楊劍敏，姜林林，高 原，馬 展，張 泓

上海市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200062

過敏性紫癜(HSP)是一種以小血管炎癥表現(xiàn)為主的變態(tài)反應(yīng)性疾病，在學(xué)齡兒童中的發(fā)病率較高，疾病臨床表現(xiàn)多樣，主要累及皮膚、關(guān)節(jié)、消化道及腎臟[1]。當(dāng)疾病累及腎臟時(shí)，患兒有血尿、蛋白尿表現(xiàn)，從而發(fā)生紫癜性腎炎(HSPN)，甚至可能發(fā)展為腎衰竭，是HSP最為嚴(yán)重的并發(fā)癥[2]。目前，HSP及HSPN的致病機(jī)制尚不明確，但其與機(jī)體免疫異常密切相關(guān)，有報(bào)道聲稱，HSP患兒存在體液免疫功能亢進(jìn)，其血清免疫球蛋白(Ig)水平升高，但并未得出一致的結(jié)論[3]。研究HSP以及HSPN患兒T淋巴細(xì)胞、血清Ig以及補(bǔ)體水平，有助于了解細(xì)胞免疫及體液免疫在HSP以及HSPN中的作用。此外，近年來有研究指出，HSPN患兒血清低糖化IgA1(Gd-IgA1)水平異常，Gd-IgA1的形成改變了IgA1正常生理功能，與HSPN的發(fā)病密切相關(guān)[4]。本研究分析了HSP患兒體內(nèi)免疫細(xì)胞、Ig、補(bǔ)體及Gd-IgA1表達(dá)水平及意義，旨在探究HSP及HSPN的發(fā)生機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將上海市兒童醫(yī)院2017年6月至2020年6月收治的94例HSP患兒納入HSP組，50例健康同齡兒童納入健康組。HSP患兒均符合文獻(xiàn)[5]HSP的診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)皮膚紫癜；(2)彌漫性腹部疼痛；(3)組織病理學(xué)顯示以IgA為主的免疫復(fù)合物沉積；(4)急性關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)腫痛；(5)腎臟受累。其中(1)為必要條件，加上其余條件中的任意一條即可確診。HSP組排除標(biāo)準(zhǔn)：參與研究前2周內(nèi)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)藥物者；合并其他自身免疫性疾病、免疫缺陷性疾病、過敏性疾病、腫瘤性疾病及腎臟疾病者。根據(jù)上海醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)腎臟專業(yè)組制定的HSPN診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，患兒病程中或紫癜消失后，出現(xiàn)血尿(肉眼或鏡下)或尿蛋白即可確診為HSPN。將HSP組患兒分為HSPN組(n=36)及非紫癜性腎炎(NHSPN)組(n=58)兩個(gè)亞組。健康組近1個(gè)月內(nèi)無感染，排除既往過敏性疾病、腎病史及免疫缺陷病等疾病者。HSPN組、NHSPN組及健康組年齡、性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，參與研究的兒童家長(zhǎng)知情且同意。

表1 3組年齡、性別分布情況

1.2方法

1.2.1外周血免疫細(xì)胞檢測(cè) 檢測(cè)儀器：美國(guó)BECTON DICKINSON公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀。檢測(cè)步驟：采集受試者外周靜脈血3 mL，取15%的EDTA三鉀抗凝外周血50 μL，分別加入相應(yīng)熒光CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD19+、CD16+/CD56+單克隆抗體試管，混合均勻后放置在避光處孵育0.5 h；加入裂解液2 mL，10 min后120 r/min離心10 min，棄上清液；加入磷酸鹽緩沖液(PBS)2 mL，1 000 r/min離心10 min，棄上清液；懸浮細(xì)胞加入固定液450 mL，混合均勻后放置在避光處，待上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2免疫球蛋白及補(bǔ)體檢測(cè) 檢測(cè)儀器為SIEMENS BN Ⅱ全自動(dòng)蛋白分析儀。定量檢測(cè)IgA、IgG、IgM水平。免疫比濁法檢測(cè)補(bǔ)體C3、C4水平。

