鄧仲元，賀星，周新強，鄭甦

（深圳市中西醫(yī)結合醫(yī)院骨科，廣東 深圳 518104）

0 引言

膝骨關節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種臨床上最常見的骨關節(jié)疾病，隨著年齡增長，免疫機能退化，預期壽命增加，本病發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[1,2]。研究顯示，各種因素造成關節(jié)軟骨損傷，也會引發(fā)自體抗原和損傷，導致無菌炎癥的產生，進一步損傷關節(jié)軟骨，在膝關節(jié)內產生緩慢、持續(xù)、漸進的炎癥，炎癥在KOA 發(fā)病的進程發(fā)揮重要的角色[3]。臨床上治療KOA 的目標主要是控制癥狀，減輕疼痛，改善膝關節(jié)功能，改善生活質量。治療方法有保守治療，如宣傳教育、下肢功能鍛煉、物理治療、藥物等；有手術治療，如保膝手術、單髁置換術、全膝關節(jié)置換術。從45 歲到60 歲，腸道菌群的具體結構發(fā)生了變化。在60～80 歲趨于相對穩(wěn)定，超過80 歲其菌群結構再次發(fā)生變化，其結構組成和多樣性的改變在許多慢性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用[4]。Toll 樣受體4 是Toll 樣受體（TLR）家族成員之一，其可通過相關信號通路介導炎性反應[5]。白介素1（IL-1）和白介素18（IL-18）是白介素家族成員，均是促炎癥因子，參與炎性反應和組織修復。但是，腸道菌群的群落在KOA 患者是否有變化，是否與炎癥反應存在相互作用的關系，目前尚不十分清楚。為此，作者探討KOA 患者TLR4、IL-1、IL-18 的表達關系，腸道菌群的變化，以及兩者是否存在相關性，為KOA 患者的診療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 一般情況

研究病例來自2017 年1 月至2019 年12 月在深圳市中西醫(yī)結合醫(yī)院骨科治療的慢性膝關節(jié)疼痛病史、X 線檢查并結合臨床表現(xiàn)初次確診膝關節(jié)炎患者74 例的完整臨床資料，為實驗組，男性31 例，女性43 例，年齡40～85 歲，平均年齡(71.0±7.5)歲。對照組為同期在我院進行體檢的年齡大于50 歲的自愿參與本研究的健康人50 例，男性20 例，女性30例，年齡41～86 歲，平均年齡(70.0±7.9)歲。兩組對象性別、年齡、體重指數(shù)、空腹血糖、飲食情況比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。本研究經過醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.1.2 納入標準

（1）實驗組患者的診斷符合膝關節(jié)骨性關節(jié)炎診斷標準。（2）X 線片表現(xiàn)為：非對稱性膝關節(jié)間隙變窄，軟骨下骨硬化，囊性變，關節(jié)邊緣見骨贅形成。MRI 檢查提示膝關節(jié)軟骨變薄，半月板損傷，關節(jié)腔積液等。（3）Kellgren-LawrenceⅠ～Ⅳ級。（4）自愿參與本研究，并簽署告知同意書。

1.1.3 排除標準

（1）既往膝關節(jié)手術史，糖尿病及其他腸道菌群的疾病，服用抗生素等可能影響腸道菌群的藥物。（2）膝關節(jié)腫瘤、結核、化膿性炎，類風濕性關節(jié)炎、強直性脊柱炎及心腦肺腎等嚴重病變者。（3）膝關節(jié)交叉韌帶斷裂者。（4）不愿意參與本研究者。

1.2 方法

1.2.1 血清TLR4、IL-1、IL-18 檢測

抽取所有研究對象清晨空腹肘部靜脈血5mL，送至檢驗科,采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測TLR4、IL-1、IL-18 水平。

