尹遜路，金哲峰，馮敏山，朱立國，于杰，魏戌，展嘉文，高春雨，梁龍，韓濤，孫凱，謝瑞，王寶劍

實驗研究

補腎活血方對椎間盤退行性變大鼠髓核細胞焦亡的影響

尹遜路1，金哲峰1，2，3，馮敏山1，朱立國1，2，3，于杰1，魏戌1，展嘉文1，高春雨1，梁龍4，韓濤1，孫凱1，謝瑞1，王寶劍1

1.中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102；2.北京市中西醫(yī)結(jié)合骨傷研究所，北京 100700；3.中醫(yī)正骨技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100700；4.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031

觀察補腎活血方對椎間盤退行性變（IDD）大鼠髓核細胞焦亡的影響，探討其延緩IDD的機制。采用脊柱動靜力失衡法構(gòu)建IDD大鼠模型。將30只SD大鼠隨機分為對照組、模型組和中藥組，造模3 d后開始給藥，中藥組每日予補腎活血方（5.94 g/kg）灌胃，對照組和模型組予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)14 d。甲苯胺藍染色觀察大鼠髓核細胞數(shù)量、形態(tài)變化，免疫組化染色觀察髓核組織Ⅱ型膠原表達，Western blot檢測大鼠髓核組織半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）、NOD樣受體蛋白3（NLRP3）蛋白表達。甲苯胺藍染色結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組大鼠髓核細胞顯著減少，髓核組織可見明顯炎癥細胞浸潤，有瘢痕組織形成；與模型組比較，中藥組大鼠髓核細胞數(shù)量顯著增加，髓核組織炎性浸潤及瘢痕組織明顯減少。免疫組化結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組大鼠髓核組織Ⅱ型膠原表達顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，中藥組大鼠髓核組織Ⅱ型膠原表達顯著升高（＜0.05）。Western blot結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組大鼠髓核組織Caspase-1、NLRP3蛋白表達明顯升高（＜0.05）；與模型組比較，中藥組大鼠髓核組織Caspase-1、NLRP3蛋白表達明顯降低（＜0.05）。補腎活血方可通過下調(diào)NLRP3及Caspase-1表達、抑制髓核細胞焦亡、促進Ⅱ型膠原表達等途徑發(fā)揮延緩IDD進程的作用。

腰椎間盤突出癥；椎間盤退行性變；髓核細胞；細胞焦亡；大鼠

腰椎間盤突出癥（lumar disc herniation，LDH）是臨床常見病、多發(fā)病[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球70%～90%人一生中至少遭遇1次下腰痛[2]，而其中20%～30%下腰痛患者由LDH所致[3-4]。研究表明，椎間盤退行性變（intervertebral disc degeneration，IDD）是導(dǎo)致LDH的主要病理基礎(chǔ)，而炎癥反應(yīng)在IDD過程中扮演了重要角色[5-6]。細胞焦亡作為一種促炎癥性、細胞程序性死亡的方式，在多種疾病發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[7]。研究顯示，髓核細胞焦亡與IDD密切相關(guān)[8]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補腎活血方可通過抑制炎癥反應(yīng)延緩IDD進程，從而防治LDH[9-10]，但其具體作用機制仍不明確。本研究觀察補腎活血方對IDD大鼠髓核細胞焦亡的影響，探討其延緩IDD的效應(yīng)機制。

1 材料與方法

1.1 動物

6周齡SPF級SD大鼠30只，體質(zhì)量200～250 g，雌雄各半，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號SYXK（京）2018-0022。飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度50%～60%環(huán)境，12 h明暗交替。

1.2 藥物及制備

補腎活血方（杜仲15 g，補骨脂10 g，牛膝10 g，丹參12 g，威靈仙10 g，木瓜9 g），飲片由中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院中草藥房提供。常規(guī)方法煎煮，制成含原藥材0.33 g/mL藥液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

