胡根海，張曉紅，趙元增

（河南科技學院生命科技學院/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003）

【研究意義】紫薯〔Ipomoea batatas（L.）Lam〕又稱紫心甘薯、黑薯，為1 年生旋花科類草本植物，因薯肉常呈紫色或紫黑色而得名。紫薯不僅可以直接食用，而且還可以用于色素提取、飲品開發(fā)，具有更廣應用價值［1］。越南紫薯與一般的紫薯相比，淀粉和維生素含量更高，口感特別粉糯。和普通國產(chǎn)紫薯相比，越南紫薯果肉皮薄細嫩，薯香濃郁，肉質(zhì)細膩，但薯塊較小。目前紫薯的薯塊均較小，平均每667 m2產(chǎn)量在2 000 kg 左右［2］，如審定品種寧紫薯1 號2 年平均為1 805.6 kg，遠低于普通甘薯3 000 kg 以上的產(chǎn)量。因此改良越南紫薯提高產(chǎn)量穩(wěn)定品質(zhì)成為當前研究熱點?！厩叭搜芯窟M展】生產(chǎn)上常用莖尖培養(yǎng)生產(chǎn)脫毒苗［3］。在薯苗培育過程中要消耗大量的薯塊，這直接導致栽培種苗無法滿足人們的需求［4-5］。組織培養(yǎng)可以誘導形成胚性愈傷，胚性愈傷進一步發(fā)育形成體細胞胚胎，體細胞胚胎發(fā)育為植株，在體細胞胚胎分化擴繁過程中可以顯著提高繁殖系數(shù)。甘薯是種性退化速率較高的作物，無性繁殖幾代后薯塊品質(zhì)即下降，體細胞胚是相對穩(wěn)定的繁殖方式，有利于種苗繁育的遺傳穩(wěn)定。有研究報道甘薯的塊根組織培養(yǎng)已獲得愈傷組織，但未獲得胚性愈傷［6］，通過莖尖、葉片培養(yǎng)易獲得愈傷組織，同時可獲得少量胚性愈傷［7-8］。已有研究認為胚性愈傷組織的誘導率可能與甘薯基因型有關，不同基因型的甘薯誘導率差異極大［9］。目前紫薯多見誘導愈傷的報道［10-11］和莖尖培養(yǎng)直接成苗技術［12-14］，而且這些材料是20 世紀90 年代最初引進的紫肉甘薯品種日本農(nóng)家種山川紫的后代?！颈狙芯壳腥朦c】越南紫薯是紫薯一個新引進種，其組織培養(yǎng)還未見報道，試驗擬以越南紫薯為材料，以葉片和莖段作外植體，分析6-BA 和NAA 在愈傷組織誘導中的作用，2,4-D 和6-BA 在愈傷組織轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝杂鷤M織、ABA 在胚性愈傷形成體細胞胚胎中的作用，探討在MS 培養(yǎng)基中附加植物生長調(diào)節(jié)物誘導胚性愈傷并分化為體細胞胚的有效方案?！緮M解決的關鍵問題】篩選適合越南小紫薯基因型的外植體誘導愈傷組織、胚性愈傷和體細胞胚的適宜培養(yǎng)基，為越南紫薯的工廠化育苗和遺傳改良提供途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試越南紫薯于2020 年3 月6 日購自超市蔬菜區(qū)。

1.2 試驗方法

1.2.1 紫薯催芽育苗 2020 年3 月8 日培養(yǎng)盒中排列紫薯，用細沙覆蓋，澆水保持濕潤，置于25～30 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，約10 d 左右出芽，待芽長到20 cm 時備用。

1.2.2 外植體獲得 挑選幼嫩正在生長的葉片和莖段，流水沖洗后，在超凈工作臺上，先用體積分數(shù)70%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗1～2 次，再用質(zhì)量分數(shù)0.1% HgCl2消毒2～3 min，無菌水沖洗4～6 次，無菌濾紙吸干表面水分，無菌剪刀將葉片剪成0.5 cm×0.5 cm 的小方塊，莖段剪成1 cm，接種到30 mL 固體MS 培養(yǎng)基上，25（±0.5）℃黑暗培養(yǎng)3 周后，轉(zhuǎn)至培養(yǎng)室25（±0.5）℃光照培養(yǎng)，光照條件2 000～3 000 μmol/（m2·s），光照時間16 h/d，誘導獲得的愈傷組織。

