王 萌，周鴻緣，桑 銳，葛冰潔，趙 欣，李春亭，張雪梅

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，吉林延吉 133002)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)別名F-2毒素，首先從赤霉病玉米中提取出來，是一種真菌毒素，廣泛存在于霉變的玉米、小麥、燕麥和高粱等谷物及動(dòng)物飼料中。ZEA毒性很強(qiáng)，能造成動(dòng)物急慢性中毒，嚴(yán)重時(shí)毒素會(huì)殘留在動(dòng)物組織中，引起動(dòng)物機(jī)能異常甚至死亡。ZEA的分子質(zhì)量是318 u，熔點(diǎn)高，熱穩(wěn)定性好，高溫不易分解；ZEA在水和CC14中不易溶；易溶于NaOH等堿溶液，以及甲醇等有機(jī)溶劑中。ZEA通過食用被污染的肉類、奶類及污染谷類等動(dòng)植物性食品等途徑進(jìn)入機(jī)體，引起腹瀉、嘔吐、頭暈、乏力、四肢酸痛和中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等中毒癥狀。目前大部分國(guó)家制定了法律法規(guī)以限制谷物、食品和飼料中的ZEN含量，我國(guó)飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料中ZEA的含量要低于500 μg/kg，食品中真菌毒素的限量規(guī)定表明食品中ZEA不能超過60 μg/kg。但是全世界范圍內(nèi)的ZEA污染仍然存在，給動(dòng)物和人類健康造成巨大的危害。在動(dòng)物體內(nèi)，ZEA代謝為玉米赤霉烯醇 (ZEL)，且有α-ZEL和β-ZEL兩種異構(gòu)體，ZEA及其衍生物給人類和動(dòng)物健康造成巨大威脅，表現(xiàn)在影響生長(zhǎng)發(fā)育，破壞生殖系統(tǒng)、肝臟系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)，造成氧化損傷，并引發(fā)腫瘤[1]。目前對(duì)ZEA生殖毒性的研究較多，但對(duì)肝臟毒性研究較少，本文針對(duì)ZEA引發(fā)肝臟損傷的機(jī)制研究進(jìn)行了綜述。

1 ZEA致肝臟損傷

肝臟是機(jī)體內(nèi)主要的代謝解毒中心，極易受到有毒物質(zhì)的侵害。當(dāng)ZEA進(jìn)入機(jī)體被吸收后，肝細(xì)胞最先受到ZEA的影響。有研究表明，ZEA(1 mg/kg)會(huì)導(dǎo)致仔豬肝臟、腎臟的重量顯著增加[2]。Dong M等[3]研究發(fā)現(xiàn)，靜脈注射ZEA的山羊體內(nèi)，肝臟細(xì)胞腫大以及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、腎臟淋巴浸潤(rùn)。姜淑貞等[4]研究發(fā)現(xiàn)，低劑量ZEA使斷奶仔豬血清膽紅素升高，肝細(xì)胞腫脹，顆粒變性、肝細(xì)胞膜上可見自噬體和中性粒細(xì)胞，表明ZEA導(dǎo)致肝臟功能嚴(yán)重?fù)p害。梁梓森等[5]研究也發(fā)現(xiàn)，感染的ZEA小鼠肝臟HE染色后可見肝細(xì)胞脂肪變性、局灶性壞死，表明ZEA能引發(fā)肝組織退化，造成肝損傷、肝功能紊亂。Gao X等[6]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠ZEA染毒組出現(xiàn)肝小葉壞死，肝細(xì)胞變性和腫脹，同時(shí)肝臟氧化指標(biāo)谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、總抗氧化能力(T-AOC)降低，MDA升高，表明ZEA誘導(dǎo)了肝損傷。Abbès S等[7]研究表明，在日糧中添加ZEA(40 mg/kg)的小鼠肝臟中觀察到的肝局灶性壞死，顆粒變性，腎小管上皮腫脹等；口服ZEA的家兔血清中檢測(cè)到天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、L-γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶(GGT)和乳酸脫氫酶(LD)活性顯著增加，這表明ZEA的慢性作用可能會(huì)引起肝臟毒性。同時(shí)，ZEA會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞中DNA及白蛋白含量下降，表明ZEA對(duì)大鼠肝細(xì)胞有損害作用[8-9]。