1.2.2 腸道菌群的檢測

采集兩組研究對象自然排出的新鮮糞便約6g，置入密閉無菌容器內，0.5h 內送檢中心實驗室。稱取糞便2g，其余置于-80℃超低溫冰箱內保存。提取樣本總NDA，用瓊漿糖凝膠電泳檢測提取DNA 的基因組的完整性。選擇10000 個高質量的16srRNA 擴增子序列進行分析，1 個患者因糞便DNA含量低被排除。所有的樣本的16S rDNA 的V3-V4 區(qū)進行PCR 擴增，送至北京諾禾科技公司進行高通量測序。得到有效序列后進行聚類分析，得到各樣本類別信息，進而得到各類別豐度和均勻度信息，對兩組人群糞便標本中的腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌、梭菌、總菌數(shù)進行培養(yǎng)計數(shù)和鑒定。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 22.0 軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以均值±標準差（±s）表示，兩組之間比較采用t檢驗；非正態(tài)分布的連續(xù)變量以中位數(shù)（四分位數(shù)）表示，兩組之間比較采用非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料以百分率（%）表示，兩組之間比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 兩組血清TLR4、IL-1、IL-18 檢測結果

實驗組血清TLR4 顯著高于對照組，IL-1、IL-18 低于對照組（實驗組血清TLR4 高于對照組，IL-1、IL-18 低于對照組（109.31±22.09）ng/L vs（66.80±6.02）ng/L，（88.55±0.89）pg/mL vs（110.29±20.98）pg/mL, （210.24±22.4）pg/mL vs（345.56±43.62）pg/mL,P<0.05。見表1。

表1 兩組血清TLR4、IL-1、IL-18 檢測結果(±s)

表1 兩組血清TLR4、IL-1、IL-18 檢測結果(±s)

注：*與對照組比較，P<0.05

組別 例數(shù) TLR4（ng/L） IL-1(pg/mL) IL-18(pg/mL)實驗組對照組74 50 109.31±22.09*66.80±6.02 88.55±0.89*110.29±20.98 210.24±22.4*345.56±43.62 tP 28.387 0.000 20.165 0.000 15.951 0.000

2.2 兩組腸道菌群結果的比較（M，lg copies/g 糞便）

實驗組與對照組比較，雙歧桿菌、乳桿菌、腸桿菌、腸球菌、擬桿菌、梭菌、總菌數(shù)比較差異均有統(tǒng)計學意義（8.51±0.56）vs（9.89±0.40），（8.91±0.43）vs（9.69±0.33），（8.96±0.36）vs（8.05±0.31），（8.51±0.42）vs（8.01±0.24），（7.96±0.16）vs（7.09±0.19），（9.16±0.06）vs（9.68±0.87），（8.02±0.24）vs（9.02±0.66）。P<0.05，見表2。

表2 兩組腸道菌群結果的比較（M， lg copies/g 糞便）

2.3 實驗組患者 TLR4、IL-1、IL-18 與腸道菌群的Pearson 相關性分析

經過Pearson 相關性分析，實驗組患者TLR4 與雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌、總菌值呈負相關（P<0.05），與腸桿菌、腸球菌、梭菌呈正相關（P<0.05）；IL-1、IL-18 與雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌、總菌值呈正相關（P<0.05），與腸桿菌、腸球菌、梭菌呈負相關（P<0.05），見表3。

表3 實驗組研究對象TLR4、IL-1、IL-18 與腸道菌群的Pearson 相關性分析

2.4 實驗組患者腸道菌群的logistic 回歸分析

以總菌數(shù)為自變量，TLR4、IL-1、IL-18 為因變量，進 行l(wèi)ogistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，TLR4、IL-1、IL-18 是實驗組患者總菌數(shù)的影響因素。結果見表4。

表4 實驗組患者腸道菌群的logistic 回歸分析

3 討論

膝關節(jié)骨關節(jié)炎（KOA）被認為是全球范圍內致殘的主要原因，關節(jié)軟骨的退變性疾病，后期導致嚴重的疼痛和關節(jié)功能喪失[6]。由于人類平均壽命的延長以及飲食習慣和生活方式的改變，其患病率也在不斷增加。許多因素可以促進KOA 的發(fā)生發(fā)展，腸道菌群近來已成為KOA 起始和發(fā)展的重要致病因素。遺傳，年齡，性別，飲食，生活方式和社會經濟方面是影響機體肌肉骨骼健康以及腸道菌群平衡的重要因素。通過產生大量各種各樣的生物活性小分子，腸道菌群可以向腸外器官發(fā)出信號，與宿主的代謝、內分泌、免疫和肌肉骨骼系統(tǒng)建立復雜的聯(lián)系。腸道菌群的生物多樣性和菌群功能的異常，也稱作腸道菌群失調，很可能與炎癥有關，炎癥是KOA 發(fā)展的最主要危險因素之一。膝關節(jié)骨性關節(jié)炎患者的代謝異常表現(xiàn)為慢性低度全身性炎癥的持續(xù)存在[7]。KOA不僅是關節(jié)軟骨的退變，而且是各種炎癥因子共同參與的代謝性疾病，其特點是軟骨合成降解因子水平降低、促合成因子水平增高，而炎癥因子水平紊亂是該病發(fā)展的重要推動因素[8]。Boer, CG 等認為巨噬細胞介導的炎癥在骨關節(jié)炎相關的疼痛和嚴重程度中有因果作用，并且由腸道菌群產生的內毒素引發(fā)的，認為腸道菌群是膝關節(jié)炎疼痛可能的靶向治療目標[9]。

