程丹丹，羅 曉，王仕越，羅振暉，袁文鵬

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)/山東省科學(xué)院菏澤分院/山東省生物工程技術(shù)創(chuàng)新中心，山東 菏澤 274000)

牡丹皮為芍藥科植物牡丹(Paeonia suffruticosa)的干燥根皮，具有清熱涼血、活血化瘀等功能[1]。牡丹皮主產(chǎn)于安徽、山東、陜西、河南、四川等地。全國(guó)大部分區(qū)域皆有牡丹的野生資源分布和人工栽培。由于氣候、歷史、人文風(fēng)俗等諸多因素影響，中國(guó)牡丹栽培種群主要分布在黃河流域。中國(guó)牡丹野生資源極為豐富，主要分布在云南橫斷山脈、甘肅烏鼠山、 四川巴山、河南陽(yáng)山、陜西秦嶺山脈、湖北鄂西山地、山西呂梁山脈、臺(tái)灣大雪山和大塔山等[2—3]。然而，由于對(duì)野生資源重視程度不夠以及市場(chǎng)上沒(méi)有明確的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，牡丹皮飲片管理較為混亂，不同產(chǎn)地、不同種植方式的丹皮化學(xué)成分含量有較大差異，從而造成不同來(lái)源的牡丹皮功效有明顯差別，嚴(yán)重影響到在配伍組方、中成藥的配方用量和療效。牡丹皮含有多種化學(xué)成分，發(fā)揮藥效作用的主要有丹皮酚類(lèi)、芍藥苷類(lèi)、總黃酮類(lèi)等。近期研究表明，黃酮類(lèi)具有較強(qiáng)的生物活性[4—6]，為了控制牡丹皮的質(zhì)量，初步以總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究對(duì)牡丹皮總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化并對(duì) 11份來(lái)自不同產(chǎn)地的野生和栽培牡丹皮總黃酮含量進(jìn)行分析，獲得最佳提取工藝，并初步評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地栽培、野生材料中總黃酮含量情況，為牡丹野生物種的保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)，亦為牡丹皮的質(zhì)量控制、臨床應(yīng)用等提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

無(wú)水乙醇(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)、亞硝酸鈉(分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠)、硝酸鋁(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)、氫氧化鈉(分析純，西隴科學(xué)股份有限公司)、石油醚(60～90 ℃，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)、中草藥粉碎機(jī)(FW1777，天津市泰斯特儀器有限公司)、超聲波清洗器(KQ-300B，昆山市超聲儀器有限公司)、分析電子天平(FA2004C，常州萬(wàn)泰天平儀器有限公司)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-S4，江蘇金怡儀器科技有限公司)、循環(huán)水真空泵[SHZ-D(III)，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司]雙光束紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(T2602S，上海佑科儀器儀表有限公司)。

1.2 材料

不同來(lái)源牡丹皮標(biāo)本編號(hào)、產(chǎn)地等信息見(jiàn)表1。

表1 牡丹皮材料來(lái)源Table 1 Sources of moutan cortex materials

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)確定

準(zhǔn)確稱(chēng)量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.0180 g，用60%乙醇溶解并定容至50 mL，搖勻，得到360 μg·mL-1對(duì)照品溶液備用。

分別取對(duì)照品溶液0、2、4、6、8、10 mL于試管內(nèi)，依次加5% NaNO22 mL、10% Al(NO3)32 mL、1 mol·L-1NaOH 20 mL，每種試劑滴加間隔5 min，用60%乙醇溶液稀釋定容，得到不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液。

采用紫外–可見(jiàn)光分光光度法于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)量其吸光度[7]。以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，建立回歸方程 ：A=0.0114C，R2=0.9952

1.3.2 樣品顯色測(cè)定

取待測(cè)樣品2 mL于50 mL容量瓶?jī)?nèi)，按照1.3.1加入顯色劑，用60%乙醇稀釋并定容，搖勻備用。顯色穩(wěn)定后，采用紫外-可見(jiàn)光分光光度法在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。

