蔣 鋒，閆 艷，羅智佳，陳青春，張姿麗，劉鵬飛

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣州市特色作物種質(zhì)資源研究與利用重點實驗室，廣東 廣州 510225）

【研究意義】維生素C 是人體必需的微量物質(zhì)，在人體生命活動方面起著重要作用。維生素C 可以增強人體免疫力、預(yù)防人體動脈硬化、參與人體膠原蛋白合成［1］，對缺乏維生素C 而引起的各種疾病（如壞血病、貧血等）有顯著的治療效果，而且還可以預(yù)防癌癥等重大疾?。?］。同時，維生素C 的攝入可以提高人體對鐵和鋅的吸收利用率，降低這兩種主要微量營養(yǎng)素缺乏的風(fēng)險［3］。在人體內(nèi)，維生素C 有兩個重要功能：一是在多種酶促反應(yīng)中作為輔助因子；二是作為抗氧化劑保護細胞免受ROS的毒害和自由基介導(dǎo)的損傷［4］。而人體無法產(chǎn)生合成維生素C 的酶，要從合成藥物或者食物中獲取日常必需的維生素C［5］。由于人工合成的維生素C 在吸收效果和功效等方面均不及天然維生素C，并且長期服用化學(xué)合成的維生素C 可能會有副作用，消費者對天然維生素C 的需求日益增加［6］。準確定位甜玉米維生素C含量的QTL，找到與之緊密連鎖的分子標記，對挖掘利用高維生素C 含量甜玉米種質(zhì)資源具有重要意義。

【前人研究進展】1998 年，Glen 等［7］揭示了第一條維生素C 合成途徑，此后有科學(xué)家利用該合成途徑通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)對作物進行遺傳修飾，來提高水果和蔬菜中維生素C含量。Zhang等［8］使GME基因（編碼催化L-半乳糖途徑的酶的基因）在番茄中過量表達，使番茄果實和葉片維生素C 的含量增加1.19～1.60 倍；Sean 等［9］使GGP基因（編碼催化L-半乳糖途徑的酶的基因）在番茄、草莓、馬鈴薯中穩(wěn)定過量表達，將果實和塊莖的維生素C 含量增加2～6 倍；Hemavathi 等［10］在馬鈴薯中異位表達來自草莓的Ga1UR基因（D-半乳糖醛酸途徑相關(guān)的基因），使馬鈴薯塊莖的維生素C 含量增加2～3 倍；Jain 等［11］在萵苣中異位表達大鼠-L 古洛內(nèi)酯氧化酶（一種參與動物體內(nèi)維生素C 合成的基因），使萵苣中維生素C 含量增加約7 倍。利用分子標記生成連鎖圖譜對維生素C 含量相關(guān)基因進行QTL 定位，可以檢索到與維生素C 含量相關(guān)的基因組區(qū)域，增加對植物維生素C 含量相關(guān)基因的了解，加速育種進程。番茄是迄今為止維生素C 含量基因定位研究最多的植物，控制番茄維生素C 含量的QTL 已在3 個番茄品種中定位，這些品種來自栽培品種和相關(guān)野生種之間的雜交［12-14］，已確定MDHAR、GME、GLDH和GMP基因與控制9、10 號染色體上維生素C 含量的QTL 之間密切關(guān)聯(lián)［14］。在蘋果中檢測到4 個與果皮和果肉維生素C 含量相關(guān)的QTL，這些QTL 解釋了60%的總變異，單個QTL 貢獻率高達31%［15］。草莓是維生素C 含量最高的作物之一，研究者在栽培草莓群體中檢測到控制約45%總變異的3 個QTL，并在3 個生長季節(jié)評估了穩(wěn)定性，其中2 個QTL 在至少2 年內(nèi)被檢測到，是草莓育種計劃中MAS 的潛在候選QTL［16］。

