黃 瑋

（江蘇省徐州市食品藥品監(jiān)督檢驗中心，江蘇 徐州 221000）

保兒寧顆粒由黃芪（炙）、白術(shù)、防風、蘆根、雞內(nèi)金、茯苓和山藥（炒）7 味中藥加工制成，具有益氣固表、健中醒脾功效，用于脾肺氣虛所致的神倦納呆、面黃肌瘦、煩躁不寧、表虛自汗、易感風邪等癥。原質(zhì)量標準收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑（第十五冊）》，僅有理化鑒別項，無含量測定項［1］。為了更好地控制制劑質(zhì)量，本研究中增加了白術(shù)的薄層色譜（TLC）鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定黃芪中有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、防風中有效成分升麻素苷和5－ O－甲基維斯阿米醇苷含量，旨在為完善保兒寧質(zhì)量標準提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國 Waters 公司），配有 Waters 2998PDA 型檢測器；XSR205 型電子天平（瑞士 Mettler 公司，精度為十萬分之一）；TL－360 型超聲波檢測儀（上海聲彥超聲波儀器有限公司，功率為400 W，頻率為 40 kHz）。

1.2 試藥

白術(shù)對照藥材（批號為120925－201611），毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號為111920－201606，純度為97.6%），升麻素苷對照品（批號為 111522 －201913，純度為94.6%），5－ O－甲基維斯阿米醇苷對照品（批號為 111523－201208，純度為 96.5%），均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純，美國Fisher 公司）；水為超純水，其他試劑均為分析純，均購于國藥集團化學試劑有限公司；保兒寧顆粒（江蘇頤海藥業(yè)有限責任公司，批號分別為 190101，190201，190301）。

2 方法與結(jié)果

2.1 白術(shù)薄層鑒別［2］535

取樣品5 g，研細，加水飽和的正丁醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液用水洗滌3 次，每次20 mL，棄去水洗液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取白術(shù)對照藥材0.5 g，加水煎煮2 h，濾過，濾液用水飽和的正丁醇振搖提取3 次，每次15 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為對照藥材溶液。另取按處方工藝制備缺白術(shù)的陰性樣品5 g，同法制備陰性對照品溶液。照2015 年版《中國藥典（一部）》通則0502 薄層色譜法試驗，吸取上述3 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷－丙酮 － 甲酸（9.5 ∶0.5 ∶0.06，V ／ V ／ V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同的藍色熒光斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1。

圖1 白術(shù)薄層色譜圖（365 nm）1.Reference medicinal material solution 2 － 4.Test solution 5.Negative reference solutionFig.1 TLC chromatogram of Atractylodis Macrocephalae Rhizoma（365 nm）

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）－0.2% 磷酸水溶液（B），梯度洗脫 （0 min→20 min→22 min 時 15%A→30%A→15%A）；流速：1.0 mL ／ min；柱溫：32 ℃ ；檢測波長：215 nm；進樣量：10 μL。在此色譜條件下，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、升麻素苷和5－ O－甲基維斯阿米醇苷與各自相鄰峰的分離度均大于2.0，理論板數(shù)均大于6 000。色譜圖見圖2。

圖2 系統(tǒng)適用性試驗高效液相色譜圖1.prim － O － glucosylcimifugin 2.calycosin 7 － O － glucoside 3.5 － O － methylvisammiosideA.Mixed reference solution B. Test solution C.Negative reference solution without Astragali Radix D.Negative reference solution without Saposhnikoviae RadixFig.2 HPLC chromatograms of the system suitability test

2.2.2 溶液制備

取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、升麻素苷和5 － O －甲基維斯阿米醇苷對照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成含毛蕊異黃酮葡萄糖苷 0.151 3 mg ／ mL、升麻素苷 0.342 2 mg ／ mL、5 － O － 甲基維斯阿米醇苷0.304 1 mg／mL 的混合對照品貯備液。精密量取上述貯備液各3 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得混合對照品溶液。取樣品6 g，精密稱定，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理 30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL 容量瓶中，加甲醇定容，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。分別按處方比例及制備工藝制備缺黃芪和防風藥材的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

