李龍妹，廖桂雅，吳萬(wàn)垠

扶正抗癌方通過(guò)M2型巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體途徑抑制95D細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究

李龍妹，廖桂雅，吳萬(wàn)垠

廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510370

觀察經(jīng)扶正抗癌方預(yù)處理的M2型巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)95D細(xì)胞侵襲和遷移的影響，探討其經(jīng)外泌體途徑抑制95D細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。利用佛波酯誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞THP-1為巨噬細(xì)胞（Mφ組），利用重組人白細(xì)胞介素（IL）-4、重組人IL-13誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞極化為M2型巨噬細(xì)胞（Mφ＋I(xiàn)L-4＋I(xiàn)L-13組），Western blot檢測(cè)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）表達(dá)；差速離心法提取外泌體，透射電鏡觀察外泌體形態(tài)，Western blot檢測(cè)外泌體標(biāo)志物溶酶體相關(guān)膜蛋白-3（CD63）和腫瘤易感基因101（TSG101）蛋白表達(dá)；設(shè)置M2型巨噬細(xì)胞外泌體組（M2-exo組）和經(jīng)扶正抗癌方（1.5 mg/mL）預(yù)處理24 h的M2型巨噬細(xì)胞外泌體組（FZKA-M2-exo組），Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)95D細(xì)胞侵襲和遷移能力，RT-qPCR和Western blot分別檢測(cè)E盒結(jié)合鋅指蛋白（ZEB1）、E-鈣黏素（E-cadherin）、N-鈣黏素（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）mRNA和蛋白表達(dá)。與Mφ組比較，Mφ＋I(xiàn)L-4＋I(xiàn)L-13組CD206和TGF-β表達(dá)均顯著升高（＜0.05，＜0.01），iNOS表達(dá)顯著降低（＜0.01）。提取外泌體后，透射電鏡觀察可見(jiàn)膜性微囊泡結(jié)構(gòu)物，且外泌體標(biāo)志物CD63和TSG101蛋白表達(dá)均升高。與M2-exo組比較，F(xiàn)ZKA-M2-exo組穿過(guò)Transwell小室細(xì)胞數(shù)量顯著減少，光密度顯著降低（＜0.01），劃痕24 h后，劃痕寬度明顯增加（＜0.01），ZEB1、N-cadherin和Vimentin mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.01），E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.01）。扶正抗癌方可通過(guò)M2型巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體途徑抑制細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程，進(jìn)而抑制95D細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

扶正抗癌方；細(xì)胞轉(zhuǎn)移；巨噬細(xì)胞；外泌體；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

前期臨床研究表明，扶正抗癌方聯(lián)合吉非替尼可延長(zhǎng)表皮生長(zhǎng)因子受體突變晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間，對(duì)吉非替尼具有增敏、減毒作用[1-2]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，扶正抗癌方聯(lián)合吉非替尼能通過(guò)激活多條通路抑制NSCLC細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡、逆轉(zhuǎn)耐藥等[3-8]。近年研究表明，腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間存在“交叉對(duì)話”[9]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，而通過(guò)外泌體途徑交換信息是腫瘤細(xì)胞與TAMs“對(duì)話”的重要途徑。因此，本研究以高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞95D為研究對(duì)象，通過(guò)誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞THP-1為M2型巨噬細(xì)胞，提取其外泌體作用于95D細(xì)胞，觀察扶正抗癌方通過(guò)巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體途徑對(duì)95D細(xì)胞侵襲和遷移的影響，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株

人外周血單核細(xì)胞THP-1，中科院上海細(xì)胞庫(kù)；高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞95D，上海吉?jiǎng)P基因生物科技有限公司。

1.2 藥物

扶正抗癌方（太子參15 g，白術(shù)15 g，黃芪30 g，麩炒薏苡仁30 g，甘草10 g，山慈菇30 g，白花蛇舌草30 g，龍葵30 g，石見(jiàn)穿30 g，八月札30 g，蛇泡簕30 g，莪術(shù)15 g），飲片由廣東一方制藥公司提供。具體制備過(guò)程參照文獻(xiàn)[7]：加水浸泡煎煮，分離煎液，藥渣繼續(xù)加水煎煮，合并煎液，低溫減壓濃縮，噴霧干燥，制成顆粒，相當(dāng)于含10.33 g原藥材/g顆粒。