1.2.3 激素組合 激素組合見表1，其中A、B、C、D 分別代表6-芐氨基腺嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）、萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid，NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D）和脫落酸（abscisic acid,ABA）的濃度，與編號對應的為濃度，如A1 表示6-BA 的濃度為0.1 mg/L，B2 表示NAA 濃度為0.6 mg/L，A1B2 表示在培養(yǎng)基中添加的6-BA 濃度為0.1 mg/L，NAA 濃度為0.6 mg/L。對紫薯葉片、莖段進行愈傷組織誘導時僅使用A、B 激素組合，胚性愈傷組織誘導使用A、C 激素組合，體細胞胚胎誘導使用A、B、D 激素組合。

表1 培養(yǎng)基不同激素處理Table 1 Different hormone treatments in medium（mg/L）

1.2.4 愈傷組織誘導 愈傷組織誘導的基礎培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L、植物凝膠2.6 g/L 及不同濃度的6-BA 和 NAA，調(diào)節(jié)pH 至5.8，高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌15～20 min。將紫薯莖段和葉片外植體，分別接種至誘導培養(yǎng)基，每瓶5 個外植體，3 次重復。在誘導起始階段進行7 d 的黑暗處理，接著轉(zhuǎn)至光照下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25（±0.5）℃，光照強度為1 200 μmol/（m2·s），光照時間16 h/d，培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計并記錄愈傷組織產(chǎn)生情況。

1.2.5 胚性愈傷組織誘導 分化培養(yǎng)基為MS 基礎培養(yǎng)基，添加蔗糖40 g/L、植物凝膠2.6 g/L 及不同濃度的6-BA 和2,4-D，調(diào)節(jié)pH 至5.8，高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌15～20 min。將1.2.4誘導的愈傷組織接種至分化培養(yǎng)基中，每瓶3 塊，培養(yǎng)溫度25（±0.5）℃，光照強度1 200 μmol/（m2·s），光照時間16 h/d，培養(yǎng)60～80 d 后統(tǒng)計并記錄胚性愈傷組織誘導率、出胚率。

1.2.6 體細胞胚胎誘導 體胚誘導培養(yǎng)基為MS基礎培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L、植物凝膠2.6 g/L及不同濃度的6-BA、NAA 和ABA，調(diào)節(jié)pH 至5.8，高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌15～20 min。將1.2.5 誘導獲得的胚性愈傷放置于體胚誘導培養(yǎng)基上進行出胚誘導，繼代2 周后可見產(chǎn)生體胚，每個培養(yǎng)基10 瓶，每瓶3 個愈傷塊，培養(yǎng)溫度28（±0.5）℃，光照強度1 200 μmol/（m2·s），光照時間16 h/d，出胚后統(tǒng)計并記錄出胚率。

1.2.7 體細胞胚植株再生及煉苗移栽 將成熟的體胚轉(zhuǎn)移至MS 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)發(fā)育成正常小植株時，逐漸打開瓶口，7 d 后移栽至基質(zhì)中。

愈傷組織誘導率（%）=長出愈傷的外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100

愈傷組織初始接種質(zhì)量=接種后培養(yǎng)基質(zhì)量－原培養(yǎng)基質(zhì)量

愈傷組織生長量=培養(yǎng)30 d 后愈傷組織質(zhì)量－愈傷組織初始接種質(zhì)量

出胚率（%）=出胚愈傷塊數(shù)/總愈傷塊數(shù)×100

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0 統(tǒng)計分析軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 激素對越南紫薯不同外植體愈傷組織誘導的影響

