晏 菲，王景媛，曾永成，高佳蓉，強(qiáng)選萍，史亞軍

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院·陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽 712046）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）屬中醫(yī)痹證范疇。《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問·痹論》曰：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也?！憋L(fēng)、寒、濕、熱等外邪侵襲人體，邪留關(guān)節(jié)，經(jīng)脈氣血閉阻不通，不通則痛。RA 患者疼痛、水腫、四肢麻木等體征大都表露于體膚，針對(duì)寒濕痹阻癥患者，以中藥外用，如熏洗、外敷、蠟療、艾灸等［1－4］，直接作用于皮膚或黏膜，吸收更快，直達(dá)病所，發(fā)揮舒筋活血、通絡(luò)止痛、驅(qū)邪外出的作用［5］。抗風(fēng)止痛寧酊劑是我校附屬醫(yī)院治療寒濕痹阻型RA 的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由丹參、紅花、三七、全蝎、生川烏、伸筋草等藥材組方，原工藝采用傳統(tǒng)制備方法，將上述藥材用白酒（規(guī)定濃度）浸泡地藏1 ～3 個(gè)月而得，此法生產(chǎn)周期較長，提取工藝缺乏科學(xué)的評(píng)價(jià)手段和方法。為進(jìn)一步規(guī)范制劑的制備工藝，本研究中采用正交試驗(yàn)法，以乙醇為提取溶劑，丹參酮ⅡA、羥基紅花黃色素A 和總固體含量為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化抗風(fēng)止痛寧的提取工藝，為其現(xiàn)代制劑開發(fā)提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

U－3000 型高效液相色譜儀（美國 Thermo Fisher公司）；BT－25S 型電子天平（賽多利斯＜上海＞貿(mào)易有限公司，精度為十萬分之一）；DHG－9140 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 試藥

丹參酮ⅡA對(duì)照品（批號(hào)為 110766 －201721，含量≥99.5%），羥基紅花黃色素A 對(duì)照品（批號(hào)為111637－201810，含量≥93.1%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙醇為分析純，甲醇、乙醇、乙腈均為色譜純，水為娃哈哈純凈水。丹參、紅花、三七、全蝎、生川烏、伸筋草飲片（陜西興盛德飲片有限公司，批號(hào)分別為20180107，20180825，20180921，20180910，20180910，201800927）。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC －C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 － 水（75 ∶25，V ／ V）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：270 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 溶液制備

取丹參酮ⅡA對(duì)照品 6.13 mg，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，以甲醇溶解并定容，即得質(zhì)量濃度為122.6 μg／mL 的丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液。采用浸漬法提取，將浸出液濾過，濃縮至每100 mL 相當(dāng)于原飲片10 g（總處方量），即得樣品溶液；精密量取樣品溶液25 mL，減壓回收溶劑，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?5 mL，即得供試品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取 2.1.2 項(xiàng)下丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液和供試品溶液各適量，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果理論板數(shù)按丹參酮ⅡA計(jì)應(yīng)不低于3 000，分離度大于1.5，基線分離良好。詳見圖1。

圖1 丹參酮ⅡA 高效液相色譜圖1. tanshinone ⅡAA. Reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms of tanshinone ⅡA

線性關(guān)系考察：精密量取丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以丹參酮ⅡA質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y ＝134.19 X ＋ 28.911（r ＝ 0.999 7，n ＝7）。結(jié)果表明，丹參酮ⅡA質(zhì)量濃度在 6.13 ～ 36.78 μg ／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限確定：精密量取 2.1.2 項(xiàng)下丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，并按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比（ S ／ N）為 3 ∶1 時(shí)計(jì)算檢測限。結(jié)果丹參酮ⅡA的檢測限為 0.01 μg／mL。