2 ZEA致肝損傷的機(jī)制

2.1 ZEA引起氧化應(yīng)激損傷

Nrf2是細(xì)胞中與氧化應(yīng)激有關(guān)的基本成分，為細(xì)胞抗氧化損傷的關(guān)鍵因子[4]。在氧化應(yīng)激期間，Nrf2可以誘導(dǎo)各種保護(hù)蛋白如HO-1和NQO1的表達(dá)。一般情況下，Nrf2與其抑制蛋白Keap1以二聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，蛋白表達(dá)量處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)受到外界氧化應(yīng)激因子等刺激后，ROS升高，Nrf2與Keap1解離，增強(qiáng)了Nrf2的穩(wěn)定性并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與小Maf等蛋白形成二聚體，活化的Nrf2與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，從而啟動(dòng)下游抗氧化基因HO-1、NQO-1等的表達(dá)，并發(fā)揮抗氧化活性(圖1)。因此，Nrf2信號(hào)通路的激活在機(jī)體抵御外源性或內(nèi)源性氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用[10]。其中，HO-1廣泛參與組織細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激損傷，是機(jī)體最重要的內(nèi)源性保護(hù)系統(tǒng)之一[11]。NQO-1是一種誘導(dǎo)還原酶，也是機(jī)體抵抗ROS的關(guān)鍵酶。有報(bào)道通過免疫組化方法成功檢測(cè)了糖尿病大鼠腎臟組織中HO-1、NQO-1和Nrf2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HO-1和Nrf2水平顯著升高[10]。有研究檢測(cè)了HepG2細(xì)胞中HO-1、NQO-1和Nrf2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ZEA能劑量依賴性下調(diào)Nrf2、HO-1和NQO1的表達(dá)[12]，表明ZEA誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激。正常肝細(xì)胞(L02)染毒24 h后，低劑量組(5 μg/mL)ZEA能夠顯著提高細(xì)胞內(nèi)Keap1蛋白的表達(dá)，降低HO-1和NQO1蛋白表達(dá)，表明ZEA通過抑制抗氧化通路Nrf2-Keap1/ARE通路中部分基因的表達(dá)造成細(xì)胞氧化性損傷[13-14]。

圖1 ZEA通過氧化應(yīng)激致肝損傷的機(jī)制

氧化應(yīng)激是細(xì)胞和組織氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的失衡，是氧化自由基和相關(guān)活性氧(ROS)過量產(chǎn)生的結(jié)果[15]。ROS是由磷酸肌酸3-激酶(PI3K)/Akt通路誘導(dǎo)產(chǎn)生的，該通路可以觸發(fā)各種細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，ZEA可以下調(diào)pPI3K/pAkt激活，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激[12]。PI3K/AKT信號(hào)通路是一條與增殖、分化和凋亡相關(guān)的信號(hào)通路。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110構(gòu)成的二聚體，分為IA和IB兩個(gè)亞型，它們分別可以接收來自酪氨酸激酶連接受體和G蛋白偶聯(lián)受體傳遞的信號(hào)，能夠發(fā)揮類脂激酶和蛋白激酶的雙重活性。AKT也叫做PKB，是PI3K的下游分子，包括AKT1、AKT2和AKT3等至少3種存在形式，在調(diào)控各種細(xì)胞生長(zhǎng)代謝、增殖分化、轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)合成方面發(fā)揮重要作用。PI3K與生長(zhǎng)因子受體(如EGFR)結(jié)合后，可改變Akt的蛋白結(jié)構(gòu)并使其活化，并以磷酸化作用激活或抑制下游一系列底物如凋亡相關(guān)蛋白Bax、caspase-9活性，從而調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡[12]。氧化應(yīng)激與PI3K/AKT信號(hào)通路密切相關(guān)[16]。大量研究表明，PI3K/Akt等多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制使Nrf2游離于Keap1，并促進(jìn)隨后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)抗氧化酶的激活[17-18]，也表明持續(xù)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致PI3K/Akt信號(hào)的下調(diào)[19-21]。因此，調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路可能是一種很有前景的預(yù)防ROS誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的策略。

2.2 ZEA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，是細(xì)胞受損后應(yīng)對(duì)機(jī)體損傷做出的一種主動(dòng)的生理過程。凋亡受多基因嚴(yán)格控制，這些基因包括Bcl-2家族、caspase家族、抑癌基因p53等。凋亡是維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的過程，能夠提高免疫力，適應(yīng)不良環(huán)境。正常凋亡不會(huì)引發(fā)炎癥，但一旦凋亡過度就會(huì)引起炎癥反應(yīng)。ZEA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路有很多，但主要誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的是線粒體凋亡信號(hào)通路(圖2)。

