楊 靖，謝 群

（襄陽市中心醫(yī)院整形美容科 湖北 襄陽 441000）

瘢痕疙瘩是皮膚傷口愈合的病理反應(yīng)，其特征是成纖維細胞的異常增殖和膠原的過度沉積，臨床表現(xiàn)為創(chuàng)面邊緣外的持續(xù)性腫瘤樣增生和鄰近組織侵犯。瘢痕疙瘩的復發(fā)率高，許多治療方法包括切除和病灶內(nèi)注射皮質(zhì)類固醇療效不令人滿意。因此，亟需尋找有效治療瘢痕疙瘩的藥物。原花青素是從植物中提取出的生物類黃酮，具有強抗炎和抗氧化作用，最早作為抗肝纖維化的藥物進行研究，但對瘢痕疙瘩的作用研究尚未報道。在纖維化的發(fā)病過程中，靜息狀態(tài)下的造血干細胞在外界因素的刺激下被激活轉(zhuǎn)化為成纖維細胞，并合成和分泌大量的細胞外基質(zhì)成分(Extracellular matrix components，ECM)，導致纖維化。臨床研究表明，纖維化通常伴有血清炎性細胞因子水平升高。此外，越來越多的研究表明，脂多糖激活的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)信號通路在纖維化中起重要作用。TLR4可通過髓樣分化因子88（MyD88）蛋白激活核轉(zhuǎn)錄因子κB（Nuclear factor kappa B，NF-κB）信號通路，誘導炎癥反應(yīng)。而炎癥反應(yīng)可導致細胞增殖增加，使細胞凋亡紊亂，進一步促進纖維化的發(fā)展。因此，本研究檢測原花青素對瘢痕疙瘩成纖維細胞(Keloid fibroblasts，KFs)增殖和遷移的影響，并探討TLR4/MyD88通路在整個過程中的作用，為原花青素治療瘢痕疙瘩提供理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 主要試劑與儀器：原花青素（中國醫(yī)學科學院藥物研究所）；KFs細胞（中國科學院上海細胞庫）；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)液（美國Hyclone公司）；四噻唑藍（MTT）（美國Amresco公司）；（Annexin）V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；白介素-23（Interleukin-23，IL-23）、白介素-17A（Interleukin-17A，IL-17A）和白介素-6（Interleukin-6，IL-6）(南京建成生物工程研究所）；Trizol（美國Invitrogen公司）；mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]；RIPA裂解液（北京索萊寶生物技術(shù)公司）；TLR4、MyD88、NF-κB和β-actin抗體（美國Santa Cruz公司）；辣根過氧化物酶標記的IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；ECL化學發(fā)光液（美國GE公司）；CO細胞培養(yǎng)箱和NanoDrop2000c型蛋白核酸檢測儀（美國Thermo公司）；HBS-1096B酶標儀（南京德鐵實驗設(shè)備有限公司）；Real-time PCR擴增儀（美國ABI公司）；流式細胞儀和垂直電泳儀（美國BIO-RAD公司）。

1.2 細胞的培養(yǎng)和原花青素的半數(shù)抑制濃度的確定：在37℃、5%CO的條件下用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)KFs細胞，當KFs細胞貼壁達到70%左右時進行實驗。將KFs細胞接種于96孔板中（5×10個/孔），待細胞貼壁后用不同濃度的原花青素（0、5、10、20、40、80、160mg/L）干預(yù)KFs細胞干預(yù)20h后加入MTT（20微摩爾/孔），37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心棄上清液，每孔加入200μl二甲基亞砜，振蕩10min，用酶標儀測定吸光度值（OD值），計算細胞增殖率[細胞增殖率=（實驗組OD值-空白孔OD值）/（對照組OD值-空白孔OD值）]，確定原花青素的半數(shù)抑制濃度。

1.3 細胞分組：實驗將96孔（5×10個/孔）已培養(yǎng)好的KFs細胞隨機分為對照組、原花青素低劑量組、原花青素中劑量組和原花青素高劑量組,每組24孔（5×10個/孔）。對照組細胞不進行處理；原花青素低、中、高劑量組分別用終濃度為25、50、100mg/L的原花青素干預(yù)KFs細胞，24h后進行相關(guān)檢測。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率：將KFs細胞接種于6孔板中（1×10個/孔），待細胞貼壁后按1.3干預(yù)KFs細胞24h后收獲細胞，分別加入5μl膜聯(lián)蛋白（Annexin）V-FITC與碘化丙啶，充分混勻后室溫避光孵育20min，應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 細胞劃痕法檢測細胞遷移能力：將KFs細胞接種于6孔板中（1×10個/孔），待細胞貼壁后，使用100μL移液管的尖端刮擦每個培養(yǎng)板中的細胞層，以劃出傷口；將細胞用磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer solution，PBS）沖洗劃痕，參照1.3中所述干預(yù)KFs細胞24h后從每個劃痕傷口中隨機選擇5個視野，用顯微鏡下拍照，用圖像分析儀測量劃痕寬度。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）檢測細胞中IL-23、IL-17A和IL-6水平：將KFs細胞接種于6孔板中（1×10個/孔），待細胞貼壁后參照1.3中所述干預(yù)KFs細胞24h后收獲細胞，加入2ml磷酸鹽緩沖液，用細胞超聲破碎儀處理30s，離心取上清，按試劑盒說明書檢測細胞中IL-23、IL-17A和IL-6水平。