Toll 樣受體(toll-like receptor,TLR) 作為模式識別受體的關鍵成分之一，在先天免疫系統(tǒng)中起著關鍵作用。Toll 樣受體4(TLR4)是TLR 家族成員，在機體的各種細胞和組織均有表達，能識別病原體，激活一系列免疫應答，是外周血單核細胞抗感染的重要組成部分[10]，影響腸道菌群環(huán)境，對人體腸道內的多種微生物產生作用。KOA 患者腸道菌群的變化很可能與TLR4 及其信號轉導通路存在一定的聯(lián)系。研究表明IL-1、IL-18 均是骨關節(jié)炎的主要細胞因子，刺激介導前列腺素以及膠原酶、中性蛋白酶等軟骨降解酶的合成和分泌，從而導致膝關節(jié)滑膜炎和關節(jié)面軟骨破壞。IL-1、IL-18 是由軟骨細胞、巨噬細胞等多種細胞產生的,是引起骨關節(jié)炎發(fā)病的主要因素[11,12]。人體腸道內的大部分細菌定植于人體結腸內，其對宿主的健康與營養(yǎng)起著重要作用，是激活和維持腸道生理功能的關鍵因素。如果患者腸道出現(xiàn)菌群失調，必將觸發(fā)機體炎癥反應，包括全身性和局灶性炎癥反應，參與KOA的發(fā)生、發(fā)展。

本研究顯示，與對照組進行比較，實驗組患者腸道菌群中，雙歧桿菌、乳桿菌、梭菌數(shù)量減少，而腸桿菌、腸球菌、擬桿菌數(shù)量增加，總菌值也相應減小。膝關節(jié)炎患者經歷慢性反復長期的炎癥因子刺激后，腸道微生態(tài)失衡，腸道細菌發(fā)生異位[13]。腸道菌群隨著患者年齡增長發(fā)生變化，患者的腸道免疫功能低下等[14]。當機體受到外界環(huán)境、飲食及用藥等因素影響時，腸道中的腸桿菌、腸球菌、擬桿菌等條件致病菌可有機會轉為致病菌，破壞機體正常的生理平衡，使得腸道微生態(tài)失調[15]。經過Pearson 相關性研究，KOA 患者TLR4 與與 雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、總菌呈負相關（P<0.05），與腸桿菌、腸球菌、梭菌呈正相關（P<0.05）；IL-1、IL-18 與雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、總菌呈正相關（P<0.05），與腸桿菌、腸球菌、梭菌呈負相關（P<0.05）。經logistic 回歸分析研究發(fā)現(xiàn)，TLR4、IL-1、IL-18 是KOA 患者總菌的影響因素?？赡艿脑蚴荎OA 患者腸道菌群失衡，腸道細菌發(fā)生異位，腸壁通透性增強，形成腸源性內毒素血癥，導致TLR4 過表達，進而誘導膝關節(jié)軟骨發(fā)生免疫應答，同時激活NFκB 途徑促進軟骨細胞中炎性因子IL-1、IL-18 的釋放，引起膝關節(jié)慢性炎性病變。

本次研究發(fā)現(xiàn)膝關節(jié)炎患者TLR4、IL-1、IL-18 的異常表達，影響了患者的腸道菌群，在膝骨關節(jié)炎發(fā)病病程起一定的作用。對于KOA 的發(fā)病原因，腸內因素中具體是哪些腸道微生物及其代謝產物發(fā)揮了重要作用，腸外因素膝關節(jié)自身的疾病變化，還是兩者互為影響，探索更多更精確的分子生物學機制，這將是需要下一步研究的內容。