黃少隆，張翠惠，黃冬枚，郭文婷，鄭慶茹，周 湧

廣東省東莞市濱海灣中心醫(yī)院檢驗科，廣東東莞 523903

近年來，金黃色葡萄球菌的臨床檢出率逐年增加，在球菌檢出率中居第一位[1]。作為一種可導(dǎo)致人畜共患病的條件致病菌，其可通過分泌不同的毒力因子引發(fā)各類感染[2-3]。當(dāng)人體免疫力下降時，金黃色葡萄球菌更易引發(fā)人體各組織器官的化膿性炎癥，嚴(yán)重者甚至?xí)鹦膬?nèi)膜炎、腦膜炎以及敗血癥等致死性疾病[4-6]。另一方面，金黃色葡萄球菌極易定殖于女性生殖道內(nèi)，是近年來女性細(xì)菌性陰道炎、盆腔炎發(fā)病率升高的主要原因，并且對處于妊娠期的女性患者而言，金黃色葡萄球菌的感染甚至?xí)?dǎo)致新生兒早產(chǎn)以及妊娠流產(chǎn)[7]。目前，耐藥金黃色葡萄球菌廣泛存在，對感染的患者而言，除正確運用抗菌藥物外，對患處進(jìn)行正確的消毒及有效的沖洗也起著十分重要的作用，因此，進(jìn)一步探討當(dāng)前市面上常見的抗菌洗液對金黃色葡萄球菌的抑制作用具有重要意義[8-9]。本課題組選取了4種不同抗菌機制的洗液進(jìn)行研究，旨在為臨床后期應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1試驗菌株 金黃色葡萄球菌ATCC43300。

1.2試劑與儀器 4種洗液均購于廣東省東莞國藥集團(tuán)有限公司，其主要成分如下：A是由納米銀顆粒為主要成分組成的抗菌洗液；B是由苦參、冰片、黃柏為主要成分組成的中藥制劑；C是以葡萄柚種子為基本原料所提取的一種新型植物抗菌劑；D是由蛇床子、蒼術(shù)、薄荷、苦參以及金銀花為主要成分組成的中藥制劑。腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測試劑盒(ELISA)購于康朗生物科技有限公司；單核巨噬細(xì)胞系購于美國模式培養(yǎng)物研究所；RPMI-1640培養(yǎng)基購于普賽諾生命科技有限公司；VITEX比濁儀購自法國生物梅里埃公司；酶標(biāo)儀購于普朗公司；電子天平購自衡平儀器儀表有限公司；紫外分光光度計購自普美達(dá)公司。

1.3方法

1.3.1不同抗菌洗液對金黃色葡萄球菌生長的影響 采用美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)推薦的肉湯微量稀釋法，將A、B、C、D抗菌洗液按梯度稀釋后，分別添加到無菌的96孔板中，其中第1孔至第11孔分別加入稀釋好的不同濃度的抗菌洗液10 μL，第12孔加入等量的滅菌水作為陰性對照。4種抗菌洗液第1孔到第11孔各藥物濃度分別為200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.20、3.10、1.50、0.75、0.37、0.18 mg/mL。將金黃色葡萄球菌培養(yǎng)復(fù)蘇，并放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h至對數(shù)生長期，通過麥?zhǔn)媳葷岱ǘ浚苽錆舛葹?.5×108CFU/mL的菌懸液，即0.5麥?zhǔn)蠞岫?。用MH肉湯稀釋1 000倍后，每孔中加入100 μL菌懸液，蓋上蓋子后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后判斷結(jié)果，同時測定每孔菌液600 nm處吸光度(A600)值。以首先出現(xiàn)完全抑制金黃色葡萄球菌生長的小孔藥物濃度為最低抑菌濃度(MIC)。用含有0.5及1倍MIC的抗菌洗液的培養(yǎng)基培養(yǎng)金黃色葡萄球菌24 h，分別于0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、24.0 h取對應(yīng)菌液10 μL涂布于MH平板，以孵育時間為橫坐標(biāo)，以菌落數(shù)為縱坐標(biāo)繪制抑菌曲線。