1.7 實時熒光PCR（Real-time fluorescence -PCR，RTPCR）檢測細胞中TLR4、MyD88和NF-κB mRNA表達：將KFs細胞接種于6孔板中（1×10個/孔），待細胞貼壁后按1.3干預(yù)KFs細胞24h后收獲細胞，加入TRIzol進行總RNA提取，根據(jù)mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將總RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說明，用制備20ul反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：93℃預(yù)變性40s；93℃變性10s，62℃退火1min，72℃延伸45s，共循環(huán)50次，最后一個循環(huán)后72℃延長7min，采用2法計算TLR4、MyD88和NF-κB mRNA的相對表達量（以β-actin作為內(nèi)對照）。

1.8 Western Blot法檢測KFs細胞中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表達：將KFs細胞接種于6孔板中（1×10個/孔），待細胞貼壁后按1.3干預(yù)KFs細胞24h后收獲細胞，用PBS洗滌兩次，加入RIPA 裂解液（100μl），裂解2h（4℃）離心取上清，得到總蛋白，采用BIO-RAD濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)SDS-PAGE 膠進行電泳（20微克/孔），切膠、轉(zhuǎn)膜、封膜后將膜與TLR4（1∶200）、MyD88（1∶400）、和NF-κB（1∶500）進行孵育，過夜（4℃），用辣根過氧化物酶標記的IgG（1∶5 000）在室溫下孵育（30min），滴加ECL化學發(fā)光液進行顯色，采集圖像進行分析（以β-actin作為內(nèi)對照）。

2 結(jié)果

2.1 原花青素對KFs細胞增殖的影響：隨著原花青素濃度增加，KFs細胞增殖率降低，與0μmol/L比較，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）。當原花青素濃度為40mg/L時，KFs細胞增殖率為41.53%，當原花青素濃度為80mg/L時，KFs細胞增殖率為30.68%，故選50mg/L作為半數(shù)抑制濃度（見圖1）。

圖1 原花青素對KFs細胞增殖的影響

2.2 原花青素對KFs細胞凋亡和遷移的影響：與對照組比較，其余各組細胞遷移距離降低，細胞凋亡率依次增加，且隨著原花青素劑量增加，各原花青素劑量組細胞凋亡率和遷移距離呈劑量反應(yīng)關(guān)系，差異具有統(tǒng)計學意義（＜0.05）(見表1，見圖2～3)。

表1 原花青素對KFs細胞凋亡和遷移的影響 （）

圖2 原花青素對KFs細胞凋亡的影響

圖3 原花青素對KFs細胞遷移的影響

2.2 原花青素對KFs細胞中IL-23、IL-17A和IL-6水平的影響：與對照組比較，其余各組細胞中IL-23、IL-17A和IL-6水平降低，且隨著原花青素劑量增加，各原花青素劑量組細胞中IL-23、IL-17A和IL-6水平呈劑量反應(yīng)關(guān)系，差異具有統(tǒng)計學意義（＜0.05）(見表2)。

表2 原花青素對KFs細胞中IL-23、IL-17A和IL-6水平的影響（）

2.3 原花青素對KFs細胞中TLR4、MyD88和NF-κB mRNA水平的影響：與對照組比較，其余各組細胞中TLR4、MyD88和NF-κB mRNA水平降低，且隨著原花青素劑量增加，各原花青素劑量組細胞中TLR4、MyD88和NF-κB mRNA水平呈劑量反應(yīng)關(guān)系，差異具有統(tǒng)計學意義（＜0.05）(見表3)。

表3 原花青素對KFs細胞中TLR4、MyD88和NF-κB mRNA水平的影響（）

2.4 原花青素對KFs細胞中TLR4、MyD88和NF-κB 蛋白水平的影響：與陰性對照組比較，其余各組細胞中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白水平降低，且隨著原花青素劑量增加，各原花青素劑量組細胞中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白水平呈劑量反應(yīng)關(guān)系，差異具有統(tǒng)計學意義（＜0.05）(見表4，圖4)。