NOD樣受體蛋白3（NLRP3）一抗（英國Abcam，貨號ab214185），半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）一抗（英國Abcam，貨號ab1972），GAPDH抗體（英國Abcam，貨號ab181602）。切片機（德國徠卡儀器有限公司，型號RM2016），顯微鏡（日本奧林巴斯，型號BX51T-PDH-J11），電泳儀（北京六一儀器廠，型號DYCZ-24KS），分光光度計（美國Thermo Scientific，型號NanoDrop 2000），凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，型號Tanon 1600），熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems，型號ABI7500），脊柱運動節(jié)段離體加載和培養(yǎng)裝置（課題組自主研發(fā)，專利號ZL 201420568511.9）。

1.4 分組、造模及給藥

隨機取20只大鼠，采用脊柱動靜力失衡法建立IDD大鼠模型[11]。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（1.0 mL/400 g）麻醉，俯臥于手術(shù)臺，固定四肢，常規(guī)碘伏消毒，鋪無菌手術(shù)巾；以髂嵴平對椎間隙（L6/L7）為中心，取正中縱行切口（約4 cm），依次切開皮膚及皮下組織，銳性分離，暴露棘突、椎板及上下關(guān)節(jié)突，將附著于棘突、椎板及小關(guān)節(jié)的肌肉全部分離，依次切除L5～L7棘上及棘間韌帶、咬除椎體兩側(cè)下關(guān)節(jié)突，造成椎間失穩(wěn)；用無菌生理鹽水沖洗刀口，依次縫合各層組織。20只大鼠造模成功3 d后，隨機分為模型組和中藥組，另10只未造模大鼠為對照組。中藥組予補腎活血方（5.94 g/kg）灌胃，對照組和模型組予等量生理鹽水灌胃，給藥體積3 mL，每日1次，連續(xù)14 d。

1.5 觀察指標

1.5.1 髓核細胞數(shù)量及組織形態(tài)觀察

灌胃14 d后，頸椎脫臼處死大鼠，取L5/L6、L6/L7椎間盤；4%多聚甲醛固定椎間盤24 h；10% EDTA脫鈣7 d；常規(guī)包埋，制作石蠟切片（軸位）；甲苯胺藍染色液染色3 min；PBS沖洗3次，每次3 min；顯微鏡下觀察髓核細胞數(shù)量及髓核組織形態(tài)變化。

1.5.2 髓核組織Ⅱ型膠原表達檢測

取大鼠髓核組織制作石蠟切片，經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)、滅活內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉后，滴加Ⅱ型膠原一抗（1∶100），4 ℃孵育過夜，滴加辣根過氧化物酶標記二抗，室溫孵育1 h，DAB顯色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，Image Pro Plus軟件計算陽性表達的平均光密度（MOD）。

1.5.3 髓核組織半胱氨酸蛋白酶-1、NOD樣受體蛋白3蛋白表達檢測

取大鼠髓核組織，加入適量RIPA裂解液，冰上裂解30 min，3 000 r/min離心20 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度，100 ℃煮沸變性；等量蛋白上樣，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉1 h，加入Caspase-1一抗（1∶500）、NLRP3一抗（1∶400），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜，滴加ECL試劑顯影，采用Quantity One V4.6.2軟件對條帶進行定量分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以±表示，組間比較采用獨立樣本檢驗，多組間比較采用LSD法。＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補腎活血方對模型大鼠髓核細胞數(shù)量及組織形態(tài)的影響

對照組大鼠髓核細胞呈近圓形，排列規(guī)則、整齊，且數(shù)量較多，髓核組織無炎癥細胞浸潤；模型組大鼠髓核組織可見明顯炎癥細胞浸潤，有瘢痕組織形成，髓核細胞呈長梭形且數(shù)量顯著減少；中藥組大鼠髓核組織炎性細胞浸潤及瘢痕組織明顯減少，髓核細胞數(shù)量明顯增加。見圖1。

2.2 補腎活血方對模型大鼠髓核組織Ⅱ型膠原表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠髓核組織Ⅱ型膠原表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；與模型組比較，中藥組大鼠髓核組織Ⅱ型膠原表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。見圖2。

圖1 各組大鼠髓核組織形態(tài)（甲苯胺藍染色，×400）

注：與對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

2.3 補腎活血方對模型大鼠髓核組織半胱氨酸蛋白酶-1、NOD樣受體蛋白3蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠髓核組織Caspase-1、NLRP3蛋白表達明顯升高（＜0.05）；與模型組比較，中藥組大鼠髓核組織Caspase-1、NLRP3蛋白表達明顯降低（＜0.05）。見圖3、圖4。