1.3.3 丹皮中總黃酮提取工藝優(yōu)化

通過(guò)單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面分析法綜合優(yōu)選最佳提取工藝。每份稱(chēng)取3.0 g處理后的牡丹皮粉末，按以下實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行總黃酮的提取，得到提取液。按照1.3.1測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮含量。

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)

考察提取時(shí)間、乙醇濃度、提取溫度、料液比四因素對(duì)總黃酮得率的影響[8]。

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)定乙醇濃度 60%，提取溫度60 ℃，料液比(g/mL)1:30，提取時(shí)間60 min，分別考察不同提取時(shí)間(30、60、90、120 min)、乙醇濃度(20%、40%、60%、80%)、提取溫度(40、50、60、70 ℃)、料液比(1:20、1:30、1:40、1:50)對(duì)總黃酮得率的影響。

1.3.3.2 響應(yīng)面分析法

選取提取時(shí)間(A)、乙醇濃度(B)、提取溫度(C)、液料比(D)4個(gè)因素進(jìn)行Box-behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)[9—11]。對(duì)提取時(shí)間(X1)、乙醇濃度(X2)、提取溫度(X3)、液料比(X4)的響應(yīng)面因素水平編碼見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面水平因素編碼Table 2 Response surface horizontal factor coding

1.4 不同產(chǎn)地牡丹皮總黃酮含量測(cè)定

取11個(gè)來(lái)源的牡丹皮藥材各100 g粉碎后過(guò)4號(hào)篩，置于大燒杯以料液比1:8加入石油醚浸泡過(guò)夜，抽濾，將晾干的藥渣按料液比 1:50(g/mL)加入50%乙醇，64 ℃超聲提取65 min，抽濾，濾液備用。

總黃酮含量測(cè)定：以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用紫外–可見(jiàn)光分光光度法進(jìn)行含量測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

由圖2可知，當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí)，提取液中總黃酮的含量達(dá)到峰值，隨后又下降，表明此時(shí)提取液中總黃酮含量達(dá)到飽和(圖2: A)。當(dāng)乙醇濃度為40%時(shí)，提取液中總黃酮含量最高，表明適宜的乙醇濃度為40%(圖2: B)。當(dāng)提取溫度為60 ℃時(shí)，提取液中總黃酮含量達(dá)峰值，隨后迅速下降，故最佳提取溫度確定為60 ℃(圖2: C)。當(dāng)料液比為1:40時(shí)，提取液中總黃酮含量達(dá)峰值，隨后緩慢下降，表明此料液比下提取的總黃酮含量最高(圖2: D)。

圖2 提取時(shí)間、乙醇濃度、提取溫度和料液比對(duì)總黃酮得率的影響Fig. 2 Effect of extraction time, ethanol concentration, temperature and solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

2.2 響應(yīng)面分析法

2.2.1 響應(yīng)面分析結(jié)果

響應(yīng)面分析法優(yōu)化牡丹皮總黃酮提取的結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of the response surface analysis experiment

2.2.2 模型方程的建立與方差分析

通過(guò) Design-expert 軟件對(duì)表 3數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到提取時(shí)間(X1)、乙醇濃度(X2)、提取溫度(X3)、液料比(X4)4個(gè)因素與總黃酮得率(Y)的二次 多 項(xiàng) 式 回 歸 方 程 ： Y=25.80+0.19X1–0.81X2–0.06X3+2.83X4+0.31X1X2+0.74X1X3+0.23X1X4–0.07X2X3–2.13X2X4+1.11X3X4–1.54X12–2.74X22–1.55X32–2.41X42。該回歸多項(xiàng)式方程的總決定系數(shù)R2=0.9262，表明該二次多項(xiàng)式回歸方程可信度高，方程能較好地預(yù)測(cè)和分析總黃酮得率。