【本研究切入點】目前，甜玉米維生素C 含量的研究主要集中在生理、保鮮等方面，關(guān)于遺傳分析及分子輔助育種的研究鮮有報道。本試驗以甜玉米自交系T15 和T77 為親本配制雜交組合T15×T77，應(yīng)用 SSR 分子標記技術(shù)，以200 個F2單株作為遺傳作圖群體構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，結(jié)合F2各株的維生素C 含量，應(yīng)用復(fù)合區(qū)間作圖法對甜玉米籽粒維生素C 含量進行QTL 定位?！緮M解決關(guān)鍵問題】對甜玉米維生素C 含量進行QTL 定位，以期為維生素C 含量的精細定位、主效基因克隆和高維C 甜玉米品種育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗使用的親本T77（♀）和T15（♂）為仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院多年選育而成的純合穩(wěn)定的甜玉米自交系，這2 個自交系分別以引進的我國臺灣甜玉米品種華珍和泰國甜玉米品種先甜5 號為基礎(chǔ)材料，經(jīng)8 代自交和鑒定自主選育的甜玉米自交系。

1.2 試驗方法

2019 年3—6 月，在仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院廣州市番禺區(qū)鐘村教學(xué)科研基地，以T15（♂）和T77（♀）為父母本進行雜交；2019 年9—12 月，對兩親本雜交產(chǎn)生的F1單株進行套袋嚴格自交，得到F2群體；2020 年3—6 月，種植2 個親本各20株及來自同一果穗的216 個F2單株，最終選取200 株發(fā)育良好的F2植株進行表型及基因型分析。

1.3 甜玉米籽粒維生素C 含量測定

在甜玉米授粉后22 d 收獲200 個F2果穗，檢測維生素C 含量。將待測鮮果穗脫粒，每個果穗取6 個籽?；旌?，準確稱取組織重量，參考曾憲錄等［17］方法，采用2,6-二氯靛酚滴定法測定維生素C 含量。結(jié)果取3 次重復(fù)的平均值。

1.4 DNA 提取和基因型分析

參照Paterson 等［18］方法，在喇叭口期提取P1、P2、F1以及F2的葉片DNA。在Wang 等［19］玉米SSR 引物中選取800 對高多態(tài)性SSR 引物，并根據(jù)前人玉米連鎖遺傳圖譜設(shè)計引物［20-23］，設(shè)計好引物后交由上海生工生物工程公司合成。參考張姿麗等［24］方法進行PCR 擴增及產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳，鑒定F2各單株的標記基因型。

1.5 連鎖群構(gòu)建和QTL 定位

使用JoinMap3.0 軟件分析標記與標記之間的連鎖關(guān)系，構(gòu)建分子遺傳圖譜［25］。使用Windows QTL Cartographer 2.5（http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm）程序結(jié)合復(fù)合區(qū)間作圖法的檢驗方法，檢測甜玉米維生素C 含量QTL，通過1 000 次隨機抽樣確定LOD 閾值（LOD ＞2.5）。通過以上兩個軟件，結(jié)合測定的F2維生素C 含量數(shù)據(jù)，在構(gòu)建的分子遺傳圖譜上定位甜玉米維生素C 含量QTL，得到LOD 值、加性效應(yīng)值、顯性效應(yīng)值、單個QTL 的表型貢獻率。

1.6 維生素C 含量QTL 命名

QTL 命名按照McCouch 等［26］規(guī)則。按照一定的規(guī)律格式，即QTL+性狀+染色體+QTL 個數(shù)，其中QTL 以小寫“q”開始，采用與檢驗相匹配的英語簡寫來代表對應(yīng)性狀，比如維生素C 含量QTL 以Vc 表示，在染色體后加數(shù)字“1”來表示，如果有不相同的則繼續(xù)用“2”、“3”、“4”等用來區(qū)別在同一染色體上所顯示的多個不同位點QTL。