圖3 各組大鼠髓核組織Caspase-1、NLRP3蛋白免疫印跡圖

注：與對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

3 討論

LDH屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，患者多為老年人。中醫(yī)認為，人至老年，元氣漸衰，腎氣虧虛，脈絡(luò)瘀阻，故常見腎虛血瘀之象?！夺t(yī)學(xué)心悟》曰：“大抵腰痛悉屬腎虛?！薄锻饪谱C治全書》曰：“諸痛皆由氣血瘀滯不通所致?！币虼?，LDH中醫(yī)病機為腎虛血瘀，補腎活血法是其基本治法。補腎活血方是在補腎活血理論指導(dǎo)下，結(jié)合朱立國教授多年臨床經(jīng)驗，由《太平惠民和劑局方》青娥丸精簡化裁而來。該方由杜仲、補骨脂、牛膝、丹參、威靈仙、木瓜組成，具有補腎強腰、活血化瘀功效，是針對LDH腎虛血瘀病機代表方之一。研究表明，IDD是由無菌性炎癥所致慢性退行性變，免疫炎癥反應(yīng)在該過程發(fā)揮重要作用[12-13]。經(jīng)典免疫學(xué)說認為，異常刺激信號使髓核細胞表面受體活化，在白細胞介素前體、腫瘤壞死因子前體等蛋白作用下，啟動細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，遷移至細胞核內(nèi)作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，調(diào)控相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄，促進相關(guān)炎癥因子表達，觸發(fā)炎癥反應(yīng)；炎癥因子誘導(dǎo)髓核細胞損傷的同時，也可通過提高基質(zhì)金屬蛋白酶活性促進細胞外基質(zhì)（Ⅱ型膠原、蛋白多糖等）降解；此外，上述因子誘發(fā)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)也可抑制Ⅱ型膠原等蛋白表達。隨著炎癥反應(yīng)不斷加劇，椎間盤內(nèi)環(huán)境嚴重失衡，最終加劇IDD，引發(fā)LDH[14-15]。

細胞焦亡作為新發(fā)現(xiàn)的細胞程序性死亡的方式，為當前多種免疫代謝性疾病的研究提供了新的思路和視角。細胞焦亡不同于細胞壞死、細胞凋亡，主要表現(xiàn)為壞死樣細胞膜孔形成、細胞腫脹和破裂、細胞核凝結(jié)、細胞內(nèi)容物及白細胞介素（IL）-1β等炎癥因子大量釋放等[7]。經(jīng)典的細胞焦亡途徑是在Caspase-1誘導(dǎo)下完成[16]。病理狀態(tài)下，細胞內(nèi)模式識別受體（PRRs）被激活后，其PYD結(jié)構(gòu)域與凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）同源結(jié)構(gòu)域結(jié)合，募集Caspase-1前體，形成炎癥小體[17]。目前已知在炎癥小體裝配中有確定作用的PRRs主要包括黑色素瘤缺乏因子2（AIM2）、NLRP（如NLRP1、NLRP3、NLRP4）及Pyrin等。其中，NLRP3炎癥小體在多種疾病過程中扮演重要角色。NLRP3炎癥小體的激活包括2個過程：在NF-κB通路作用下促進IL-1β前體及NLRP3炎癥相關(guān)基因表達、成熟（預(yù)處理過程）[18]；在細胞外ATP、活性氧、病原微生物介導(dǎo)下完成炎癥小體組裝和Caspase-1活化（活化過程）[19]。因此，NLRP3/ Caspase-1軸被認為是細胞焦亡發(fā)生的關(guān)鍵。