1.2.3Gd-IgA1水平檢測(cè) 抽取受試者外周靜脈血2 mL，3 000 r/min離心15 min，分離上層血清，應(yīng)用上海汲泓生物科技有限公司提供的Gd-IgA1試劑盒檢測(cè)血清Gd-IgA1水平，檢測(cè)步驟：從冰箱中取出試劑盒，室溫復(fù)溫平衡30 min，將濃縮洗滌液稀釋為原倍數(shù)洗滌液，加入標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)標(biāo)本，37 ℃水浴鍋溫浴30 min，洗板4次，加酶標(biāo)工作溶液，37 ℃水浴鍋溫浴30 min，洗板4次，滴加顯色劑A后加入顯色劑B，平板混勻30 s，37 ℃顯色15 min，終止反應(yīng)，測(cè)定各孔吸光度值，計(jì)算標(biāo)本中Gd-IgA1水平。

1.2.4腎功能指標(biāo)的檢測(cè) 采用貝克曼DXI800全自動(dòng)血生化儀檢測(cè)血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、腎小球?yàn)V過率(GRF)水平。

1.3觀察指標(biāo) (1)比較HSPN組、NHSPN組及健康組外周血免疫細(xì)胞水平。(2)比較HSPN組、NHSPN組及健康組Ig及補(bǔ)體水平。(3)比較HSPN組、NHSPN組及健康組血清Gd-IgA1水平。(4)分析3組血清Gd-IgA1水平與腎功能指標(biāo)間的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.13組外周血免疫細(xì)胞水平的比較 HSPN組與NHSPN組患者外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+及CD16+/CD56+水平均較健康組顯著下降(P<0.05)，CD8+及CD19+水平較健康組顯著上升(P<0.05)，HSPN組與NHSPN組外周血免疫細(xì)胞水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組外周血免疫細(xì)胞水平比較

2.23組Ig及補(bǔ)體水平比較 3組IgM及補(bǔ)體C4水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，HSPN組及NHSPN組IgA、補(bǔ)體C3水平均顯著高于健康組(P<0.05)，且HSPN組補(bǔ)體C3水平顯著高于NHSPN組(P<0.05)，HSPN組IgG水平明顯低于NHSPN組與健康組，NHSPN組與健康組IgG水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 3組Ig及補(bǔ)體水平比較

2.33組血清Gd-IgA1水平比較 HSPN組Gd-IgA1水平[(5.63±0.85)mg/L]與NHSPN組Gd-IgA1水平[(3.71±0.76)mg/L]均顯著高于健康組[(2.47±0.41)mg/L]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且HSPN組血清Gd-IgA1水平顯著高于NHSPN組(P<0.05)。

2.43組腎功能指標(biāo)比較 HSPN組GRF水平顯著低于NHSPN組與健康組(P<0.05)，Cr及BUN水平顯著高于NHSPN組與健康組(P<0.05)，NHSPN組與健康組Cr、BUN及GRF水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 3組腎功能指標(biāo)比較

2.5HSPN組患兒血清Gd-IgA1水平與其腎功能指標(biāo)間的相關(guān)性分析 相關(guān)分析顯示，HSPN組患兒血清Gd-IgA1水平與其腎功能指標(biāo)Cr及GRF水平呈明顯正相關(guān)(P<0.05)。見表5。

表5 HSPN組患兒血清Gd-IgA1水平與其腎功能指標(biāo)間的相關(guān)性分析

3 討 論

HSP是學(xué)齡期兒童常見的自身免疫性疾病，疾病以廣泛小血管炎癥為病理基礎(chǔ)，HSP臨床表現(xiàn)多樣，主要癥狀有皮膚紫癜，同時(shí)合并關(guān)節(jié)疼痛、腹痛、便血及腎功能損傷等[7]。多數(shù)患兒經(jīng)治療后，病情穩(wěn)定，預(yù)后良好，但臨床研究數(shù)據(jù)提示，約30%的HSP患兒病情反復(fù)發(fā)作，將繼發(fā)HSPN，患兒腎臟受損。HSPN最終可能發(fā)展為終末期腎病，是HSP最為嚴(yán)重的并發(fā)癥[8-9]。