1.3 主要試劑與儀器

佛波酯（貨號(hào)S1819-1mg）、結(jié)晶紫染色液（貨號(hào)C0121），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；重組人白細(xì)胞介素（IL）-4（貨號(hào)041814-1）、重組人IL-13（貨號(hào)101723），美國(guó)Peprotech公司；RPMI-1640培養(yǎng)基（貨號(hào)8119305）、胎牛血清（貨號(hào)10270-106）、胰蛋白酶（貨號(hào)25200-072），美國(guó)Gibco公司；溶酶體相關(guān)膜蛋白3（CD63）抗體（貨號(hào)ab68418）、腫瘤易感基因101（TSG101）抗體（貨號(hào)ab125011），英國(guó)Abcam公司。5430R型冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），CP100WX超速冷凍離心機(jī)（日本HITACHI公司），Eon.C型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司），ABI PrismTM7500熒光定量PCR儀（美國(guó)Thermo公司），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），BX53顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 扶正抗癌方藥液制備

取扶正抗癌方顆粒，加入適量RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃水浴使顆粒充分溶解，6 000 r/min離心5 min，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，4 ℃冰箱保存。

2.2 無(wú)外泌體血清制備

將普通胎牛血清4 ℃、100 000×離心90 min，去除沉淀后得到無(wú)外泌體胎牛血清。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)及鑒定

THP-1細(xì)胞用含10%無(wú)外泌體胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。向THP-1細(xì)胞培養(yǎng)基中加入100 ng/mL佛波酯培養(yǎng)48 h，將THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞（Mφ組）；向THP-1細(xì)胞培養(yǎng)基中加入重組人IL-4（40 ng/mL）、重組人IL-13（20 ng/mL）培養(yǎng)48 h，將THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)為M2型巨噬細(xì)胞（Mφ＋I(xiàn)L-4＋I(xiàn)L-13組），以M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）表達(dá)升高、M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）表達(dá)降低，提示M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成功。

2.4 外泌體提取

采用差速離心法提取外泌體：4 ℃、2 000×離心20 min，去除死細(xì)胞；4 ℃、10 000×離心30 min，去除細(xì)胞碎片；4 ℃、100 000×離心70 min，沉淀加入適量PBS重懸，再以100 000×離心70 min，PBS重懸后0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，即得外泌體。

2.5 外泌體鑒定

透射電鏡觀察外泌體形態(tài)：將離心后的外泌體沉淀置于2%多聚甲醛中混懸均勻，取混懸液置于電鏡銅網(wǎng)，干燥后加1%戊二醛固定2 h，0.4%醋酸雙氧鈾染色，透射電鏡觀察外泌體形態(tài)；Western blot檢測(cè)外泌體標(biāo)志物CD63和TSG101表達(dá)。

2.6 細(xì)胞侵襲和遷移能力檢測(cè)

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)95D細(xì)胞侵襲能力：95D細(xì)胞用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，收集細(xì)胞，設(shè)置M2型巨噬細(xì)胞外泌體組（M2-exo組）和經(jīng)扶正抗癌方（1.5 mg/mL）預(yù)處理24 h的M2型巨噬細(xì)胞外泌體組（FZKA-M2-exo組），分別加入含M2-exo和FZKA-M2-exo的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL，加入Transwell小室（提前包被基質(zhì)膠），下室加入500 μL含20%無(wú)外泌體胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h；4%多聚甲醛固定小室背面細(xì)胞，結(jié)晶紫染色后風(fēng)干，正置顯微鏡下觀察；用33%醋酸200 μL洗脫結(jié)晶紫，將洗脫液移至96孔板，多功能酶標(biāo)儀波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定光密度，反映穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)目。