2 結(jié)果與分析

2.1 F2 群體維生素C 含量的正態(tài)分布檢驗

F2單株的維生素C 含量統(tǒng)計結(jié)果（圖1）顯示，F(xiàn)2群體維生素C 含量的平均值為39.28 mg/100g，變幅為23.59～47.12 mg/100g，標準差為3.79 mg/100g，變異系數(shù)9.64%，峰度為2.25，偏度為-1.10。從變幅和變異系數(shù)來看，F(xiàn)2各單株維生素C 含量沒有較大變異；同時，從峰值、偏度和200 個F2單株維生素C 含量分布來看，維生素C 含量未顯著偏離正態(tài)分布。這與QTL 定位檢測的基本要求一致，因此，可以對這些數(shù)據(jù)進行QTL 檢測。

圖1 F2 群體維生素C 含量分布Fig.1 Distribution of vitamin C content in F2 population

2.2 甜玉米維生素C 含量的標記連鎖圖譜構(gòu)建

根據(jù)大量國內(nèi)外公開發(fā)表的相關(guān)文獻［19-23］，結(jié)合玉米基因組數(shù)據(jù)庫（http://www.maizegdb.org），選用均勻分布于玉米10 對染色體上的800 對SSR引物對兩親本和200 個F2單株進行SSR 標記基因型分析（圖2）。在800 對SSR 引物中篩選出在兩親本T15 和T77 之間有多態(tài)性的引物174 對，進一步進行χ2 測驗，選出169 對符合1∶2∶1 分離比的引物。應(yīng)用Joinmap 3.0 軟件對多態(tài)性位點進行遺傳連鎖關(guān)系分析，得到SSR 標記遺傳連鎖圖譜，包含151 個位點，圖譜長度為1 270 cM，每個標記間的平均間距為8.41 cM（圖3）。

圖2 甜玉米維生素C 含量QTL 峰圖Fig.2 QTL peak map of vitamin C content in sweet corn

圖3 甜玉米SSR 標記連鎖遺傳圖譜及維生素C 含量QTL 分布Fig.3 SSR linkage genetic map and QTL distribution of vitamin C content in sweet corn

2.3 甜玉米維生素C 含量的QTL 定位

通過對甜玉米維生素C 含量基因進行QTL 定位，共檢測到5 個QTL，分別位于第2、第3、第6 染色體，共解釋55.41%的表型變異。其中，第2 染色體檢測到1 個維生素C 含量QTL（qVC-ch.2-1），位于bin2.04～2.05 區(qū)域，標記落 在umc1465～umc1635 之 間，LOD 為9.57，加性效應(yīng)值為2.23，表型貢獻率為17.16%；第3 染色體檢測到2 個維生素C 含量QTL（qVCch.3-1、qVC-ch.3-2），分別位于bin3.00～3.04、bin3.06～3.07 區(qū)域，標記分別落在umc1 746～bnlg1 144、dupssr23～umc1 148 之間，加性效應(yīng)值分別為1.17、1.40，能分別解釋6.64% 和4.15% 的表型變異；第6 染色體檢測到2 個維生素C 含量QTL（qVC-ch.6-1、qVC-ch.6-2），分別位于bin6.05、bin6.05～6.06 區(qū)域，標記分別落在phi129～phi078、phi078～umc2 162 之間，加性效應(yīng)值分別為0.43、1.83，能分別解釋6.59%和20.87%的表型變異（圖2、圖3、表1）。

3 討論

植物QTL 作圖和效應(yīng)估計已成為當前數(shù)量遺傳學(xué)研究的重點之一，其研究方法是通過構(gòu)建合適的作圖群體，根據(jù)分子標記基因型分離與目標性狀的關(guān)系分析，確定QTL 在連鎖群上的位置，并估計其效應(yīng)［27］。前人研究結(jié)果表明，植物維生素C 含量是一個受幾個基因座控制的數(shù)量性狀［12-16］。

