黃文潔，陳中健，譚深源，肖仁仔，于永濤，劉建華，李文燕，晏石娟

（1.廣東省農業(yè)科學院農業(yè)生物基因研究中心/廣東省農作物種質資源保存和利用重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.廣東省農業(yè)科學院作物研究所/廣東省農作物遺傳改良重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】隨著人們生活水平的提高及對高品質生活的追求，市場對優(yōu)質甜玉米的需求日趨旺盛。食味品質是衡量甜玉米品質優(yōu)劣的重要指標之一，果皮厚度和淀粉含量直接影響鮮食玉米的食用品質。探索建立一種簡便、直觀的從超微結構水平對甜玉米食味品質進行鑒定的方法，不僅有助于揭示不同類型甜玉米籽粒超微結構的差異及其與品質性狀的相關性，而且有助于玉米籽粒果皮、淀粉粒等超微形態(tài)學研究，為優(yōu)質甜玉米新品種培育和遺傳改良提供數(shù)據(jù)支撐?！厩叭搜芯窟M展】玉米是我國第一大糧食作物，近年來年產量穩(wěn)定在2 600 萬 t 左右，占全國糧食產量的1/3 以上（2020 年國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)），2020年玉米播種面積達3 846.67 萬hm2，居我國糧食作物播種面積首位［1-2］。甜玉米又稱蔬菜玉米，作為新型果蔬、營養(yǎng)食品，因其優(yōu)質、可口、風味獨特、營養(yǎng)健康而深受廣大消費者青睞［3-4］。相對于普通玉米，甜玉米中攜帶了1 個或多個可以顯著提高籽粒含糖量的單一或雙隱性突變基因（普甜玉米su1或su2、加強甜玉米su1和se、超甜玉米sh2或bt2）［5］，影響淀粉合成途徑中部分還原性糖向淀粉轉化，導致淀粉合成受阻，而蔗糖等糖類物質在胚乳中積累［6］。優(yōu)質甜玉米具有果皮薄、柔嫩性好、淀粉含量低、可溶性糖含量高、口感好等特點［7］，這些特性屬于作物品質性狀范疇，受多基因的調控。基于基因組學［8］、轉錄組學［9］、代謝組學［10］及全基因組學關聯(lián)分析［11］等多組學手段發(fā)掘鑒定玉米食味等品質性狀相關的基因，促進了玉米品質形成及變化機制的研究。甜玉米果皮的柔韌性直接影響口感等食味品質，常用的鑒定方法主要有品嘗法、測微尺法和硬度計法［12］，而胚乳的淀粉含量、淀粉粒大小與分布等超微結構與營養(yǎng)、食味等品質性狀具有一定的相關性［13］，從超微結構水平進行品質鑒定將成為甜玉米食味品質鑒評的重要組成部分。

【本研究切入點】掃描電鏡具有分辨率高、景深大和圖像直觀等優(yōu)勢，可清晰地觀察樣品外表面或截面的超微結構［14］，樣品制備方法在很大程度上影響樣品超微結構的成像質量。除了戊二醛固定法外，液氮斷裂法［13］、低熱烘干法［15］等樣品制備方法已用于玉米淀粉粒超微結構的觀察研究，但尚未見對這些方法進行比較研究的報道。上述方法均需進行前處理，實驗過程復雜、周期長，而直接制樣法則相對簡便、亦尚未見相關報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過比較戊二醛固定法、低熱烘干法和直接制樣法等3 種不同樣品制備方法在新鮮甜玉米籽粒超微結構成像質量上的優(yōu)劣，優(yōu)化并建立一種簡便且能同時觀察甜玉米果皮和胚乳超微結構的制樣方法，并將其應用于不同類型甜玉米的食味品質鑒評。

1 材料與方法

1 試驗材料

供試普通玉米B73、普通甜玉米C213、加強甜玉米C265、超甜玉米C103 和甜糯雙隱玉米C221 等5 個品種均栽種在廣東省農業(yè)科學院大豐實驗基地，常規(guī)栽培，開花期人工授粉。于人工自交授粉后25 d，以新鮮飽滿乳熟甜玉米籽粒為起始研究材料，后期采用取材位于果穗中部的新鮮甜玉米籽粒為試驗材料。