表4 原花青素對KFs細胞中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白水平影響（）

圖4 原花青素對KFs細胞中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白水平影響

3 討論

創(chuàng)傷組織修復涉及多種病理機制，包括炎癥、組織形成和組織重塑。盡管瘢痕疙瘩是一種良性疾病，但它會侵襲鄰近的正常組織，甚至破壞其正常功能，被認為是良性增生性皮膚腫瘤。KFs細胞在細胞增殖、遷移和侵襲中表現(xiàn)異常，并逃避細胞凋亡，在ECM中不成比例地積聚，是臨床治療瘢痕疙瘩的主要難題。炎癥微環(huán)境是腫瘤相關(guān)炎癥的一個標志。慢性炎癥誘導DNA損傷和突變，導致腫瘤的形成和進展。IL-23是IL-12家族成員，是一種異源二聚體促炎細胞因子，主要由炎性髓細胞產(chǎn)生。IL-23在IL-6和轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）存在的情況下，刺激T細胞分化為Th17細胞，能夠產(chǎn)生另一種促炎細胞因子IL-17A。IL-17A招募中性粒細胞，促進樹突狀細胞成熟，并刺激巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），然后誘導和介導炎癥反應(yīng)。越來越多的研究表明IL-23/IL-17A軸參與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。此外，IL-23/IL-17A軸可減少CD8+細胞在腫瘤中的浸潤，增強調(diào)節(jié)性T細胞的免疫抑制活性。研究表明，瘢痕疙瘩是慢性炎癥長期作用的結(jié)果。原花青素具有抗炎、抗氧化和抑制血管生成等藥理作用，具有廣泛的應(yīng)用前景，但其藥效學基礎(chǔ)尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，原花青素顯著抑制KFs細胞中IL-23、IL-17A和IL-6水平，同時抑制KFs細胞增殖和遷移，誘導細胞凋亡。

TLR4作為一個重要的信號轉(zhuǎn)導受體，在多種類型的人類癌癥中過度表達，如乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌。TLR4通過識別病原體相關(guān)分子模式(Pathogen associated pattern molecules，PAMPs)，如LPS，從而誘導炎癥細胞因子的分泌并激活先天免疫系統(tǒng)，抑制TLR4/MyD88通路激活可減弱TLR4與LPS的結(jié)合，從而下調(diào)下游信使分子和相關(guān)炎癥基因的表達。同時，TLR4/myd88通路的激活促進了腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，原花青素干預(yù)能劑量依賴性地抑制了KFs細胞中TLR4和MyD88的表達，表明原花青素的抗炎作用與TLR4/MyD88通路有關(guān)。

慢性炎癥與纖維化密切相關(guān)。在纖維化患者中發(fā)現(xiàn)LPS水平升高，LPS激活TLR4通路被證明參與了纖維化的發(fā)展。轉(zhuǎn)化生長因子β激活1(Transforming growth factor β-activated kinase 1，TAK1)蛋白是TLR4通路中的關(guān)鍵蛋白，可激活NF-κB信號通路。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB通路一直被認為是一種典型的促炎信號通路，其主要作用在于上調(diào)促炎基因的表達。NF-κB p65和p50亞基組成一個異源二聚體，由LPS等刺激激活通常被定義為典型的NF-κB通路。NF-κB p65/p50異二聚體通常被NF-κB抑制劑（IκBα）隔離在細胞漿中，在LPS刺激下，IκBα被磷酸化和降解，釋放p65/p50異源二聚體轉(zhuǎn)運到細胞核并結(jié)合NF-κB共識位點，激活炎癥反應(yīng)。TLR4/MyD88通路介導NF-κB的激活以及隨后的促炎性細胞因子（包括IL-1β、IL-6和TNF-α）的產(chǎn)生。這些細胞因子刺激髓樣樹突細胞分泌IL-23，從而促進Th17細胞的增殖和分化。IL-23由p19和p40單元組成，而p19的誘導呈TLR依賴性。本研究結(jié)果顯示，TLR4/MyD88通路調(diào)節(jié)KFs細胞中NF-κB表達水平，從而調(diào)控IL-23和IL-17A的表達水平。

綜上所述，原花青素可能通抑制TLR4/MyD88通路的激活，降低KFs細胞中炎癥因子水平，抑制KFs細胞增殖和遷移，同時促進KFs細胞凋亡，為原花青素治療瘢痕疙瘩提供了一種新的策略。但仍需進行體內(nèi)實驗，評價其臨床應(yīng)用治療瘢痕疙瘩的有效性和安全性。