精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收試驗(yàn)：按規(guī)定方法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果精密度試驗(yàn)的 RSD 為0.71%，表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)的 RSD 為1.91%，表明室溫下供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定；重復(fù)性試驗(yàn)的 RSD為1.25%，表明方法重復(fù)性良好；平均加樣回收率為99.03%，RSD 為 0.96%（n ＝6），表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.2 羥基紅花黃色素A 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：BD Hypersil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 － 乙腈 － 0.7% 磷酸水溶液（26 ∶2 ∶72，V ／ V ／ V）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：403 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取羥基紅花黃色素 A 對(duì)照品 3.07 mg，精密稱定，置 50 mL 容量瓶中，以甲醇溶解并定容；取1 mL置50 mL 容量瓶中，以甲醇定容，即得質(zhì)量濃度為12.28 μg ／mL 的羥基紅花黃色素 A 對(duì)照品溶液。精密量取2.1.2 項(xiàng)下樣品溶液1 mL，減壓回收溶劑，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?00 mL，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.2.2 項(xiàng)下羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液和供試品溶液各適量，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果理論板數(shù)以羥基紅花黃色素A 計(jì)應(yīng)不低于 3 000，分離度大于1.5，基線分離良好。詳見圖2。

圖2 羥基紅花黃色素A 高效液相色譜圖1. hydroxysafflor yellow AA. Reference solution B.Test solutionFig.2 HPLC chromatograms of hydroxysafflor yellow A

線性關(guān)系考察：精密吸取羥基紅花黃色素A 對(duì)照品溶液 0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置 10 mL容量瓶中，加甲醇定容，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以羥基紅花黃色素 A 質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y ＝26.767 X －1.364 4（r ＝0.999 8，n ＝7）。結(jié)果表明，羥基紅花黃色素 A 的質(zhì)量濃度在0.61 ～ 6.14 μg ／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

定量限與檢測限確定：精密量取2.2.2 項(xiàng)下羥基紅花黃色素A 對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，并按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比（S ／ N）分別為 10 ∶1 和3∶1 時(shí)計(jì)算定量限和檢測限。結(jié)果，羥基紅花黃色素A 的定量限和檢測限分別為 0.012 μg ／mL 和 0.005 μg ／mL。

精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收試驗(yàn)：按規(guī)定方法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果精密度試驗(yàn)的 RSD 為0.86%，表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)的 RSD 為1.78%，表明室溫下供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定；重復(fù)性試驗(yàn)的 RSD為2.31%，表明方法重復(fù)性良好；平均加樣回收率為101.75%，RSD 為 1.16%（n ＝6），表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.3 總固體含量測定

參照2020 年版《中國藥典（四部）》通則“固體總量測定法”，計(jì)算總固體含量（%）。精密量取樣品溶液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，計(jì)算供試品中總固體含量（%）。

2.4 單因素考察

乙醇體積分?jǐn)?shù)：取處方量藥材粗粉5 份，分別加10倍量50%，60%，70%，80%，90%乙醇浸漬3 d，綜合評(píng)分顯示，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)達(dá)到最大值。故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)因素的三水平分別為60%，70%，80%。

乙醇用量：取處方量藥材粗粉5 份，分別加入5，10，15，20，25 倍 70%乙醇浸漬 3 d，綜合評(píng)分顯示，隨著乙醇用量的增加，綜合評(píng)分逐漸升高，但當(dāng)乙醇用量超20 倍后增加不明顯。故選擇乙醇用量的三水平分別為15，20，25 倍。

浸漬時(shí)間：取處方量藥材粗粉5 份，加入10 倍量70% 乙醇，分別浸漬 1，2，3，4，5 d，綜合評(píng)分顯示，在提取1 ～3 d 時(shí)逐漸升高，4 d 以上時(shí)基本無變化。綜合提取次數(shù)的影響，從提高效率方面考慮，故選擇浸漬時(shí)間的三水平分別為 2，3，4 d。