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)95D細(xì)胞遷移能力：用記號(hào)筆在12孔板背面穿過(guò)每孔中點(diǎn)劃?rùn)M線（定位），每孔接種3×105個(gè)95D細(xì)胞；待細(xì)胞長(zhǎng)至鋪滿(mǎn)底面后，吸棄舊培養(yǎng)基，用200 μL槍頭垂直于橫線、穿過(guò)中點(diǎn)劃痕，PBS除去脫落細(xì)胞；分別加入M2-exo和FZKA-M2-exo，置于無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)0、8、24 h后于正置顯微鏡下觀察并拍照；Image J軟件測(cè)量劃痕寬度，評(píng)價(jià)細(xì)胞遷移能力。

2.7 RT-qPCR檢測(cè)E盒結(jié)合鋅指蛋白、E-鈣黏素、N-鈣黏素和波形蛋白mRNA表達(dá)

將M2-exo和FZKA-M2-exo分別加入95D細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，Trizol法提取總RNA；將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 各基因PCR引物序列

基因名稱(chēng)引物序列（5’～3’）產(chǎn)物長(zhǎng)度/bp ZEB1F：GCTGGCAAGACAACGTGAAAG159 R：GCCTCAGGATAAATGACGGC E-cadherinF：CAGGTCTCCTCATGGCTTTGC164 R：CTTCCGAAAAGAAGGCTGTCC N-cadherinF：AGCGCAGTCTTACCGAAGG165 R：TCGCTGCTTTCATACTGAACTTT VimentinF：CGTCCACACGACCTACAG217 R：GGGGGATGAGGAATAGAGGCT GAPDHF：AAGCCTGCCGGTGACTAAC258 R：GCGCCCAATACGACCAAATC

2.8 Western blot檢測(cè)E盒結(jié)合鋅指蛋白、E-鈣黏素、N-鈣黏素和波形蛋白表達(dá)

將M2-exo和FZKA-M2-exo分別加入95D細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度；等量蛋白上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加入ZEB1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和GAPDH一抗（均為1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜；加入二抗（1∶5 000），搖床室溫孵育1 h；滴加ECL發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)成像，采用Image Lab軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 M2型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)

與Mφ組比較，Mφ＋I(xiàn)L-4＋I(xiàn)L-13組M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206和TGF-β表達(dá)顯著升高（＜0.05，＜0.01），M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS表達(dá)顯著降低（＜0.01），表明M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成功。見(jiàn)圖1。

注：與Mφ組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

4.2 M2型巨噬細(xì)胞外泌體提取與鑒定

將外泌體置于透射電鏡下觀察，可見(jiàn)膜性微囊泡結(jié)構(gòu)物（見(jiàn)圖2）。與M2-exo組比較，F(xiàn)ZKA-M2-exo組細(xì)胞外泌體標(biāo)志物TSG101和CD63表達(dá)升高，見(jiàn)圖3。

注：箭頭所示為膜性微囊泡結(jié)構(gòu)

圖3 2組M2型巨噬細(xì)胞外泌體TSG101和CD63蛋白免疫印跡圖

4.3 扶正抗癌方通過(guò)外泌體途徑對(duì)95D細(xì)胞侵襲和遷移的影響

與M2-exo組比較，F(xiàn)ZKA-M2-exo組穿過(guò)Tanswell小室細(xì)胞數(shù)量明顯減少，光密度明顯降低（＜0.01）；劃痕24 h后，劃痕寬度明顯增加（＜0.01）。見(jiàn)圖4～圖6。

4.4 扶正抗癌方通過(guò)外泌體途徑對(duì)95D細(xì)胞E盒結(jié)合鋅指蛋白、E-鈣黏素、N-鈣黏素和波形蛋白mRNA表達(dá)的影響

與M2-exo組比較，F(xiàn)ZKA-M2-exo組95D細(xì)胞ZEB1、N-cadherin和Vimentin mRNA表達(dá)顯著降低（＜0.01），E-cadherin mRNA表達(dá)顯著升高（＜0.01）。見(jiàn)圖7。