圖2 ZEA通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡致肝損傷的機(jī)制

線粒體引發(fā)的內(nèi)在途徑參與了ZEA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。研究發(fā)現(xiàn)，ZEA作用細(xì)胞后可使細(xì)胞膜通透性增加并增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，造成ROS累積引發(fā)細(xì)胞DNA損傷，最終誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞出現(xiàn)凋亡[22]。caspase-3、Bax、Bcl-2、p53參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡過程。其中，caspase-3被稱為細(xì)胞凋亡的生化標(biāo)志，被激活后能降解細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。而Bax可與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放，具有凋亡作用。Bcl-2是進(jìn)化相關(guān)蛋白家族。這些蛋白質(zhì)控制線粒體外膜透性(MOMP)，Bcl-2家族分為兩類，一類是抗凋亡的主要有Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w和Mcl-1，一類是促進(jìn)凋亡的主要包括Bax、Bak和Bok等。Bcl-2可阻止凋亡形成因子如細(xì)胞色素C等從線粒體釋放出來，具有抗凋亡作用。p53是人體腫瘤抑制基因，由p53基因編碼的蛋白質(zhì)調(diào)控細(xì)胞周期的啟動(dòng)，p53介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在調(diào)節(jié)細(xì)胞正常生命活動(dòng)中起重要作用。并且p53可以上調(diào)Bax的表達(dá)水平，以及下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[23]。研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠肝細(xì)胞中用ZEA處理后，胞漿中的細(xì)胞色素C增加，并且caspase-9和caspase-3被激活。經(jīng)ZEA處理的肝組織中pPI3K、pAkt、Nrf2和Bcl-2蛋白質(zhì)含量下降，這表明ZEA通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡[11]。同時(shí)，ZEA顯著抑制Bcl-2表達(dá)，并隨后提高了裂解caspase-3、caspase-9和PARP的凋亡標(biāo)記蛋白的水平，進(jìn)一步導(dǎo)致蛋白酶級(jí)聯(lián)切割放大，最終使細(xì)胞死亡[24]。另有相關(guān)研究表明，通過p53線粒體信號(hào)通路，ZEA會(huì)增加促凋亡因子/抗凋亡因子比值來誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中GSH和MMP水平下降[25]，表明ZEA通過將細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中的線粒體途徑和caspase-3與caspase-9介導(dǎo)的線粒體通路導(dǎo)致肝臟凋亡壞死。

2.3 ZEA與細(xì)胞自噬

在正常的生理?xiàng)l件下，細(xì)胞可以保持非常低的自噬水平。但當(dāng)細(xì)胞受到各種應(yīng)激條件，如營(yíng)養(yǎng)缺失、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激時(shí)，為了生存，會(huì)自動(dòng)觸發(fā)自噬。自噬可以通過幾種相互連接的信號(hào)通路觸發(fā)，包括MAPK家族、PI3K-AKT-mTOR和ADP/ATP-AMPK信號(hào)通路(圖3)。有研究表明，ERK和PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路參與了ZEA誘導(dǎo)的自噬過程。ERK信號(hào)通路通過抑制mTOR的磷酸化觸發(fā)TM4細(xì)胞的自噬[26,27]。Wang Y等[28]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠Leydig細(xì)胞暴露于ZEA后，上調(diào)了LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)，表明ZEA誘導(dǎo)產(chǎn)生自噬。馮楠楠等[29]研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的ZEA可以通過PI3K/Akt/m TOR信號(hào)通路誘導(dǎo)睪丸支持細(xì)胞發(fā)生自噬。王雪[30]研究發(fā)現(xiàn)，ZEA可以上調(diào)大鼠胰島β細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)自噬。目前，關(guān)于ZEA引起肝細(xì)胞自噬的機(jī)制研究尚不全面，因此研究ZEA的自噬機(jī)制仍有很大的空間。

圖3 ZEA誘導(dǎo)細(xì)胞自噬致肝損傷的機(jī)制

2.4 ZEA引發(fā)炎癥

有研究發(fā)現(xiàn)，ZEA感染的小鼠肝臟中IL-6、TNF-α和IL-1β的水平明顯升高，肝臟存在廣泛的炎癥灶，嚴(yán)重壞死，間質(zhì)性水腫以及失去完整性，還發(fā)現(xiàn)了雙核肝細(xì)胞、正弦空間的血腫、正弦和中央靜脈的充血，以及肝細(xì)胞死亡[12]，表明ZEA與炎癥相關(guān)。ZEA感染的豬肝臟中促炎因子TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1β和IFN-γ的含量升高，抗炎因子IL-4的含量降低，IL-10含量無明顯變化，表明ZEA可以導(dǎo)致肝臟產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[31]。MMP是參與與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān)的炎癥過程的重要分子，Pistol等研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2和MMP-9的含量，在喂食ZEA污染飲食的仔豬肝臟中有所下降，表明ZEA與炎癥相關(guān)。

3 展望

玉米赤霉烯酮產(chǎn)自于發(fā)生霉變的玉米、小麥等谷物中，毒性強(qiáng)，不易代謝，耐熱性強(qiáng)，高溫也不容易破壞，ZEA在飼料中的污染十分嚴(yán)重，飼料污染后可對(duì)畜牧場(chǎng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和安全隱患，而且目前還沒有安全有效環(huán)保的藥物能夠解決這一問題。因此，研究ZEA誘導(dǎo)肝損傷的具體機(jī)制有著極其重要的意義。目前對(duì)ZEA的研究大多集中在生殖系統(tǒng)方面，而對(duì)肝臟毒性的研究較少，個(gè)別研究集中在病理學(xué)方面。對(duì)肝臟的氧化應(yīng)激與凋亡及其相關(guān)信號(hào)通路研究較少，本文就ZEA的氧化應(yīng)激、凋亡自噬、炎癥方面做了綜述，旨在為探索綠色安全有效的藥物提供理論基礎(chǔ)，以期應(yīng)用到ZEA中毒的臨床防治中，以保證動(dòng)物及人類的健康?？梢灶A(yù)見的是，今后有關(guān)ZEA及其衍生物的綜合毒性的相關(guān)研究將成為趨勢(shì)。