試驗儀器：二氧化碳臨界點干燥儀（Samdri-PVT-3D，美國Tousimis 公司），離子濺射儀噴金（MSP-2S，美國IXRF systems 公司），掃描電子顯微鏡（Hitachi S-3400N，日本Hitachi 公司），全自動體視熒光及成像系統(tǒng)（Zeiss SteREO Lumar V12，德國Zeiss 公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 戊二醛固定制樣法及掃描電鏡觀察 取新鮮甜玉米籽粒，用雙面刀片小心快速在胚乳冠部橫切，切成薄片，加入2.5%戊二醛溶液，4 ℃固定8 h；再用pH 7.4、0.1 mol/L 磷酸緩沖液常溫漂洗3 次，每次15 min；分別用30%、50%、70%、80%、90%乙醇脫水15 min，然后用100%乙醇脫水3 次、每次15 min；用二氧化碳臨界點干燥儀干燥后，用電鏡導電膠粘臺、離子濺射儀噴金，用掃描電子顯微鏡觀察。

1.2.2 低熱烘干制樣法及掃描電鏡觀察 取新鮮甜玉米籽粒，35 ℃烘干72 h，用手輕輕橫斷掰開胚乳，盡量保持自然斷開狀態(tài)，斷裂面朝上，用電鏡導電膠粘臺、離子濺射儀噴金，用掃描電子顯微鏡觀察。

1.2.3 直接制樣法及掃描電鏡觀察 取新鮮甜玉米籽粒，用雙面刀片小心快速在胚乳中部橫斷切開，切成薄片，用電鏡導電膠粘臺、噴金，用掃描電子顯微鏡觀察。

1.2.4 不同類型甜玉米籽粒外觀形態(tài)觀察成像取新鮮甜玉米籽粒，置于全自動體視熒光及成像系統(tǒng)下，調節(jié)合適光圈和倍數(shù)，應用Axio Vision Rel 4.8 軟件拍照。

2 結果與分析

2.1 不同制樣方法甜玉米果皮超微結構比較分析

果皮厚度是衡量鮮食玉米品質的重要指標，也是影響鮮食玉米食味品質的重要因素之一。本研究所用甜玉米籽粒粒型規(guī)則（圖1A），采用戊二醛固定法、低熱烘干法和直接制樣法等3 種不同制樣方法下所觀察的果皮超微結構各有差異。由圖1B 可知，戊二醛固定法甜玉米樣品果皮完整細胞層，排列有序、層次錯落有致，細胞層之間結構清晰可見，同時，還能辨別出糊粉層和淀粉胚乳層，淀粉胚乳細胞壁可見，腔室完整；由圖1C 可知，低熱烘干法甜玉米樣品果皮細胞層相互黏連皺縮，分辨不出獨立細胞層，糊粉層排列疏松不成形，淀粉胚乳層中看不到完整的胚乳細胞壁；由圖1D 可知，直接制樣法甜玉米樣品果皮細胞層相互擠壓，細胞腔室分辨不清，糊粉層排列有序，但是內容物不及戊二醛固定法清晰，淀粉胚乳細胞之間間隔可見，但細胞壁沒有像戊二醛固定法樣品那樣裸露。

圖1 不同制樣方法下的甜玉米果皮超微結構形態(tài)比較Fig.1 SEM images of sweet corn pericarp under different sample treatments

2.2 不同制樣方法甜玉米淀粉粒超微結構比較分析

甜玉米籽粒內淀粉粒的微觀結構可以在一定程度上反映其營養(yǎng)物質組成，而營養(yǎng)品質是評價鮮食玉米的重要指標。與果皮結構類似，戊二醛固定法、低熱烘干法和直接制樣法等3 種不同制樣方法下所觀察到的淀粉粒結構也不盡相同（圖2）。戊二醛固定法可以看到完整的胚乳細胞壁，飽滿的近圓球狀淀粉粒結構，淀粉粒呈聚集分布、排列緊密，外表比較光滑裸露，相互間分離比較好，淀粉粒間有粘連的基質蛋白（圖2A、B）；低熱烘干制樣法辨別不出完整的胚乳細胞和單獨內含淀粉粒形態(tài)，淀粉粒間有粘連不成形（圖2C、D）；直接制樣法能呈現(xiàn)出完整的胚乳的細胞，也能看到近圓球形的淀粉粒，但是與戊二醛固定法比較，淀粉粒的形態(tài)并不清晰（圖2E、F）。