試驗對越南紫薯嫩葉和莖段同時進行愈傷組織誘導，結果顯示暗培養(yǎng)7 d 后，外植體的切口處均出現(xiàn)愈傷組織，莖段更為明顯，切口處可見黃白色愈傷組織。隨后，愈傷組織繼續(xù)生長，在葉片的四周切口處均出現(xiàn)愈傷組織，莖段外植體兩端形成愈傷組織塊，逐漸呈啞鈴狀（圖1A）。A、B 兩種激素不同濃度組合對葉片和莖段愈傷組織誘導率的影響無顯著差異（表2），兩種外植體愈傷誘導率在所有激素濃度組合均達到100%，且愈傷組織顏色、質(zhì)地和生長狀況均良好，說明6-BA 和NAA 組合有利于紫薯愈傷組織的誘導；但不同濃度和組合愈傷組織生長量存在差異，愈傷組織狀態(tài)也不同，當NAA 濃度相同時，隨著6-BA 濃度的升高，愈傷組織生長量逐漸增高，最佳6-BA 濃度為1.0 mg/L，過高的6-BA 濃度也會抑制愈傷組織生長量；NAA 濃度較低時誘導的愈傷組織呈黃綠色疏松，高濃度誘導的愈傷組織較致密，NAA 濃度為0.2 mg/L、6-BA 濃度為1.0 mg/L 時，誘導效果優(yōu)于較高激素濃度。

表2 不同激素組合對愈傷組織誘導的影響Table 2 Effects of different hormone combinations on callus induction

2.2 激素對越南紫薯胚性愈傷組織誘導的影響

將葉片或莖段誘導的愈傷組織，轉(zhuǎn)接至胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，進行胚性愈傷組織誘導。誘導8 周左右，結果顯示胚性愈傷組織與普通愈傷組織有明顯形態(tài)差異（圖1B）。不同激素配比胚性愈傷組織形成效果差異明顯，由表3 可知，在愈傷組織向胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化過程中，2,4-D起著重要作用，2,4-D 濃度過低過高均不利于胚性愈傷組織的形成，2.0 mg/L 為最佳胚性愈傷組織誘導濃度；不同6-BA 濃度對胚性愈傷出愈率影響不同，其中0.1 mg/L 有利于增加胚性愈傷組織出愈率，較高6-BA 濃度不利于胚性愈傷組織的形成，且濃度越高出愈率降低。

表3 不同激素組合對胚性愈傷組織誘導的影響Table 3 Effects of different hormone combinations on embryogenic callus induction

2.3 激素對越南紫薯體細胞胚誘導的影響

胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移至體細胞胚誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周后，開始體胚分化，逐漸出現(xiàn)綠色的胚（圖1C），隨著時間延長，體細胞胚越來越大，直至發(fā)育成成熟胚（圖1D）。培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計體細胞胚胎個數(shù)，由表4 可知，不同激素組合誘導所得體細胞胚胎有較大的差異，最高為A1B1D3 組合（MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+ABA 0.5 mg/L），綜合分析3 種激素水平體細胞胚胎的獲得及其后續(xù)進一步成長情況可知，當NAA 處于較高水平時，出胚率較低，且隨6-BA 濃度水平提高也呈現(xiàn)出胚率降低的趨勢。

表4 不同激素組合對胚性愈傷體胚化誘導的影響Table 4 Effects of different hormone combinations on embryogenesis of embryogenic callus

2.4 體細胞胚胎誘導成苗及移栽馴化

將不同激素組合培養(yǎng)基誘導獲得的體細胞胚轉(zhuǎn)入MS ＋蔗糖3%的培養(yǎng)基上，使其進一步發(fā)育生長成苗（圖1E、F）。由表4 可知，不同來源體細胞胚胎后續(xù)生長表現(xiàn)有差異，由A1B1D3培養(yǎng)基誘導的體細胞胚的成苗率最高為77.8%，其次為A2B4D2、成苗率61.1%，其余培養(yǎng)基誘導的體細胞胚成苗率均較低，部分未能發(fā)育成植株，且其體細胞胚發(fā)育過程中有白化干枯死亡現(xiàn)象。