研究表明，髓核細胞數(shù)量減少及Ⅱ型膠原蛋白表達降低是導(dǎo)致IDD發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)，IDD過程中伴有不同程度髓核細胞焦亡，主要表現(xiàn)為NLRP3及Caspase-1表達水平上調(diào)[20-21]。因此，抑制NLRP3及Caspase-1活化、促進Ⅱ型膠原表達對延緩IDD進程具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠髓核組織Ⅱ型膠原表達顯著降低，Caspase-1、NLRP3蛋白表達升高。補腎活血方干預(yù)后，Caspase-1、NLRP3等炎性蛋白表達顯著降低，Ⅱ型膠原表達明顯升高。因此，我們認為，補腎活血方延緩IDD可能與下調(diào)髓核細胞焦亡水平、抑制炎癥反應(yīng)、促進Ⅱ型膠原表達等有關(guān)。此外，模型組由于發(fā)生髓核細胞焦亡，影響髓核細胞正常生理功能的發(fā)揮（包括Ⅱ型膠原表達），補腎活血方干預(yù)后，髓核細胞數(shù)量增加，形態(tài)正常，進一步驗證了補腎活血方可通過抑制髓核細胞焦亡，發(fā)揮延緩IDD進程的作用。

綜上，本研究從髓核細胞焦亡角度探討了補腎活血方延緩IDD的效應(yīng)機制，證實補腎活血方可通過抑制髓核細胞焦亡關(guān)鍵蛋白NLRP3和Caspase-1表達、促進Ⅱ型膠原表達發(fā)揮延緩IDD的作用，可為防治IDD中藥的研發(fā)提供實驗依據(jù)。

[1] KREINER D S, HWANG S W, EASA J E, et al. An evidence-based clinical guideline for the diagnosis and treatment of lumbar disc herniation with radiculopathy[J]. Spine Journal,2014,14(1)：180-191.

[2] ANDERSSON G B. Epidemiological features of chronic low-back pain[J]. Lancet,1999,354(9178)：581-585.

[3] BODEN S D, DAVIS D O, DINA T S, et al. Abnormal magnetic-resonance scans of the lumbar spine in asymptomatic subjects. A prospective investigation[J]. J Bone Joint Surg Am,1990,72(3)：403-408.

[4] ORIEF T, ORZ Y, ATTIA W, et al. Spontaneous resorption of sequestrated intervertebral disc herniation[J]. World Neurosurg, 2012,77(1)：146-152.

[5] SAMPARA P, BANALA R R, VEMURI S K, et al. Understanding the molecular biology of intervertebral disc degeneration and potential gene therapy strategies for regeneration：a review[J]. Gene Ther,2018,25(2)：67-82.

[6] PENG B, HAO J, HOU S, et al. Possible pathogenesis of painful intervertebral disc degeneration[J]. Spine (Phila Pa 1976),2006, 31(5)：560-566.

[7] 伊宏煜,王濤,谷孫澤棟,等.細胞焦亡與臨床疾病及其相關(guān)信號通路[J].中國免疫學(xué)雜志,2019,35(16)：2038-2042.

[8] CHEN Z H, JIN S H, WANG M Y, et al. Enhanced NLRP3, Caspase-1, and IL-1β levels in degenerate human intervertebral disc and their association with the grades of disc degeneration[J]. Anat Rec (Hoboken),2015,298(4)：720-726.

[9] 朱立國,展嘉文,馮敏山,等.補腎活血方治療椎間盤源性腰痛的臨床觀察[J].世界中醫(yī)藥,2017,12(3)：554-557.

[10] YANG S, LI L, ZHU L, et al. Bu-Shen-Huo-Xue-Fang modulates nucleus pulposus cell proliferation and extracellular matrix remodeling in intervertebral disk degeneration through miR-483 regulation of Wnt pathway[J]. J Cell Biochem,2019,120(12)：19318- 19329.

[11] WANG Y J, SHI Q, LU W W, et al. Cervical intervertebral disc degeneration induced by unbalanced dynamic and static forces：a novel in vivo rat model[J]. Spine (Phila Pa 1976),2006,31(14)：1532-1538.

[12] 王宗亮,劉維鋼,史建剛,等.細胞因子在椎間盤退變中作用的研究進展[J].組織工程與重建外科雜志,2007,3(1)：59-60.

[13]張廣智,武作龍,賀學(xué)崗,等.細胞衰老與椎間盤退變的相關(guān)性研究進展[J].生命科學(xué)研究,2021,25(1)：58-63,94.

[14] YAMAMOTO J, MAENO K, TAKADA T, et al. Fas ligand plays an important role for the production of pro-inflammatory cytokines in intervertebral disc nucleus pulposus cells[J]. J Orthop Res, 2013,31(4)：608-615.