圖2 不同制樣方法下的甜玉米淀粉粒超微結構形態(tài)Fig.2 SEM images of starch endosperm of sweet corn under different sample treatments

2.3 戊二醛固定法應用于不同類型甜玉米果皮外觀、細胞結構及顯微形態(tài)等水平的品質鑒定

與其他方法相比，戊二醛固定法是獲得甜玉米籽粒超微結構比較理想的方法。為了更好地驗證該法能否清晰獲得不同類型甜玉米籽粒超微結構特征，本研究以普通玉米B73 為對照，對不同類型的甜玉米果皮超微形態(tài)進行比較，結果顯示：從籽粒外觀上觀察，不同類型的玉米籽粒外觀大小差別不大，籽粒形狀相似，但甜玉米比普通玉米B73 表面有一定的皺縮（圖3 A、D、G、J、M），其中超甜玉米C103 和甜糯雙隱玉米C221 外觀有明顯凹陷（圖3J、M）。從籽粒結構來看，不同類型玉米結構層次有所不同，普通玉米B73 具有典型的果皮/種皮、外胚乳、糊粉層和淀粉胚乳4 層結構，果皮細胞間層次分明，排列整齊，腔室可見，外胚乳層細胞間排列致密度高，糊粉層細胞體積大，排列疏松，胚乳層細胞大而排列緊密，淀粉粒大而分散好（圖3B、C）；普通甜玉米C213 果皮細胞整齊度參差不齊，外胚乳結構不明顯，糊粉層細胞單層結構大，排列齊整，胚乳細胞層細胞結構不清晰（圖3E、F）；加強甜玉米C265果皮層厚度增強，細胞層之間厚薄不一，單層糊粉層細胞變大，排列疏松，胚乳細胞層能看到凌亂的細胞壁結構（圖3H、I）；超甜玉米C103 果皮層變薄，外胚乳和糊粉層結構均不明顯，胚乳層細胞呈類蜂窩狀，細胞腔室明顯，細胞壁清晰（圖3 K、L）；甜糯雙隱玉米C221 果皮層細胞壁增厚，細胞排列齊整，糊粉層細胞大，胚乳層細胞不明顯（圖3 N、O）。

圖3 不同類型甜玉米果皮外觀和顯微形態(tài)Fig.3 Appearance and microstructure of different types of sweet corn pericarp

2.4 戊二醛固定法應用于不同類型甜玉米淀粉粒形態(tài)、分布及超微結構等水平的品質鑒定

一般而言，普通玉米籽粒含淀粉73%、蛋白質9%、脂肪4%和諸如纖維的其他成分14%［16］，而甜玉米淀粉含量通常較普通玉米少，可溶性糖含量高。淀粉、蛋白質、脂肪和可溶性糖等物質對甜玉米食味品質起著決定性因素作用。其中淀粉在玉米胚乳中主要以淀粉粒形式存在，可以通過超微結構進行比較分析。從玉米籽粒淀粉分布來看，不同類型玉米籽粒中胚乳淀粉含量、分布、形態(tài)大小不同，普通玉米B73 淀粉粒呈現(xiàn)多邊形或球形，淀粉含量高、分布均勻，淀粉顆粒大，淀粉體發(fā)育充實好，排列緊密（圖4A、B）；普通甜玉米C213 淀粉粒較小，近圓球狀，排列疏松，中間分布有基質蛋白（圖4C、D）；加強甜玉米C265 淀粉粒大小不一，性狀各異，有相互聚集也有獨立存在，胚乳細胞內充滿大量拉絲狀基質蛋白（圖4E、F）；超甜玉米C103 淀粉粒分布不均一、分布稀疏，淀粉顆粒也較小、更接近球形，表面更光滑，淀粉粒間隙大，淀粉粒外有少量絮狀蛋白黏附（圖4G、H）；甜糯雙隱玉米C221 的淀粉粒大小不一，呈不規(guī)則的多面體狀，分布不均一，淀粉粒間隙有粘連的基質蛋白（圖4I、J）。與普通玉米B 73 相比，甜玉米的胚乳細胞結構疏松，淀粉粒個體較小，在測試樣品中，淀粉粒大小以普通玉米B73 最大，其次是普通甜玉米C213 與甜糯雙隱玉米C221 相似，然后是加強甜玉米C265，超甜玉米C103 最小。