提取次數(shù)：取處方量藥材粗粉5 份，分別加入10 倍量 70%乙醇，浸漬 3 d 為 1 次，分別考察提取 1，2，3，4，5 次的情況。綜合評(píng)分顯示，在提取1 ～3 次時(shí)升高，提取3 次后基本無變化，說明3 次時(shí)已基本提取完全。故選擇提取次數(shù)的三水平分別為1，2，3 次。

2.5 正交試驗(yàn)

以丹參酮ⅡA含量（Ⅰ）、羥基紅花黃色素A 含量（Ⅱ）、總固體含量（Ⅲ）及綜合評(píng)分（Ⅳ）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用綜合加權(quán)評(píng)分法［6］，根據(jù)影響提取工藝因素的大小、權(quán)重系數(shù)分別記為 0.4，0.4，0.2，綜合評(píng)分 ＝丹參酮ⅡA含量 ／丹參酮ⅡA含量max×0.4 ×100 ＋羥基紅花黃色素A含量 ／羥基紅花黃色素 A 含量max×0.4×100 ＋總固體含量 ／總固體含量max×0.2×100。以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、乙醇用量（B）、浸漬時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）為考察因素，設(shè)計(jì) L9（34）正交試驗(yàn)。結(jié)果見表1 至表3。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factors and levels the L9（34） orthogonal test

由表2 和表3 可知，各因素對(duì)提取效果的影響強(qiáng)度依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取次數(shù)＞浸漬時(shí)間＞乙醇用量，最佳參數(shù)為A2B3C2D3；僅A 因素對(duì)提取有顯著影響。從節(jié)約能源和提高效率的角度出發(fā)，選擇最佳提取工藝為A2B1C2D3，即加15 倍量70%乙醇，浸漬3 次，每次3 d，將浸出液濾過、濃縮，調(diào)整至含醇量為70%，且每100 mL 相當(dāng)于原飲片（總處方量）10 g。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Tab.2 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Results of ANOVA

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

按最佳提取工藝進(jìn)行6 次平行試驗(yàn)，并測定丹參酮ⅡA、羥基紅花黃色素A 及總固體含量。結(jié)果丹參酮ⅡA、羥基紅花黃色素A 和總固體的平均含量分別為0.016 2 mg／mL（RSD 為 1.23% ）、0.485 5 mg ／mL（RSD 為 1.38% ）和18.81%（RSD 為 2.06%）。結(jié)果表明，該工藝合理可行。

3 討論

該制劑處方藥材的主要有效成分為丹參中丹參酮類、紅花中黃酮類、三七中皂苷類、川烏和伸筋草中生物堿類等，為了確保有效成分提取率，參考文獻(xiàn)［7－8］和原工藝白酒浸泡地藏方法，本研究中采用乙醇浸漬提取。主藥丹參、紅花為經(jīng)典藥對(duì)，為活血化瘀之要藥。丹參中丹參酮ⅡA具有抗血小板聚集、抗炎、抗氧化等作用［9－11］，紅花中羥基紅花黃色素A 具有抗血小板聚集、抗炎、鎮(zhèn)痛及抑制軟骨細(xì)胞凋亡的作用［12－16］，二者為主要指標(biāo)性成分，總固體含量測定在中藥提取物質(zhì)量和制劑有效成分含量控制上具有重要意義，故選擇丹參酮ⅡA、羥基紅花黃色素A 及總固體含量作為工藝優(yōu)化的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

優(yōu)化工藝中用70%乙醇提取，有利于有效成分的浸出，且乙醇無毒、價(jià)低易得，適合用于工業(yè)化大生產(chǎn)，在確保有效成分含量的同時(shí)大大提高了制劑效率、制劑質(zhì)量和療效。臨床應(yīng)用的大部分中藥制劑以經(jīng)驗(yàn)配制為主，多數(shù)尚未完善提取工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其成分缺乏科學(xué)監(jiān)測，該類制劑提取工藝的考察能較好地解決這一問題，也為今后制劑配制的規(guī)范化與工業(yè)化生產(chǎn)提供了依據(jù)。