3 討論

3.1 不同外植體對愈傷組織形成的影響

不同甘薯品種其愈傷組織形成能力也不同［14-15］，而且外植體不同其形成愈傷組織的難易程度也不同［16-18］。本試驗發(fā)現(xiàn)越南紫薯葉片和莖段在相同激素組合處理下，形成愈傷的能力基本一致，但愈傷生長量略有差異，葉片形成的愈傷量略高，這與周麗艷等［19］的研究結果一致，而且由于葉片易采集數(shù)量多，形成愈傷組織量較高，因此適宜作細胞工程初始培養(yǎng)的外植體。紫薯外植體愈傷組織形成的決定因素是激素組合，如6-BA 的使用量直接影響愈傷生長量，較低和過高的6-BA 濃度均導致愈傷生長量偏低，較低的NAA 濃度有利于增加愈傷組織生長量。越南紫薯誘導愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

3.2 愈傷組織誘導產(chǎn)生胚性愈傷組織

甘薯誘導愈傷組織可以分為非胚性愈傷組織和胚性愈傷組織2 類，一般直接由外植體誘導產(chǎn)生的愈傷組織為非胚性愈傷組織，這種愈傷呈水乳狀，乳白色，結構疏松，且生長旺盛，但不能直接產(chǎn)生體細胞胚胎，從而再生成植株［19-20］。紫薯工廠化種苗生產(chǎn)需要大量體細胞胚胎，這需要通過改變培養(yǎng)條件將非胚性愈傷組織轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝杂鷤M織，從而形成大量體細胞胚胎，培育所需的再生苗。已有研究認為胚性愈傷組織的形成與激素和品種有關［10］，對單一品種而言，主要是激素影響胚性愈傷組織的形成。本試驗發(fā)現(xiàn)越南紫薯胚性愈傷組織的形成起主要作用的是2,4-D，較低或過高的2,4-D 直接影響胚性愈傷組織的形成和數(shù)量，這與楊強強等［21］、崔紅等［22］的結論一致，6-BA 對胚性愈傷組形成有輔助作用，適宜的6-BA 濃度可以使胚性愈傷組織量達到最大。

3.3 胚性愈傷組織誘導產(chǎn)生體細胞胚胎

胚性愈傷組織進一步發(fā)展的方向與培養(yǎng)基的成分和激素有關，只有適宜的培養(yǎng)基和激素濃度才能獲得較多的體細胞胚胎。ABA 對胚性愈傷組織誘導發(fā)育為體細胞胚胎起著重要的作用［23-24］，對刺槐的研究發(fā)現(xiàn)誘導產(chǎn)生胚性愈傷組織后繼續(xù)在高濃度激素下繼代，胚性愈傷組織會持續(xù)脫分化，不能產(chǎn)生體細胞胚胎［25］。本試驗將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移至體細胞胚誘導培養(yǎng)基上，不同繼代培養(yǎng)基表現(xiàn)出不同誘導效果，在低6-BA 和NAA 濃度下，胚胎率誘導與ABA 有關，在0.5 mg/L 濃度體細胞胚胎有較高發(fā)生率；較高的6-BA 和NAA濃度都會導致體細胞胚胎發(fā)生率降低，而高NAA濃度體細胞胚胎發(fā)生率為零。說明在較低濃度6-BA 和NAA 下，培養(yǎng)基再附加一定濃度的ABA有利于紫薯體細胞胚胎發(fā)生，本試驗的最佳組合為MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+ABA 0.5 mg/L。

4 結論

本研究結果表明，越南紫薯葉片和莖兩種外植體接種在普通愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，黑暗處理1 周后轉(zhuǎn)至光照下繼續(xù)培養(yǎng)，葉片具有略高的愈傷組織形成能力，其誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；愈傷組織必須轉(zhuǎn)化為胚性愈傷組織才能進一步發(fā)育形成體細胞胚胎，由愈傷組織到胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化需要高濃度的2,4-D 誘導和低濃度6-BA 輔助，其最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.1 mg/L +2,4-D 2.0 mg/L。胚性愈傷出現(xiàn)后，需要撤掉2,4-D，改用MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+ABA 0.5 mg/L 才能誘導形成體細胞胚胎。在胚性愈傷進一步發(fā)育為體細胞胚胎過程中，低6-BA 和NAA 濃度下誘導胚胎率與ABA有關，體細胞胚胎可在MS ＋蔗糖3%培養(yǎng)基上生長成苗。