對(duì)上述回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表 4。通過(guò)方差分析，該二次多項(xiàng)式回歸方程模型F值為12.13，P＜0.0001，表明該模型具有統(tǒng)計(jì)顯著性。失擬項(xiàng)P=0.8021＞0.05，不顯著，表明該模型可信度高，能較好地預(yù)測(cè)和分析總黃酮得率。從表4可知，4個(gè)因素對(duì)總黃酮得率的影響順序?yàn)橐毫媳龋疽掖紳舛龋咎崛r(shí)間＞提取溫度。

表4 牡丹皮中總黃酮得率方差分析Table 4 Variance analysis results of total flavonoids yield in cortex moutan

由表5和表6可知，二次多項(xiàng)式模型擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)效果好，可較好地預(yù)測(cè)和分析總黃酮得率。

表5 模型可信度分析Table 5 Reliability analysis of the model

表6 模型置信度分析Table 6 Model confidence analysis

2.2.3 最佳提取工藝參數(shù)預(yù)測(cè)

采用響應(yīng)面法，可得牡丹皮總黃酮的最佳提取工藝為提取溫度63.989 ℃，乙醇濃度50.077%，料液比1:49.080，水浴加熱提取65.195 min。該條件下總黃酮得率預(yù)測(cè)值為27.315 mg·g-1。在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)提取條件進(jìn)行修正：在提取溫度64 ℃下，乙醇濃度50%，料液比為1:50(g/mL)，提取時(shí)間65 min。

2.2.4 最佳提取工藝參數(shù)驗(yàn)證

為了考察優(yōu)化工藝的穩(wěn)定性、可行性，在該工藝條件下，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)3次，總黃酮得率見(jiàn)表7。由表7可知，總黃酮得率平均值為27.540 mg·g-1，與理論預(yù)測(cè)值 27.315 mg·g-1的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.83%，說(shuō)明該工藝穩(wěn)定可行。

表7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Table 7 Validation results

通過(guò)單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面法綜合考察，得出提取總黃酮的最佳方案為料液比為 1:50，乙醇濃度50%，提取溫度64 ℃，超聲時(shí)間65 min。

2.3 不同產(chǎn)地牡丹皮總黃酮含量測(cè)定

由表8可知，11個(gè)不同產(chǎn)地、不同生長(zhǎng)類(lèi)型的牡丹皮總黃酮含量存在較大差異，含量較高的為陜西商洛、陜西略陽(yáng)、河南輝縣的野生牡丹皮，分別為 64.035 mg·g-1、62.632 mg·g-1、51.140 mg·g-1。含量較低的為云南昆明栽培牡丹皮和四川米倉(cāng)山野生牡丹皮，分別為 30.439 mg·g-1、33.859 mg·g-1。

表8 不同來(lái)源牡丹皮總黃酮的含量Table 8 Determination of total flavonoids in moutan cortex from different source

3 討論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面分析法優(yōu)化了牡丹皮總黃酮提取工藝。從單因素分析可見(jiàn)，牡丹皮總黃酮提取得率隨料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間的增加而提高。結(jié)合響應(yīng)面法分析，確定最佳的提取工藝為料液比1:50，乙醇濃度 50%，提取溫度64 ℃，提取時(shí)間65 min。

目前，河南洛陽(yáng)、山東菏澤為觀賞牡丹及種苗主產(chǎn)區(qū)，安徽銅陵和亳州為藥用牡丹主產(chǎn)區(qū)，牡丹栽培技術(shù)逐步提升，栽培范圍也逐漸擴(kuò)大。我國(guó)雖有得天獨(dú)厚的牡丹野生資源，但由于重視不足，使得野生資源未被充分利用。另外，市場(chǎng)上牡丹皮藥材較為混亂，不同來(lái)源的野生或栽培類(lèi)型的牡丹皮藥效比較研究較少。本研究分析11個(gè)不同產(chǎn)區(qū)的野生和栽培牡丹皮總黃酮含量，表明不同來(lái)源的牡丹皮總黃酮含量差別較大，總的來(lái)看，野生牡丹皮總黃酮含量高于栽培牡丹皮藥材；從野生牡丹皮產(chǎn)地分析，陜西等西北地區(qū)的總黃酮含量較高，安徽、云南等地區(qū)的總黃酮含量較低。