[15] 趙赫,俞興,唐向盛,等.炎性因子IL-1β、TNF-α與椎間盤退變關(guān)系的研究進展[J].中國骨傷,2017,30(9)：866-871.

[16] WANG K, SUN Q, ZHONG X, et al. Structural mechanism for GSDMD targeting by autoprocessed Caspases in pyroptosis[J]. Cell,2020, 180(5)：941-955.

[17] VAND W L, LAMKANFI M. Pyroptosis[J]. Curr Biol,2016,26(13)：R568-R572.

[18] CORDERO M D, WILLOAMS M R, RYFFEL B. AMP-activated protein kinase regulation of the NLRP3 inflammasome during aging[J]. Trends Endocrinol Metab,2018,29(1)：8-17.

[19] TAKANORI K, DANIEL A M. The role of inflammasomes in kidney disease[J]. Nat Rev Nephrol,2019,15(8)：501-520.

[20] HONG J, LI S, MARKOVA D Z, et al. Bromodomain-containing protein 4 inhibition alleviates matrix degradation by enhancing autophagy and suppressing NLRP3 inflammasome activity in NP cells[J]. J Cell Physiol,2020,235(7/8)：5736-5749.

[21] TANG P, ZHU R, JI W P, et al. The NLRP3/Caspase-1/ interleukin-1β axis is active in human lumbar cartilaginous endplate degeneration[J]. Clin Orthop Relat Res,2016,478(8)：1818-1826.

Effects ofPrescription on Pyroptosis of Nucleus Pulposus Cell in Rats with Intervertebral Disc Degeneration

YIN Xunlu1, JIN Zhefeng1,2,3, FENG Minshan1, ZHU Liguo1,2,3, YU Jie1, WEI Xu1, ZHAN Jiawen1, GAO Chunyu1, LIANG Long4, HAN Tao1, SUN Kai1, XIE Rui1, WANG Baojian1

To observe the effects of ofPrescription on pyrolysis of nucleus pulposus cells in rats with intervertebral disc degeneration (IDD); To explore the mechanism of delaying IDD.IDD rats model was established by spine dynamic and static imbalance method. 30 SD rats were randomly divided into control group, model group and TCM group. The intragastric administration was started 3 d after modeling. The TCM group received 5.94 g/kgPrescription for gavage, the control group and model group received the same volume of normal saline for gavage for 14 d. Toluidine blue staining was used to observe number and shape of nucleus pulposus cells, immunohistochemistry was used to observe the expression of type Ⅱ collagen, and Western blot was used to detect the protein expression of Caspase-1 and NLRP3.Toluidine blue staining resultsshowed that, compared with the control group, the number of nucleus pulposus cells in the model group significantly decreased, the inflammatory infiltration and scar tissue in the nucleus pulposus tissue significantly increased. Compared with the model group, the number of nucleus pulposus cells in TCM group significantly increased, the inflammatory infiltration and scar tissue in the nucleus pulposus tissue significantly reduced. The results of immunohistochemistry showed that, compared with the control group, the expression of type Ⅱ collagen in the nucleus pulposus tissue of the model group significantly reduced (<0.05). Compared with the model group, the expression of type Ⅱ collagen in the nucleus pulposus tissueofTCM group significantly increased (<0.05). Western blot results showed that, compared with the control group, the expression of Caspase-1 and NLRP3 proteins in the nucleus pulposus tissue of the model group significantly increased (<0.05). Compared with the model group, the expression of Caspase-1 and NLRP3 proteins in the nucleus pulposus tissue of TCM group significantly reduced (<0.05).Prescription can delay the progress of IDD by down-regulating the expression of Caspase-1 and NLRP3, inhibiting pyrolysis of nucleus pulposus cells, and promoting the expression of type Ⅱ collagen.

lumbar disc herniation; intervertebral disc degeneration; nucleus pulposus cells; pyroptosis; rats

R285.5

A

1005-5304(2021)12-0036-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202106019

國家自然科學(xué)基金面上項目（81774330）；北京市自然科學(xué)基金青年基金（7214297）

金哲峰，E-mail：zhlg95@aliyun.com

（2021-06-01）

（修回日期：2021-06-22；編輯：鄭宏）