1.3.2金黃色葡萄球菌在不同抗菌洗液作用后對紫外吸收物質(zhì)滲透量檢測 用含有0.5以及1倍MIC的抗菌洗液的培養(yǎng)基培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，在菌液與藥液混合后，金黃色葡萄球菌的終濃度為1.5×105CFU/mL，抗菌洗液終濃度分別為0.5以及1倍MIC。分別于0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h后取相應(yīng)菌液5 000 r/min下離心15 min，再經(jīng)0.2 μm的濾膜過濾上清液后在260 nm下測定懸浮液吸光度(A260)值，以純凈水替代抗菌洗液作用后的菌體懸浮液作空白對照。時間為橫坐標(biāo)，以A260值為縱坐標(biāo)繪制曲線。

1.3.3TNF-α的檢測 將人單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞放置于RPMI-1640培養(yǎng)基中在37 ℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)，按規(guī)定時間更換培養(yǎng)液。誘導(dǎo)分化THP-1細(xì)胞后加入事先配制好濃度的A、B、C、D抗菌洗液預(yù)處理2 h，棄掉上清液后分別向其中加入2×106CFU/mL金黃色葡萄球菌的菌懸液，刺激12 h后，以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心以收集細(xì)胞培養(yǎng)液，隨后使用TNF-α檢測試劑盒(ELISA)測定TNF-α水平。將不受抗菌洗液與金黃色葡萄球作用的THP-1細(xì)胞設(shè)置為空白對照組E。將只受金黃色葡萄球菌作用的THP-1細(xì)胞設(shè)置為陰性對照組SA。

2 結(jié) 果

2.1不同抗菌洗液處理后金黃色葡萄球菌的MIC B、D洗液的MIC為第6孔，即MIC=6.20 mg/mL。A、C的MIC為第7個孔，即MIC=3.10 mg/mL。不同抗菌洗液處理后的金黃色葡萄球菌的A260值見表1。1倍MIC與0.5倍MIC下的抑菌曲線見圖1、2。

表1 不同濃度抗菌洗液處理后的金黃色葡萄球菌的A600值

圖1 金黃色葡萄球菌在1倍MIC下的抑菌曲線

圖2 金黃色葡萄球菌在0.5倍MIC下的抑菌曲線

2.2金黃色葡萄球菌在不同抗菌洗液作用后的A260檢測結(jié)果 結(jié)果顯示，4種抗菌洗液對金黃色葡萄球菌作用后，其A260值與抗菌洗液的濃度成正比，濃度越高，A260值越高。見圖3、4。

圖3 1倍MIC下金黃色葡萄球菌的A260值

圖4 0.5倍MIC下金黃色葡萄球菌的A260值

2.3不同抗菌洗液作用THP-1細(xì)胞后分泌TNF-α水平的比較 不同抗菌洗液作用THP-1細(xì)胞后均產(chǎn)生抑制作用，且抑制效果呈濃度依賴關(guān)系，抑制效果分別為A>C>B>D，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5、6。

圖5 1倍MIC下對金黃色葡萄球菌刺激后THP-1細(xì)胞分泌TNF-α水平

圖6 0.5倍MIC對金黃色葡萄球菌刺激后THP-1細(xì)胞分泌TNF-α水平

3 討 論

本研究通過分析4種抗菌洗液對金黃色葡萄球菌生長、細(xì)胞質(zhì)膜完整性和刺激TNF-α分泌3個方面的影響作用，證實了這4種抗菌洗液對金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌效果。其中，A與C洗液抑菌效果優(yōu)于另外兩種，MIC為3.10 mg/mL，主要原因為抗菌機制不同。

