)加強(qiáng)對(duì)艱難梭菌的監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)分析和研究， 以預(yù)防艱難梭菌在醫(yī)院內(nèi)感染及流行。