HSP的具體致病機(jī)制尚不明確，但該病屬于免疫性疾病，與機(jī)體免疫功能紊亂密切相關(guān)[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，HSP患者皮膚損害部位與腎小球基底膜均出現(xiàn)IgA免疫復(fù)合物的沉積，提示HSP與免疫失衡有關(guān)。既往關(guān)于HSP與外周血細(xì)胞免疫功能間的研究不多，機(jī)體免疫狀態(tài)主要與淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能相關(guān)，淋巴細(xì)胞是最重要的免疫細(xì)胞。本文采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)HSP患者外周血免疫細(xì)胞水平，包括T淋巴細(xì)胞(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)、B淋巴細(xì)胞(CD19+)、自然殺傷細(xì)胞(CD16+/CD56+)，結(jié)果提示，HSPN及NHSPN患者外周血T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞水平與健康組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+及CD16+/CD56+水平均較健康組顯著下降，CD8+及CD19+水平較健康組顯著上升，提示HSP患兒機(jī)體T淋巴細(xì)胞總數(shù)及輔助性T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，B淋巴細(xì)胞數(shù)量增多。CD4+/CD8+是評(píng)價(jià)機(jī)體免疫水平與免疫調(diào)節(jié)平衡功能最具意義的指標(biāo)，以上研究結(jié)果提示，HSP患者細(xì)胞免疫功能低下。

此外，本研究還通過檢測(cè)血清IgA、IgG、IgM水平及補(bǔ)體C3、C4水平以了解B淋巴細(xì)胞功能，檢測(cè)結(jié)果提示，HSPN組、NHSPN組患兒IgA水平較健康組明顯上升，這提示患兒體內(nèi)B淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，產(chǎn)生大量Ig[11]。HSPN患兒IgG水平較NHSPN組與健康組下降，可能與HSPN患兒體內(nèi)過多的免疫復(fù)合物(IgGIC)形成，耗損大量IgG有關(guān)[12]。3組IgM水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與某些研究結(jié)果不一致，可能與檢測(cè)方法不同有關(guān)[10]。

解剖學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，HSPN患兒皮膚毛細(xì)血管、腎小球系膜區(qū)內(nèi)存在補(bǔ)體沉積，其主要成分有補(bǔ)體C3c、C4+、C3+復(fù)合物，說明補(bǔ)體C3與HSPN的發(fā)生及發(fā)展關(guān)系密切[13]。補(bǔ)體C3是補(bǔ)體活化途徑的樞紐成分，IgA循環(huán)免疫復(fù)合物沉積是診斷HSP的標(biāo)志，細(xì)胞感染時(shí)，經(jīng)甘露糖結(jié)合凝集素可激活補(bǔ)體促使補(bǔ)體C3水平升高。本研究發(fā)現(xiàn)，HSPN組、NHSPN組及健康組補(bǔ)體C4水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而HSPN組補(bǔ)體C3水平明顯高于健康組及NHSPN組，提示機(jī)體補(bǔ)體C3激活與HSP患兒腎損傷間關(guān)系密切。

有研究顯示，HSP急性期兒童小血管壁內(nèi)沉積大量IgA1，提示IgA1抗體是促使HSP發(fā)病的重要物質(zhì)[14]。IgA1分子存在低糖基化，表現(xiàn)為O-N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)半乳糖基化的程度降低，進(jìn)而引起GalNAc單糖型的糖基增多，半乳糖基化或唾液酸化的糖基形式減少，半乳糖基總含量減少[15]。這種低糖基化的IgA1分子嚴(yán)重影響IgA1的正常功能。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康組相比，HSPN組與NHSPN組患者血清Gd-IgA1水平顯著升高，且HSPN組血清Gd-IgA1水平高于NHSPN組，證明HSPN及NHSPN患兒體內(nèi)存在IgA1低糖基化現(xiàn)象，且Gd-IgA1與HSP疾病發(fā)生及發(fā)展間存在密切聯(lián)系。隨后行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，HSPN組患兒血清Gd-IgA1水平與其腎功能指標(biāo)GRF、Cr水平呈正相關(guān)，說明血清Gd-IgA1水平可有效提示患兒腎功能狀態(tài)。

綜上所述，HSP患兒細(xì)胞免疫功能下降，體液免疫功能亢進(jìn)，HSPN患兒補(bǔ)體C3水平及血清Gd-IgA1水平均上升，且相關(guān)性分析提示Gd-IgA1水平與HSPN患兒腎功能指標(biāo)GRF、Cr水平呈正相關(guān)，檢測(cè)Gd-IgA1水平在輔助診斷HSP患兒腎臟病變中具有一定價(jià)值。