4.5 扶正抗癌方通過(guò)外泌體途徑對(duì)95D細(xì)胞E盒結(jié)合鋅指蛋白、E-鈣黏素、N-鈣黏素和波形蛋白表達(dá)的影響

與M2-exo組比較，F(xiàn)ZKA-M2-exo組95D細(xì)胞ZEB1、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.01），E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.01）。見(jiàn)圖8、圖9。

圖4 扶正抗癌方通過(guò)外泌體途徑對(duì)95D細(xì)胞侵襲的影響

圖5 扶正抗癌方通過(guò)外泌體途徑對(duì)95D細(xì)胞遷移的影響

注：與M2-exo組比較，**P＜0.01

注：與M2-exo組比較，**P＜0.01

注：與M2-exo組比較，**P＜0.01

圖9 2組95D細(xì)胞ZEB1、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白免疫印跡圖

5 討論

扶正抗癌方為廣東省名中醫(yī)吳萬(wàn)垠主任運(yùn)用辨證＋辨病結(jié)合的思想總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方，辨證以太子參、黃芪、白術(shù)、甘草、麩炒薏苡仁、莪術(shù)健脾益氣、化濕祛瘀，意在補(bǔ)益后天之本，扶正抗癌；辨病以山慈菇、白花蛇舌草、龍葵、石見(jiàn)穿、八月札、蛇泡簕清熱解毒、祛瘀散結(jié)。全方扶正與祛邪結(jié)合，辨病與辨證結(jié)合，共奏扶正抗癌之功，對(duì)肺癌患者長(zhǎng)期帶瘤生存具有重要價(jià)值。本研究從腫瘤轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)研究入手，揭示扶正抗癌方抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。

腫瘤轉(zhuǎn)移受多因素影響，轉(zhuǎn)移后的腫瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)端組織形成繼發(fā)瘤，使患者病情逐步惡化，是腫瘤難以治愈的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演重要角色。TAMs是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，是由外周血單核細(xì)胞或組織巨噬細(xì)胞循環(huán)至腫瘤部位分化而成，占腫瘤組織的50%以上[10]。TAMs在不同微環(huán)境下可極化為M1型或M2型。退行性腫瘤中，在干擾素-γ、細(xì)菌脂多糖等Th1型細(xì)胞因子調(diào)控下，TAMs傾向于極化為M1型，表面標(biāo)志物CD86高表達(dá)，且可分泌iNOS、腫瘤壞死因子-α等促炎因子，抑制腫瘤細(xì)胞增殖并破壞腫瘤細(xì)胞血管內(nèi)皮，具有抗腫瘤功能[11]。惡性腫瘤中，在IL-4、IL-13等Th2型細(xì)胞因子調(diào)控下，TAMs傾向于極化為M2型，表面標(biāo)志物CD206高表達(dá)，且能分泌IL-10、TGF-β等抑炎因子，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)血管生成，具有促腫瘤功能[9，12]。本研究利用IL-4和IL-13誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CD206和TGF-β表達(dá)顯著升高，iNOS表達(dá)顯著降低，表明成功將THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)為M2型巨噬細(xì)胞。

外泌體是機(jī)體內(nèi)多種細(xì)胞在生理或病理情況下，由細(xì)胞內(nèi)多囊泡體與細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中的膜性微囊泡，直徑約30～150 nm。外泌體膜含有熱休克蛋白、4次跨膜蛋白（如CD63）等蛋白，其膜內(nèi)包裹了microRNA、mRNA、DNA和蛋白質(zhì)（如細(xì)胞骨架蛋白、代謝酶和參與多囊泡體形成的蛋白TSG101）等活性物質(zhì)，是介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的重要分子[13]。以上組成蛋白可作為標(biāo)志物，用于判斷外泌體的存在。本研究采用差速離心法從M2型巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中提取外泌體，透射電鏡觀察可見(jiàn)膜性微囊泡結(jié)構(gòu)，同時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)外泌體標(biāo)志物CD63和TSG101表達(dá)均升高，表明成功提取M2型巨噬細(xì)胞外泌體。