目前已有對冬棗、辣椒、大豆芽菜、番茄等維生素C 含量QTL 定位的報道。王中堂［28］在冬棗中定位到與維生素C 相關(guān)的QTL 位點13 個，表型貢獻率為18.1%～27%；謝立波等［29］在辣椒中定位到5 個與維生素C 相關(guān)的QTL，共解釋59.03%的表型變異，同時發(fā)現(xiàn)辣椒中維生素C 的遺傳模型為多基因加性-顯性-上位性；陳俊［30］采用CIM 法在大豆芽菜中定位到4 個維生素C 含量QTL，共解釋25%的表型變異；王彥華［31］檢測到4 個番茄維生素C 含量QTL，共解釋57.25%的表型貢獻率。

關(guān)于甜玉米維生素C 含量的遺傳研究鮮有報道。甜玉米營養(yǎng)價值高，不僅含有蛋白質(zhì)、脂肪酸、氨基酸，還含有硒、鈣、銅、鐵、鋅等微量元素［32］。研究表明，甜玉米的維生素C 含量是普通玉米的2 倍［33］。本研究共檢測到5 個與甜玉米維生素C含量相關(guān)的QTL，其中第2 染色體檢測到1 個相關(guān)QTL（qVC-ch.2-1），位于bin2.04～2.05 區(qū)域之間，可以解釋17.16%的表型變異；第3 染色體檢測到2 個相關(guān)QTL（qVC-ch.3-1、qVC-ch.3-2），分別位于bin3.00～3.04、bin3.06～3.07 區(qū)域，分別解釋6.64%和4.15%的表型變異；第6 染色體檢測到2 個相關(guān)QTL（qVC-ch.6-1、qVC-ch.6-2），分別位于bin6.05、bin6.05～6.06 區(qū)域，可以分別解釋6.59%、20.87%的表型變異。本研究中，甜玉米維生素C 含量相關(guān)的5 個QTL 共同解釋了55.41%的表型變異，其中有2 個QTL（qVC-ch.2-1、qVC-ch.6-2）貢獻率＞10%，為主效QTL，各自解釋17.16%和20.87%的表型變異。在本研究基礎(chǔ)上，可繼續(xù)進行不同年份、不同地點、不同組合、不同世代、不同群體的研究，以盡可能消除環(huán)境及遺傳背景的影響，找出在不同環(huán)境和不同遺傳背景下都存在的主效 QTL。前人研究表明，要檢測到穩(wěn)定的維生素C 含量相關(guān)QTL 位點，可采用不同群體在相同環(huán)境條件下進行QTL 分析，盡量減小環(huán)境條件的誤差，以不同群體定位到的共同QTL 作為最終QTL 位點；也可以采用相同群體在不同環(huán)境條件下進行QTL 分析，以降低群體對定位結(jié)果的影響，以不同環(huán)境條件下的共同QTL 作為最終定位結(jié)果［34］。本研究所得到的5 個QTL所在區(qū)域標記密度不大，LOD 值均＞10，不能確定檢測到的QTL 僅包含1 個效應(yīng)較大的基因還是包含數(shù)個效應(yīng)較小的基因。針對QTL 所在的染色體區(qū)域增加分子標記，可進一步對目標QTL 進行精細定位、克隆主效QTL、聚合有利基因以及分子標記輔助改良，為高維生素C 含量甜玉米育種提供參考依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究以甜玉米自交系T15 和T77 為親本配制雜交組合T15×T77，運用SSR 分子標記技術(shù)，以200 個F2單株作為遺傳作圖群體構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，結(jié)合F2各株的維生素C 含量，應(yīng)用復(fù)合區(qū)間作圖法對甜玉米籽粒維生素C 含量進行QTL 定位，共檢測到5 個與甜玉米維生素C 含量相關(guān)的QTL，累計共解釋了55.41%的表型變異，其中有2 個QTL（qVC-ch.2-1、qVC-ch.6-2）貢獻率＞10%，為主效QTL。