圖4 不同類型的甜玉米胚乳超微結構Fig.4 Endosperm ultrastructures of different types of sweet corn

3 討論

掃描電鏡具有制樣簡單、圖像直觀和分辨率高等諸多優(yōu)點，但由于制樣方法的不同往往會對生物樣品造成損傷，導致在電鏡下觀察時常會失真或有假象。因此，掃描電鏡樣品制備方法對于獲得高質量的超微結構圖像至關重要。液氮制樣法［13］是將甜玉米籽粒用戊二醛固定后再用液氮短暫冷凍后制樣，該方法獲得的超微結構圖像質量與本研究的戊二醛固定法相似。本研究將新鮮玉米籽粒切薄片后再用戊二醛固定，不需要液氮，較簡便，同時還降低了實驗條件的要求。此外，本研究比較了戊二醛固定法、低熱烘干法和直接制樣法，發(fā)現(xiàn)戊二醛固定法能夠較好地呈現(xiàn)出甜玉米果皮的結構層次、胚乳淀粉粒形態(tài)和表面結構；而低熱烘干制樣法和直接制樣法雖然操作簡單，但均沒有獲得滿意的果皮和淀粉粒超微結構，提示戊二醛固定法制樣可用于甜玉米果皮細胞層數(shù)、厚度，胚乳淀粉粒形態(tài)、分布及表面結構等超微水平的食味品質鑒評研究。

甜玉米籽粒的超微結構與品質性狀之間存在相關性［17-19］，表現(xiàn)為不同類型甜玉米在果皮和淀粉粒等超微結構上存在明顯差異。為了進一步驗證基于掃描電鏡技術的戊二醛固定制樣法在甜玉米食味品質鑒評中的應用，我們比較分析不同類型的4 個代表性甜玉米品種籽粒果皮和胚乳淀粉的超微結構發(fā)現(xiàn)，與普通玉米相比，甜玉米的結構層次不清晰，尤其是超甜玉米外胚乳和糊粉層均不明顯；超甜玉米的淀粉胚乳空隙大，淀粉粒小、分布稀落，提示這些特征與外觀皺縮有一定的關聯(lián)性。熊飛等［20］比較了甜玉米、普通玉米和糯玉米3 種不同類型的成熟干籽粒超微結構，結果顯示甜玉米籽粒超微結構與本研究的新鮮超甜玉米類似，均為胚乳細胞大、排列疏松，淀粉粒大多呈圓球狀、排列松散，淀粉粒與胚乳細胞間隙大；但不同類型甜玉米在超微結構上存在一些不同，本研究中超甜玉米的淀粉粒大小差異不大，而加強甜玉米的淀粉粒大小差異大，普通甜玉米的淀粉粒大、形狀不均一，表明甜玉米胚乳淀粉粒的大小與品種相關。

4 結論

本研究以新鮮甜玉米籽粒為研究對象，通過比較戊二醛固定法、低熱烘干法和直接制樣法等3 種掃描電鏡制樣方法，發(fā)現(xiàn)戊二醛固定法是一種理想的獲得甜玉米籽粒果皮細胞結構層數(shù)、厚度及淀粉粒形態(tài)與分布等超微結構的方法。從超微結構水平，應用戊二醛固定制樣法對不同類型的甜玉米果皮和淀粉粒等兩個與食味品質密切相關的指標進行比較分析表明，普通玉米、普通甜玉米、加強甜玉米、超甜玉米和甜糯雙隱玉米的籽粒外形、籽粒結構、果皮結構，淀粉粒外形、密度、大小，以及基質蛋白等均存在差異，與傳統(tǒng)品嘗法鑒定結果基本相一致。綜上，本研究結果表明，戊二醛固定法能夠可以獲得清晰地甜玉米籽粒果皮和淀粉粒等超微結構圖像，其超微結構的差異可以間接反映甜玉米品質的優(yōu)劣，該方法可應用于甜玉米的品質鑒評及遺傳改良研究。