線性關(guān)系考察：分別配制系列質(zhì)量濃度的升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和5－ O－甲基維斯阿米醇苷對照品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積（A）對進樣量（C，μg）進行線性回歸，得回歸方程 A升＝3.5193 ×107C升＋2.6604 ×104（r ＝0.9999，n ＝6），A毛＝3.904 9 ×107C毛＋1.232 2 ×104（r ＝0.999 8，n ＝6），A維＝2.970 2×107C維＋3.213 8×104（r ＝0.999 9，n ＝6）。結(jié)果表明，升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5－ O－甲基維斯阿米醇苷進樣量分別在 0.342 2 ～2.053 2 μg，0.151 3 ～ 0.907 8 μg，0.304 1 ～ 1.824 6 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取同一混合對照品溶液（升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5－ O－甲基維斯阿米醇苷質(zhì)量濃度分別為 0.076 93，0.039 58，0.079 71 mg ／mL），按2.2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5－ O－甲基維斯阿米醇苷峰面積的 RSD 分別為 0.69% ，0.42% ，0.39%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批（批號為190301）樣品，依法制備供試品溶液，分別于 0，2，4，6，10，24 h 時按 2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5－ O－甲基維斯阿米醇苷峰面積的 RSD 分別為 1.01% ，1.17% ，0.88% （n ＝ 6），表明供試品溶液在室溫下24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復性試驗：取同一批（批號為190301）樣品6 份，依法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5－ O－甲基維斯阿米醇苷的平均含量為分別0.116 30，0.04882，0.102 60 mg ／g，RSD 分別為 0.97% ，1.19% ，0.77%（n ＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為190301，升麻素苷的平均含量為 0.116 30 mg ／g，毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰的平均含量為0.048 82 mg／g，5－ O－甲基維斯阿米醇苷峰的平均含量為0.102 60 mg／g）3 g，共6 份，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，分別精密加入2.2.2 項下混合對照品貯備液1 mL，依法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n ＝6）Tab.1 Results of the recovery test（n ＝ 6）

2.2.4 樣品含量測定

精密吸取對照品溶液和3 批（批號分別為190101，190201，190301）樣品溶液各 10 μL，按 2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按外標法（峰面積）計算含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（mg ／g，n ＝3）Tab.2 Content determination of prim － O －glucosylcimifugin，calycosin 7 － O －glucoside and 5 － O －methylvisammioside in the samples（mg ／g，n ＝ 3）

3 討論

3.1 TLC 法中供試品溶液制備方法選擇

加甲醇超聲處理后，取濾液點樣，TLC 圖斑點較多，分離不好；水飽和的正丁醇超聲處理后，濾液水洗后蒸干正丁醇液，用甲醇溶解，點樣，TLC 斑點干擾少，主斑點顯色清晰。故選擇甲醇和水飽和正丁醇超聲處理。

3.2 HPLC 法色譜條件選擇

波長選擇：文獻［3－7］報道，采用HPLC 法測定升麻素苷、5－ O－甲基維斯阿米醇苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量，測定波長為254 nm，而供試品溶液在檢測波長為254 nm 時各成分峰面積較小。通過紫外分光光度法于210 ～400 nm 波長范圍內(nèi)進行掃描，升麻素苷對照品溶液和5－ O－甲基維斯阿米醇苷對照品溶液分別在 214.6 nm 和 213.4 nm 波長處有最大吸收，毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液在215 nm 波長處有較大吸收。故選擇測定波長為215 nm。

流動相選擇：分別以甲醇 － 水（40 ∶60，V ／ V）［2］149，乙腈（A）－0.05% 磷酸水溶液（B）［8］，乙腈 －水溶液為流動相進行梯度洗脫［9］，比較不同流動相對峰形的影響，經(jīng)調(diào)整最終確定流動相為乙腈－0.2%磷酸水溶液，梯度洗脫程度為0 min→20 min→22 min 時15%A→30%A→15%A，所得各色譜峰的分離度、理論板數(shù)及對稱性均較好。故確定流動相為乙腈（A）－0.2%磷酸水溶液（B）進行梯度洗脫。

3.3 含量測定項下供試品溶液制備方法選擇

考察供試品提取方法及提取時間等影響因素，結(jié)果回流和超聲處理得率相近，超聲處理方法較方便，故選擇超聲處理，分別提取15，30，60 min，結(jié)果超聲處理30 min即可提取完全。