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤來(lái)源的外泌體可誘導(dǎo)TAMs向M2型極化，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[14]；綠茶提取物作用于乳腺癌細(xì)胞后釋放的外泌體可抑制TAMs向M2型極化[15]；TAMs來(lái)源的外泌體可運(yùn)輸miR-223至乳腺癌細(xì)胞，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。本研究分別提取M2-exo和FZKA-M2-exo作用于95D細(xì)胞，Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ZKA-M2-exo能抑制95D細(xì)胞侵襲和遷移，表明扶正抗癌方能通過(guò)外泌體途徑抑制95D細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程，是影響腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的另一個(gè)重要因素。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后，更容易浸入鄰近組織和血管，并通過(guò)血液循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)端組織形成繼發(fā)瘤[17]。EMT相關(guān)標(biāo)志物可分為上皮細(xì)胞標(biāo)志物和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，前者以E-cadherin為代表，后者以N-cadherin和Vimentin為代表。同時(shí)，EMT發(fā)生受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，ZEB1和ZEB2是其中重要一類(lèi)，其可與靶基因的E盒結(jié)合，通過(guò)抑制上皮連接與極性表型基因表達(dá)，促進(jìn)間質(zhì)表型基因表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)EMT發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ZKA-M2-exo可抑制ZEB1、N-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)。

綜上所述，扶正抗癌方可通過(guò)改變M2型巨噬細(xì)胞外泌體特性，抑制95D細(xì)胞EMT進(jìn)程，從而抑制95D細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

[1] 趙越洋,龍順欽,周宇姝,等.扶正抗癌顆粒聯(lián)合吉非替尼治療晚期非小細(xì)胞肺癌隨機(jī)雙盲對(duì)照試驗(yàn)[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2020,40(11)：1310-1314.

[2] YANG X B, WU W Y, LONG S Q, et al. Effect of gefitinib plus Chinese herbal medicine (CHM) in patients with advanced non-small-cell lung cancer：a retrospective case-control study[J]. Complement Ther Med,2014,22(6)：1010-1018.

[3] ZHENG F, WU J J, LI X, et al. Chinese herbal medicine Fuzheng Kang-Ai Decoction inhibited lung cancer cell growth through AMPKα-mediated induction and interplay of IGFBP1 and FOXO3a[J]. Evid Based Complement Alternat Med,2016,2016：5060757.

[4] 李龍妹,楊小兵,吳萬(wàn)垠.扶正抗癌方通過(guò)SAPK/JNK-sp1通路對(duì)H1650細(xì)胞增殖的影響[J].廣東醫(yī)學(xué),2016,37(14)：2069-2072.

[5] LI L M, WANG S M, ZHENG F, et al. Chinese herbal medicine Fuzheng Kang-Ai decoction sensitized the effect of gefitinib on inhibition of human lung ccancer cells through inactivating PI3K/Akt-mediated suppressing of MUC1 expression[J]. J Ethnopharmacol,2016,194：918-929.

[6] WANG S M, PENG Z W, LI W J, et al. Fuzheng Kang-Ai decoction enhances the effect of gefitinib-induced cell apoptosis in lung cancer through mitochondrial pathway[J]. Cancer Cell Int,2020, 20：185-201.

[7] 李龍妹.扶正抗癌方抑制非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移及協(xié)同吉非替尼抑制增殖的機(jī)制研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué),2017.

[8] 李龍妹,吳萬(wàn)垠,楊小兵.扶正抗癌方通過(guò)cMet通路逆轉(zhuǎn)H1650細(xì)胞對(duì)吉非替尼耐藥的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2016,27(10)：2318-2321.

[9] 吳婷,周武雄.腫瘤微環(huán)境中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的研究進(jìn)展[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2016,32(2)：265-267.

[10] PRENEN H, MAZZONE M. Tumor-associated macrophages：a short compendium[J]. Cellular and Molecular Life Sciences,2019,76(8)：1447-1458.

[11] WANG Y , LIN Y X , QIAO S L, et al. Progress in tumor-associated macrophages：from bench to bedside[J]. Advanced Biosystems,2019, 3(2)：e1800232.