A洗液是一類新型抗菌劑，通過納米銀顆粒直接進(jìn)入菌體內(nèi)部，通過與代謝蛋白酶結(jié)合，使菌體窒息死亡，具有抑菌殺菌作用強大、抗耐藥性及作用持久等優(yōu)點，具有傳統(tǒng)無機抗菌劑無法比擬的抗菌效果[10]。但是，此類洗液對使用及保存要求較高，金屬銀過敏者禁用，且切勿入口，需存放于避光、干燥、通風(fēng)處，以免失效。C洗液主要為葡萄柚種子提取物，是一種高效無毒的抗菌劑，近年來已廣泛應(yīng)用于各種污染手術(shù)的沖洗中，可有效預(yù)防術(shù)后感染。有研究表明，葡萄柚種子提取物還具有調(diào)節(jié)菌群生態(tài)平衡，調(diào)節(jié)女性陰道內(nèi)酸堿度平衡的功效，其主要通過促進(jìn)女性陰道內(nèi)活性氧的吸收，調(diào)節(jié)陰道內(nèi)細(xì)菌的增殖，進(jìn)而實現(xiàn)消炎滅菌的目的[11]。目前市面上此類抗菌洗液的品牌比較少，還未被大眾廣泛應(yīng)用。B配方中主要含苦參、冰片、黃柏等中藥成分，性質(zhì)溫和，常用于會陰部位的日常清潔。同時還具有活血化瘀、減輕傷口疼痛感以及促進(jìn)傷口恢復(fù)等特點[12]，可用于女性會陰傷口護(hù)理。D洗液主要由蛇床子、蒼術(shù)、薄荷、苦參以及金銀花等成分組成，主治女性濕熱帶下，如陰部瘙癢紅腫，白帶量多，色黃或如豆渣狀，口苦口干，尿黃便結(jié)，對于霉菌性、滴蟲性陰道炎有清熱燥濕以及止癢的效果，更適合女性婦科炎癥常規(guī)使用[13-14]。

金黃色葡萄球菌生存及感染均基于菌體的完整性，在自然環(huán)境中，細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)膜可以阻擋內(nèi)容物的泄漏同時吸取養(yǎng)分，形成一個特殊的生物屏障，既保障了滲透壓的穩(wěn)定也在一定程度上阻擋外界有害因素的侵?jǐn)_，是極為重要的組成部分。當(dāng)屏障受損時，細(xì)胞內(nèi)容物才會發(fā)生泄漏，最初是相對分子質(zhì)量比較小的一些無機鹽和微量元素，其次是一些大分子，如蛋白質(zhì)及核酸。在260 nm處，B及D洗液的A值明顯低于其他兩種洗液，說明其對金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的破壞作用較小，這可能由于中藥復(fù)方類型的洗液性質(zhì)溫和，沒有直接作用破壞細(xì)胞膜的靶點。

4類抗菌洗液均可抑制TNF-α水平的分泌且與濃度相關(guān)，A洗液抑制效果最好，而D最差。這可能與納米銀顆粒相對分子質(zhì)量較小可以更快進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)，與相關(guān)的酶結(jié)合使其失活有關(guān)。C作用僅次于A洗液，可能與C的主要成分也是小分子物質(zhì)，比其他兩種藥物更易滲入細(xì)胞有關(guān)。

同時，本研究發(fā)現(xiàn)D洗液的抑菌效果較差，其他3種洗液按照抑菌效果從高到低分別為A>C>B。但是，A洗液價格較為昂貴，使用及保存要求高，所以在生活中未能廣泛使用。同時，本研究證明C洗液也具有良好的抗菌效果，價格適中，但國內(nèi)商品化的產(chǎn)品較少，選擇性低，不為大眾所熟知，可在人們?nèi)粘Ｉ钪型茝V使用。中藥配伍洗液因殺菌譜較廣以及可減少細(xì)胞耐藥性等優(yōu)勢，近年來已被廣泛應(yīng)用。沈煒等[15]研究發(fā)現(xiàn)中藥“婦洗液”治療育齡期女性陰道炎的療效顯著，且療效明顯優(yōu)于克癢舒洗液。

本研究亦存在一些不足。首先，金黃色葡萄球菌毒力因子的調(diào)控機制非常復(fù)雜，本試驗雖研究4種抗菌洗液對抑制TNF-α水平的影響，但卻并未探討其對金黃色葡萄球菌的基因表達(dá)及彼此之間的關(guān)系及具體影響機制，后期有待進(jìn)一步研究。