[12] ZHENG P, LUO Q, WANG W, et al. Tumor-associated macrophages- derived exosomes promote the migration of gastric cancer cells by transfer of functional apolipoprotein E[J]. Cell Death Dis, 2018,9(4)：434-447.

[13] 孫亮.miR-193b靶向RAB22A基因調(diào)節(jié)外泌體介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué),2018.

[14] DE VRIJ J, MAAS S L N, KWAPPENBERG K C, et al. Glioblastoma-derived extracellular vesicles modify the phenotype of monocytic cells[J]. International Journal of Cancer,2015, 137(7)：1630-1642.

[15] JANG J Y, LEE J K, JEON Y K, et al. Exosome derived from epigallocatechin gallate treated breast cancer cells suppresses tumor growth by inhibiting tumor-associated macrophage infiltration and M2 polarization[J]. BMC Cancer,2013,13：421-432.

[16] YANG M, CHEN J, SU F, et al. Microvesicles secreted by macrophages shuttle invasion-potentiating microRNAs into breast cancer cells[J]. Molecular Cancer,2011,10(1)：117-129.

[17] YE X, WEINBERG R A. Epithelial–mesenchymal plasticity：a central regulator of cancer progression[J]. Trends in Cell Biology,2015,25(11)：675-686.

Study on Mechanism ofDecoction on Inhibiting 95D Cells Metastasis Through M2-type Macrophage-derived Exosomes

LI Longmei, LIAO Guiya, WU Wanyin

To observe the effects of M2-type macrophage-derived exosomes treated withDecoction on the invasion and migration of 95D cells; To discuss the molecular mechanism ofDecoction for inhibiting 95D cells metastasis through exosomes pathway.The phorbol ester was used to induce the peripheral blood mononuclear cells THP-1 into macrophages (Mφ group). Recombinant human interleukin (IL) -4 and recombinant human IL-13 were used to induce the polarization of THP-1 cells into M2-type macrophages (Mφ+IL-4+IL-13 group). The expression of macrophage marker CD206, inductible nitric oxide synthase (iNOS) and transforming growth factor-β (TGF-β) were detected by Western blot. Exosomes were extracted by differential centrifugation, the morphology of exosomes was observed under transmission electron microscope. The proteins expression of exosome markers lysosomal-associated membrane protein 3 (CD63) and tumor susceptibility gene 101 (TSG101) were detected by Western blot. M2-type macrophage-derived exosomes group (M2-exo group) and M2-type macrophage-derived exosomes treated withDecoction (1.5 mg/mL) group (FZKA-M2-exo group) were set up. The invasion and migration of 95D cells were detected by Transwell assay and scratch assay respectively. The mRNAs and proteins expression of Zincfinger ebox binding homeobox 1 (ZEB1), E-cadherin, N-cadherin and Vimentin were detected by RT-qPCR and Western blot, respectively.Compared with the Mφ group, the expression of CD206 and TGF-β in Mφ+IL-4+IL-13 group significantly increased (<0.05,<0.01), and the expression of iNOS significantly decreased (<0.01). Membranous microvesicle structures were observed in exosomes, and the expression of exosome marker CD63 and TSG101 increased. Compared with the M2-exo group, the number of cells passing through Transwell chamber in FZKA-M2-exo group was significantly reduced, and the optical density significantly decreased (<0.01), the scratch width after 24 h was significantly wider (<0.01), and the mRNAs and proteins expression of ZEB1, N-cadherin, and Vimentin significantly decreased (<0.01), while the mRNA and protein expression of E-cadherin significantly increased (<0.01).Decoction can inhibit the process of epithelial mesenchymal transition through the M2-type macrophage-derived exosomes pathway, and then inhibit the metastasis of 95D cells.

Decoction; cell metastasis; macrophage; exosome; epithelial mesenchymal transition

R285.5

A

1005-5304(2021)12-0050-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202104619

國(guó)家自然科學(xué)基金（81803919、81974543）；廣東省自然科學(xué)基金博士啟動(dòng)項(xiàng)目（2018A030310601）

吳萬(wàn)垠，E-mail：wwanyin@126.com

（2021-04-30）

（修回日期：2021-05-19；編輯：鄭宏）